Name: 体外研究 用于靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子的选择 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解工程化转录抑制因子体外筛选方法，用于实现高效稳定的表观遗传沉默。本方案利用CRISPR/Cas9技术筛选低脱靶效应的ETR候选分子，为基因治疗应用提供可靠的技术基础。

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作者谨此感谢Angelo Amabile、Paola Capasso、Ilaria Caserta、Tania Baccega、Alice Reschigna、Valeria Mollica和Deborah Cipria多年来在开发表观遗传沉默技术过程中所付出的协作努力；感谢Dejan Lazarevic和Francesca Giannese对本方案中所述RNA-seq和MeDIP-seq分析的审阅。本研究工作获得了A.L.所获Telethon基金会（TIGET项目编号F1）和欧盟“地平线2020”计划（UPGRADE项目）资助的支持。插图使用BioRender.com制作。
作者贡献 
A.M、M.A.C.、F.G. 和 A.C. 参与了实验方案的设计及论文撰写；S.V.、I.M. 和 D.C. 设计了方案中的生物信息学部分并修订了论文；A.M. 和 A.L. 设计了实验方案，并在所有作者的共同参与下构思和撰写了论文。

AL 是 Chroma Medicine, Inc. 的联合创始人、持股人及顾问。

靶向表观遗传沉默可能为治疗需要永久性基因失活的疾病提供一种有前景的解决方案，这些疾病包括由功能获得性突变引起的疾病1、感染性疾病2，以及沉默某一基因可补偿另一基因遗传缺陷3&#160;或充分释放过继细胞治疗潜力的病理状态4,5。通过在染色质水平发挥作用并由细胞自身进行自我传播7,30,32，表观遗传沉默可避免靶基因DNA序列发生毒性改变（例如染色体重排），以及人工核酸酶介导的基因破坏技术所存在的靶标部分且短暂沉默的问题8,34,35&#160;，同时也克服了RNA干扰介导的基因敲低技术的相应局限33。
在任何表观遗传沉默实验方案中，一个关键的初步步骤是确定靶基因上的合适位置，以引导表观遗传编辑器（ETR）在该位点沉积抑制性表观遗传修饰，从而关闭靶基因的转录活性。不同的转录起始位点近端和远端调控元件可能共同参与调控特定人类基因的转录输出54。此外，得益于可编程DNA结合技术的不断发展，现在可以针对特定调控元件识别出多个不同的靶向位点6。因此，在进入最终治疗相关场景中耗时且繁琐的候选位点评估之前，可利用本文所述这类在基因工程细胞系中开展的实验方案，预先筛选出适合ETR介导表观遗传沉默的单个靶位点或基因组区域。以下将进一步描述该实验方案中的一些关键环节。
构建可预测最终治疗靶点的报告细胞系 
尽管细胞工程技术流程已持续优化——此处需将编码荧光报告基因的表达盒插入靶基因，并递送人工转录抑制因子（ETR）——但不能默认适用于最接近最终治疗靶点的细胞系的工程化方案已现成可用。在此情况下，可采用不同的应对策略：a) 利用供应商提供的优化试剂盒，在本实验室中针对目标细胞系优化转染方案；b) 转而使用其他表达该靶基因但来源于非最终治疗靶点组织的细胞系，这些细胞系的工程化流程已有充分优化。若上述选项均不可行，可考虑采用代表最终靶点的原代细胞或类器官。对于基于ETR的表观遗传沉默在临床前研究和治疗应用中的普遍情况，应排除靶基因对目标细胞类型具有必需功能的情形。ETR介导的必需基因完全且长期的沉默将导致靶细胞随时间推移被负向筛选（并可能引发治疗毒性）。在此类情况下，更宜采用可实现部分靶点抑制的替代技术，例如RNA干扰（RNAi）33。
评估ETR的靶向基因沉默活性 
基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L效应结构域组合的ETR已被证明对大多数蛋白编码基因有效，其容许的靶向窗口较宽，长度约为1千碱基，以转录起始位点为中心32。为了展示一次成功的表观遗传沉默实验应有的结果，本文提供了在K-562细胞中沉默B2M基因的技术细节与实验结果。该实验可作为重要的阳性对照，不仅适用于使用K-562细胞的研究人员，也适用于首次采用ETR技术的研究者。如实验方案所述，建议采用人工核酸酶（例如CRISPR/Cas9）介导的基因敲除作为额外对照，以评估目的细胞类型中基因递送的效率以及靶基因缺失细胞的表型。在初步筛选与CRISPR/dCas9系统偶联的gRNA后，若所测试的gRNA均无法实现对靶基因的长期沉默，则应依次考虑以下策略：1）增加递送的gRNA和ETR的量；2）测试表现最佳的gRNA组合，以探索其间的协同效应。若仍无法实现长期沉默，则应进一步考虑：3）测试其他gRNA，可能靶向更有利于诱导表观遗传沉默的位点；4）改用ZFP8或TALE9为基础的DNA结合结构域（DBD）平台，其对靶染色质的结合能力可能更强；5）从瞬时表达转为稳定表达，例如采用整合型病毒载体表达ETR（在使用CRISPR/dCas9技术时，可分别或同时稳定表达gRNA或dCas9融合结构）。由于本研究团队开发并长期使用三种独立ETR的共递送策略30，本文所述方案及结果均基于该方法。然而，类似的概念性工作流程也可能适用于一体化的CRISPR系统32。
ETR脱靶活性的评估 
多项研究已显示出初步结果 体外 基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L效应结构域组合的ETR特异性的相关证据30,31,32然而，如果在测试的gRNAs中，没有任何一个在转录调控和/或特异性谱型方面表现出满意的结果， 从头 DNA甲基化，可采取两种并非相互排斥的策略：a）通过降低ETR的剂量或测试替代性递送系统，减少ETR在细胞内的停留时间（从而降低其潜在的脱靶活性）。例如，与质粒相比，mRNA和蛋白质递送均有望缩短细胞暴露于ETR的时间，进而降低脱靶活性的可能性55；b）更换为经过优化以减少平台脱靶结合的较新Cas9变体56，或替代性ZFP8- 或 TALE9基于DNA结合的技术。需要注意的是，与模拟处理的样本相比，基因沉默的靶向和脱靶效应不仅受到DNA结合域（DBD）与其靶序列结合的影响，还可能受到表观遗传效应结构域通过其天然内源性共因子被招募至其他基因位点的能力的影响。因此，缩短ETR在靶细胞中的滞留时间，可能不仅降低DBD与脱靶位点结合的可能性，也减少ETR与内源性共因子相互作用的机会，从而在特异性方面具有潜在优势，但在靶向活性方面可能存在不利影响。最后，与模拟处理的样本相比，在沉默细胞中检测到的部分转录变化以及可能性更小的CpG甲基化改变，可能仅仅是由于靶基因缺失所致。这些不应被视为沉默技术的脱靶效应。为识别此类变化，实验设计中还应包括使用人工核酸酶进行基因破坏的对照组。8,9,10由于目标基因功能丧失所导致的生物学改变将在表观遗传沉默与该替代技术之间共享。

基因失活传统上在细胞和动物模型中研究基因功能方面发挥着关键作用。此外，在过去二十年中，随着基因治疗的发展，基因失活被认为是一种具有变革潜力的策略，可用于治疗由功能获得性突变1、感染性疾病2或某些病理状态引起的疾病，其中沉默一个基因可能补偿另一个基因的遗传缺陷3。最后，有研究提出，通过遗传学手段失活细胞适应性和功能调控中的关键因子，可提高用于癌症免疫治疗4&#160;和再生医学5的细胞产品的效率。
在实现基因失活的各种技术中，最有前景的技术之一是靶向性表观遗传沉默6,7。该技术的核心是所谓的工程化转录抑制子（ETRs），其为嵌合蛋白，由可编程的DNA结合结构域（DBD）和具有表观遗传抑制功能的效应结构域（ED）组成。锌指蛋白（ZFPs）8、转录激活因子样效应子（TALEs）9或基于CRISPR/dCas910的DBD均可被设计用于将ED特异性锚定至待沉默靶基因的启动子/增强子序列。一旦定位成功，ETR的ED即通过施加诱导异染色质的抑制性表观遗传标记来发挥其沉默功能，这些标记包括组蛋白修饰（如H3K911,12&#160;或H3K2713&#160;甲基化、H3或H4去乙酰化14）以及CpG DNA甲基化15，具体修饰类型取决于所使用的抑制结构域。
特别是受到植入前胚胎中内源性逆转录病毒发生永久性转录抑制的分子过程的启发16，已开发出三种ETR的组合，以利用以下效应结构域（EDs）：i）人ZNF10的KRAB结构域；ii）人DNMT3A的催化结构域；iii）人DNMT3L&#776;人ZNF10的ppel相关盒（KRAB）结构域；ii）人DNMT3A的催化结构域 从头 DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）；以及iii）全长的人源DNA甲基转移酶3类似物（DNMT3L）。KRAB是高等脊椎动物中多种锌指蛋白（ZFPs）共有的保守抑制结构域17,18，其沉默活性主要基于其招募KAP1的能力19一种支架蛋白，随后与多种其他异染色质诱导因子相互作用20-包含核小体重塑和去乙酰化（NuRD）复合物21，组蛋白H3K9甲基转移酶SETDB122以及H3K9甲基化识别蛋白HP123,24，以及其他。
DNMT3A 能够在 DNA 的 CpG 序列上主动转移甲基基团25。DNMT3A 的催化活性在其与 DNMT3L 发生物理结合后得以增强；DNMT3L 是 DNMT3A 在胚胎细胞和生殖细胞中特异性表达的同源蛋白，缺乏负责甲基转移的催化结构域26，27。位于哺乳动物基因启动子/增强子元件内的富含 CpG 的区域——即 CpG 岛（CGIs）——其 DNA 甲基化通常与转录沉默相关28。重要的是，一旦建立，CpG 甲基化可通过 UHRF1-DNMT1 分子复合物在有丝分裂过程中稳定地遗传29。
在靶细胞中稳定过表达ETR可能存在问题，原因可能是随着时间推移，脱靶活性的风险增加，以及内源性相互作用分子从其生理靶位点被异常竞争（squelching）的可能性升高。然而，单个ETR组分的瞬时表达可能无法高效诱导长期的基因沉默30，限制了其在治疗中的应用。因此，该领域的一项开创性突破在于，基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L的三种ETR联用可产生协同效应，即使仅短暂共递送，也能在靶基因启动子序列上诱导H3K9修饰和CpG甲基化。这些表观遗传标记可在细胞有丝分裂过程中被识别并持续传递，从而在多种人源和小鼠细胞系中实现可遗传的基因沉默，以及 体外 培养的原代细胞30.
值得注意的是，通过靶向（例如，在沉默位点招募基于CRISPR/dCas9的TET1 DNA去甲基化酶）或药物学方法（给予DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza）诱导DNA去甲基化，可按需逆转ETR介导的表观遗传沉默。30，可在发生与ETR相关的不良事件时作为潜在的解毒剂。此外，还描述了一体化的ETR，其包含基于KRAB、DNMT3A和DNMT3L的三个效应结构域（EDs），在细胞系中表现出显著的沉默效率31,32 针对绝大多数蛋白质编码基因。此外，多项采用工程化转录抑制因子（ETRs）的研究报道了其具有较高的安全性，在脱靶活性方面未见显著异常 从头 CpG甲基化或染色质可及性的改变30,31,32然而，在临床应用之前，建议对配备新设计的DNA结合域（DBD）的工程化转录抑制因子（ETR）进行专门的特异性谱型分析。
从临床角度来看，靶向性表观遗传沉默相较于基于RNA干扰（RNAi）的基因敲低33&#160;和基于人工核酸酶的基因破坏8，可能具有关键优势。与RNAi不同，靶向性表观遗传沉默可在单个细胞中实现靶基因的完全抑制，且无需重复给药即可维持长期沉默效果；与基因破坏不同，该方法不改变DNA序列，避免产生DNA双链断裂（DSBs）。DSBs可能诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，进而可能导致具有功能性p53通路的细胞被选择性清除34,35&#160;，尤其在多重基因编辑情况下，还可能引发染色体结构重排35。此外，基因破坏依赖于非同源末端连接介导的DNA双链断裂修复，该修复过程具有不可逆和嵌合性的特点36，因此无法避免靶位点修复后仍形成可翻译的开放阅读框，即产生有功能的编码序列作为最终结果之一；而表观遗传沉默则可根据需要被彻底逆转。
最后，表观遗传沉默有望将可靶向的遗传元件范围扩展至对RNA干扰和基因破坏完全或至少部分不敏感的类别，例如非转录调控元件和非编码RNA30,32。任何靶向性表观遗传沉默应用的首要关键步骤是设计一组覆盖目标基因不同调控序列的工程化转录抑制子（ETR），并鉴定出效果最佳的ETR。需要测试的ETR数量可能至关重要，因为可编程DNA结合技术不断发展，使得基因组中可靶向的区域比例持续增加37。直接在拟进行治疗性基因沉默的细胞类型中开展ETR筛选是最具相关性的选择。然而，由于原代细胞在培养中存活时间有限且通常基因操作效率较低，高通量筛选在技术上较为困难。体内的大规模筛选甚至更加难以实现。
一种更为实用的替代方案是，首先在易于基因操作的细胞系中对大量 ETR 进行初步筛选，随后仅对其中最具前景的候选者在具有治疗相关性的细胞类型中进行验证。另一个并行的问题是选择适当的检测指标以评估 ETR 的沉默效率。通过 RT-qPCR、Western 印迹或 ELISA 直接检测靶基因的转录本或蛋白水平可能成本较高且耗时较长，且灵敏度可能不足，从而限制其在高通量规模下的应用。因此，构建 临时的 通过将荧光蛋白置于目标基因调控序列的转录控制之下而构建的工程化报告细胞系，可利用基于流式细胞术的方法在单细胞水平上以高通量方式检测表观遗传沉默效应。
基于上述总体考虑，本文描述了一种实验方案：首先对表观遗传编辑因子（ETR）进行体外阵列式筛选，以评估其靶向沉默效率，随后对筛选出的最优候选因子进行全基因组范围的脱靶活性分析。该工作流程可将初始的候选ETR集合缩减为少量具有前景的候选者，从而降低复杂性，便于在具有治疗相关性的目标细胞类型中进行最终&#160;评估。
在可用于构建 ETR 的多种可编程 DNA 结合域（DBD）中，本方案将重点采用 CRISPR/dCas9 技术，因为设计覆盖目标基因启动子区域的大量 gRNA 具有较高的便捷性。然而，下文所述的相同概念性工作流程也可用于评估配备其他 DBD 的 ETR 在效率和特异性方面的表现。

<table><tbody><tr><td>4200 TapeStation 系统</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>4D-核转染 X 装置</td><td>Lonza Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AAF-1003X</td><td>核转染</td></tr><tr><td>B2M 沉默 gRNA #1&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>GCAATCAGGACAAGGCCCGC</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>B2M 沉默 gRNA #2</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>GGGGTAGGAGAGACTCACGC</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>B2M 沉默 gRNA #3</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>GAGTCCAGGGCTGGATCTCG</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>BD FACSAria Fusion 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion</td><td>荧光激活细胞分选</td></tr><tr><td>bedtools</td><td>Bedtools</td><td>http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td>基因组区段处理</td></tr><tr><td>bwa</td><td>Ih3</td><td>https://github.com/lh3/bwa</td><td>MeDIP-seq 读段比对</td></tr><tr><td>Chopchop&amp;nbsp;</td><td>Valen's lab</td><td>http://chopchop.cbu.uib.no/</td><td>gRNA 选择软件</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;RPMI 1640 培养基（改良型）1× 含 L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>cqn</td><td>Bioconductor</td><td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html</td><td>基于 GC 含量的区域归一化</td></tr><tr><td>CRISPR 设计套件</td><td>Zhang's lab</td><td>https://zlab.bio/resources-2</td><td>脱靶 gRNA 结合预测&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CRISPRoff-v2.1 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>167981</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>C01161</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的供体模板序列</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td> &lt;p&gt;ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt&lt;br/&gt; 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aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt&lt;br/&gt; cccaacctggctagtttacagcaactgca&lt;/p&gt; </td><td>基因工程</td></tr><tr><td>E220 聚焦超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>500239</td><td>DNA 超声破碎</td></tr><tr><td>edgeR</td><td>Bioconductor</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td><td>差异丰度检验</td></tr><tr><td>EnGen 突变检测试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3321</td><td>基因破坏定量</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td>流式细胞术数据分析软件</td></tr><tr><td>凝胶上样染料，紫色（6×）</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>DNA 凝胶上样</td></tr><tr><td>Go Taq G2 热启动 DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7401</td><td>PCR 扩增</td></tr><tr><td>B2M 基因第一内含子中 dTomato 插入的 gRNA 序列</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>AGGCTACTAGCCCCATCAAG</td><td>基因工程</td></tr><tr><td>hCas9 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>41815</td><td>基因工程</td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>高灵敏度 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>高灵敏度 RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>高灵敏度 RNA ScreenTape 标准品</td><td>Agilent</td><td>5067-5581</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>高灵敏度 RNA ScreenTape 样品缓冲液</td><td>Agilent</td><td>5067-5580</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>IPure 试剂盒</td><td>Diagenode</td><td>C03010011&amp;nbsp;</td><td>5-甲基胞嘧啶免疫沉淀产物的纯化</td></tr><tr><td>K-562 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>细胞工程</td></tr><tr><td>KAPA 文库定量试剂盒</td><td>Roche</td><td>KK4824</td><td>MeDIP-Seq 文库制备</td></tr><tr><td>MACS2</td><td>Taoliu</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS</td><td>甲基化富集区域的鉴定</td></tr><tr><td>MagMeDIP 试剂盒</td><td>Diagenode</td><td>C02010020&amp;nbsp;</td><td>5-甲基胞嘧啶免疫沉淀</td></tr><tr><td>NextFlex Methylseq 试剂盒 1&amp;nbsp;</td><td>Bioo Scientific</td><td>5118-01</td><td>MeDIP-Seq 文库制备</td></tr><tr><td>NextSeq 500 / NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002 / 20012850</td><td>下一代测序</td></tr><tr><td>转染级质粒 DNA 的 NucleoBond Xtra Midi 试剂盒</td><td>Macherey-nagel</td><td>740410.50</td><td>中量提质粒制备</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态&amp;nbsp;细胞&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C404010</td><td>质粒转化</td></tr><tr><td>pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>48240</td><td>基因激活</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒</td><td>Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>pcDNA.CMV.dCas9:KRAB 质粒</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>可应要求提供（lombardo.angelo@hsr.it）</td><td>基因沉默</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>phU6.sgRNA 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>53188</td><td>基因工程</td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Biorad</td><td>1645050</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>检测 B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的正向引物序列</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>GTATTTGCTGGTTATGTTAG</td><td>基因工程</td></tr><tr><td>检测 B2M 基因第一内含子中 tdTomato 插入的反向引物序列</td><td>&amp;nbsp;Lombardo's lab&amp;nbsp;</td><td>AATGGTTGAGTTGGAC</td><td>基因工程</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA 提取</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33238</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS（高灵敏度）检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS（高灵敏度）检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32852</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA 消化</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>Rsubread</td><td>Bioconductor</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html</td><td>基因表达定量</td></tr><tr><td>SF 细胞系 4D-核转染 X 试剂盒 S（32 次）</td><td>Lonza Bioscience&amp;nbsp;</td><td>V4XC-2032</td><td>核转染</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com/</td><td>分子生物学设计软件</td></tr><tr><td>STAR</td><td>Alexander Dobin</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td>RNA-seq 读段比对</td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td>PCR 扩增</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td>DNA 连接</td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1332500</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>20020597</td><td>RNA-Seq 文库制备</td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>琼脂糖凝胶&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

基因失活对于研究基因功能至关重要，并且是治疗多种疾病的一种有前景的策略。在传统技术中，RNA干扰存在靶点抑制不完全以及需要终生治疗的局限性。相比之下，人工核酸酶可通过诱导DNA双链断裂（DSB）实现稳定的基因失活，但近期研究对该方法的安全性提出了质疑。靶向性表观遗传编辑 通过 工程化转录抑制因子（ETRs）可能是一种解决方案，因为单次给予特定的ETR组合即可实现持久的基因沉默，且不会诱导DNA断裂。
ETR 是包含可编程 DNA 结合域（DBD）以及天然转录抑制因子效应元件的蛋白质。具体而言，由三种 ETR 组成的组合——分别携带人源 ZNF10 的 KRAB 结构域、人源 DNMT3A 的催化结构域以及人源 DNMT3L——已被证明可在 ETR 靶基因上诱导可遗传的抑制性表观遗传状态。该平台具有“命中即逃逸”（hit-and-run）的特性，不改变靶标 DNA 序列，且可通过按需进行 DNA 去甲基化逆转至抑制状态，使表观遗传沉默成为一种变革性的工具。其中关键的一步是确定 ETR 在靶基因上的最佳作用位置，以最大化靶向沉默效果并最小化脱靶沉默。在最终的体外（ex vivo）或体内（in vivo）临床前环境中执行此步骤可能较为繁琐。
以CRISPR/催化失活Cas9系统作为ETRs的典型DNA结合域，本文描述了一种实验方案，包括 体外 针对高效靶向沉默，对与三重ETR组合偶联的向导RNA（gRNAs）进行筛选，随后评估筛选出的最优gRNAs的全基因组特异性谱型。该策略可将初始候选gRNAs的集合缩减为少量具有前景的候选者，其复杂度适于在具有治疗相关性的最终实验体系中进行验证。&#160;在具有治疗相关性的目标环境中进行评估。

在将供体模板与CRISPR/Cas9系统联用以实现荧光报告基因在靶位点通过同源重组介导的整合后（例如，通过电穿孔将质粒导入K-562细胞），处理后的样本中会出现报告基因阳性细胞（图1，底部）。如果未出现阳性细胞，应重新检查供体模板和CRISPR/Cas9试剂的设计与克隆准确性。若确认无误，则尝试优化试剂剂量及递送方案本身。
获得报告细胞系后，选择目的基因的启动子/增强子序列，并设计一组相应的gRNA。使用Chopchop等in silico预测工具来识别gRNA序列，并根据预测的效率和特异性对其进行排序（图2）。如果未检索到任何gRNA，请检查目标序列中是否存在典型的Cas9原间隔序列邻近基序（PAM）（5'-NGG-3'）。若无PAM序列存在，可考虑改用基于非PAM依赖型Cas9变体的表观靶向调控系统（ETR）（目前尚未发表使用这些变体的ETR），或转向其他DNA结合结构域平台，如ZFPs53或TALEs30。如果仅检索到预测效能/特异性较低的gRNA，则可考虑：1）测试这些低质量gRNA，或2）扩展目标DNA序列范围，以寻找更优的gRNA。在将三重ETR组合（或CRISPRoff；v2.1）与gRNA瞬时递送后，对荧光报告基因的表达进行纵向流式细胞术分析，通常在急性期分析时观察到报告基因抑制达到峰值，随后由于编码ETR的质粒在细胞分裂过程中逐渐稀释，抑制效果至少部分被逆转（图4C）。如果ETR/gRNA组合能够在目标位点有效沉积CpG甲基化，则在相当比例的处理细胞中将实现报告基因的持久性抑制（图4C）。不同的gRNA可能表现出差异化的长期沉默效率（图4B、C）。
对于全基因组特异性评估，可使用 MeDIP-seq 技术鉴定长期沉默靶基因的细胞与未处理细胞之间差异甲基化的区域。理想情况下，高特异性的 gRNA 应仅在靶位点诱导出一个从头 CpG 甲基化峰（图 5）。若未达到此结果，可考虑对在靶向效率列表中排名较低的 gRNA 进行脱靶活性表征。
<img alt="使用CRISPR结合HDR进行基因编辑的示意图；包含tdTomato表达的流式细胞术结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：通过同源定向修复在人类B2M基因调控元件下整合tdTomato报告基因。顶部：利用CRISPR/Cas9诱导的同源定向修复，将tdTomato荧光报告基因整合至人类B2M基因第一内含子的策略示意图。底部：B2M基因第一内含子中整合tdTomato报告基因前后K-562细胞的代表性散点图。缩写：HA = 同源臂；HDR = 同源定向修复；IRES = 内部核糖体进入位点；pa = BGH多聚腺苷酸化信号（poly(A)）；SA = 剪接受体位点；WT = 野生型；3XSTOP = 三个串联的终止密码子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR sgRNA序列分布；比对图；基因组位置、GC含量数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：体外鉴定靶向B2M基因CpG岛的gRNA，按预测效率和特异性排序。Chopchop输出界面显示靶向B2M基因启动子区域内嵌CpG岛的gRNA，按与脱靶序列完全匹配（MM0）、1个错配（MM1）、2个错配（MM2）或3个错配（MM3）的数量以及预测的靶向效率进行排序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用CRISPR/dCas9质粒核转染和阵列化筛选流程的基因编辑示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：用于dCas9 ETR介导的表观遗传沉默的gRNA克隆与阵列化核转染。顶部：通过寡核苷酸介导的原间隔序列克隆至表达人源U6-gRNA的质粒中。底部：在K-562B2M/tdTomato细胞中，通过质粒核转染进行靶向B2M基因的gRNA阵列化筛选，实现基于CRISPR/dCas9的表观遗传沉默。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑实验示意图；K-562细胞中B2M基因敲除；流式细胞术，CRISPR-dCas9结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：筛选有效诱导B2M基因长期沉默的gRNA。（A）上图：放大区域中B2MtdTomato基因的示意图，显示基于dCas9的ETR复合物与gRNA结合的相对顺序和方向。下图：B2MtdTomato K-562细胞在ETR沉默前（左）和沉默后（右）的代表性散点图。分析时间为转染编码gRNA及三重dCas9:KRAB + dCas9:D3A + dCas9:D3L组合质粒后第30天。（B）转染后第30天，靶向B2M基因CpG岛的指定gRNA（以混合物或单个gRNA形式）在K-562 B2MtdTomato细胞中的沉默活性（示意图上部的红色箭头表示gRNA的方向）。数据表示tdTomato阴性细胞的百分比（均值 ± 标准误；n = 每种处理条件下四次独立转染实验）。（C）转染表达三重ETR组合及指定靶向B2M CpG岛的gRNA质粒（或模拟转染，即无gRNA和ETR的对照组）后，B2MtdTomato K-562细胞的时间进程分析。数据表示tdTomato阴性细胞的百分比（均值 ± 标准误；n = 每种处理条件下三次独立转染实验）。未发表数据。图A和B改编自Amabile等30。缩写：CGI = CpG岛；IRES = 内部核糖体进入位点；pa = BGH多聚腺苷酸化信号；SA = 剪接受体位点；SD = 剪接供体位点；TSS = 转录起始位点；UT = 未转染；3XSTOP = 三个串联终止密码子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因沉默分析；散点图、环形图、转录起始位点；B2M-IRES-tdTomato 研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64403/64403fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过 RNA-seq 和 MeDIP-seq 对 ETR 特异性进行全基因组分析。左侧：对照处理的 B2MtdTomato K-562 细胞与经三重 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A、dCas9:DNMT3L ETR 组合及靶向 B2M 基因 CpG 岛的 gRNA 处理的细胞中基因表达水平的比较。数值以每千碱基每百万比对读段的 log2（RPKM）表示。黑点代表在所有条件下表达水平相近的基因；黄色圆圈代表在 FDR < 0.01 条件下差异调控的基因；红色圆圈代表 B2M-IRES-tdTomato 转录本。右上方：环状图显示对照处理的 B2MtdTomato K-562 细胞（蓝色）与经三重 dCas9:KRAB、dCas9:DNMT3A、dCas9:DNMT3L ETR 组合及靶向 B2M 基因 CpG 岛（CGI）的 gRNA 处理的细胞（绿色）的全基因组 MeDIP-seq 谱。右下方：显示了在指定样本中 B2MtdTomato 位点的甲基化状态。每个堆积图中包含三个重复；比对读段的堆积图使用高斯窗口进行平滑处理。本图改编自 Amabile 等人30。缩写：TSS = 转录起始位点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64403/64403fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在此，我们提出一种用于 体外 筛选具有高效、长期、稳定靶向沉默效果且全基因组范围内脱靶活性低的工程化转录抑制子（ETRs）。该工作流程可将初始复杂的候选ETRs文库缩减为适用于在治疗相关背景下进一步评估的精简列表。

基因失活对于研究基因功能至关重要，并且是治疗多种疾病的一种有前景的策略。在传统技术中，RNA干扰存在靶点抑制不完全以及需要终生治疗的局限性。相比之下，人工核酸酶可通过诱导DNA双链断裂（DSB）实现稳定的基因失活，但近期研究对该方法的安全性提出了质疑。通过工程化转录抑制因子（ETRs）进行靶向表观遗传编辑可能提供一种解决方案，因为单次给予特定的ETR组合即可在不引起DNA断裂的情况下实现持久的基因沉默。ETRs是一类包含可编程DNA结合域（DBD）以及天然转录抑制因子效应结构域的蛋白质。具体而言，由人ZNF10的KRAB结构域、人DNMT3A的催化结构域和人DNMT3L组成的三种ETR组合，已被证明可在ETR靶基因上诱导可遗传的抑制性表观遗传状态。该平台具有“命中即离去”（hit-and-run）的特性，不改变靶基因的DNA序列，并且可通过按需进行DNA去甲基化逆转至抑制状态，使表观遗传沉默成为一种变革性的工具。关键步骤之一是确定ETRs在靶基因上的最佳作用位置，以最大化靶向沉默效果并最小化脱靶效应。在最终的体外或体内临床前模型中进行该步骤可能较为繁琐。本文以CRISPR/催化失活Cas9系统作为ETRs的典型DNA结合域，描述了一项实验方案：首先在体外筛选与三联ETR组合联用的向导RNA（gRNAs），以实现高效的靶向沉默，随后对筛选出的最优候选gRNAs进行全基因组范围的特异性分析。该流程可将初始的候选gRNA集合缩减为少量具有潜力的候选者，从而使其复杂度适合在具有治疗相关性的最终实验体系中进行深入评估。

我们开发的表观遗传沉默技术属于更广泛的一类基因沉默技术。在我们开始开发表观遗传沉默技术之前，该领域主要有两种替代方案：一种是通过RNA干扰实现的基因敲低，另一种是通过人工核酸酶实现的基因破坏。人工核酸酶介导的基因破坏作用于DNA水平。当你有一个需要失活的目标基因时，可将某些人工核酸酶递送至细胞内，从而诱导DNA双链断裂。这类双链断裂可引发移码突变，最终导致非功能性蛋白的产生，或同时引发转录本的降解。另一方面，表观遗传沉默是通过向细胞内递送所谓的工程化转录抑制子（ETRs）来实现的。这些小型蛋白质能够结合目标DNA，并在目标基因上建立所谓的表观遗传标记。这些化学修饰一旦沉积在DNA上，便可导致染色质压缩。染色质压缩会显著引起转录抑制，从而使目标基因不再表达。尤为重要的是，这种转录抑制状态可在细胞中长期遗传。为确定表达待沉默目标基因的细胞系，可在《人类蛋白质图谱》（The Human Protein Atlas）中检索目标基因，并浏览“细胞系”部分，以鉴定代表感兴趣体组织的细胞系。从鉴定出的细胞系中，优先选择已有高效瞬时基因递送方案的细胞系。接下来，打开基因浏览器，确定目标基因中用于整合荧光报告基因表达盒的区域。然后使用CHOPCHOP工具识别并选择将在目标区域切割的gRNA。在本例中，目标区域为B2M基因的第一个内含子。接着，设计针对gRNA切割位点的供体模板，该模板包含左同源臂、无启动子的转基因表达盒以及右同源臂。根据制造商说明书，通过核转染将CRISPR Cas9核酸酶系统和供体模板递送至K-562细胞系中。将K-562细胞培养至少14天。利用流式细胞仪随时间监测荧光报告基因的表达水平。激活藻红蛋白通道以检测tdTomato报告基因的荧光强度。在UCSC基因组浏览器中检索目标基因，并提取可能调控其转录活性的区域的核苷酸序列，例如CpG岛以及H3K27乙酰化富集位点。将选定的序列粘贴至CHOPCHOP在线工具中，并选择“抑制”作为待检索gRNA的目的。CHOPCHOP将提供一份映射到目标基因序列上的gRNA列表，并根据脱靶匹配数量和预测的靶向效率评分进行排序。每个目标序列至少选择10条gRNA。尽量选择覆盖整个目标区域的gRNA，且在整个基因组中无完全匹配的其他基因间序列。在将编码ETRs的质粒转化至化学感受态E.coli细胞后，通过限制性酶切和Sanger测序筛选含有ETRs编码质粒的菌落。为将gRNA克隆至phU6 gRNA骨架中，首先使用分子生物学设计软件设计寡核苷酸。在原间隔序列上游添加五核苷酸序列，并将此长度为25个核苷酸的寡核苷酸标记。类似地，在原间隔序列的反向互补序列上添加五核苷酸序列，并在其下游添加一个胞嘧啶，以生成另一条长度为25个核苷酸的寡核苷酸并进行标记。将这些寡核苷酸合成为无盐单链DNA，溶于水中，浓度为100微摩尔。将每种寡核苷酸各取1微升加入2微升退火缓冲液和16微升水中。通过将溶液置于热循环仪中95摄氏度加热10分钟进行寡核苷酸退火，随后在45分钟内逐渐冷却至25摄氏度。取1微升退火后的寡核苷酸，用99微升无核酸酶水稀释。然后，取1微升该稀释液与50纳克先前经BsaI限制性内切酶消化的phU6 gRNA质粒进行连接反应。将2微升连接产物转化至20微升化学感受态E.coli细胞中。挑取多个菌落进行质粒DNA制备，并通过Sanger测序确认原间隔序列的克隆成功。为在报告细胞系中以阵列形式递送gRNA和基于CRISPR/dCas9的ETRs，首先准备多个独立离心管，每管加入500纳克各质粒，并加入125纳克不同gRNA编码质粒进行测试。设置不含gRNA和ETRs的核转染条件作为模拟处理对照样本。每个样本至少设置三个技术重复。每管收集5 × 105个B2M tdTomato K-562细胞，进行核转染并加入质粒混合物。将细胞重悬于200微升预热的RPMI 1640哺乳动物细胞培养基中，放入培养箱培养。利用流式细胞术在ETRs递送后的不同时间点检测沉默细胞的百分比。使用不含tdTomato编码序列的野生型细胞设定报告基因阴性细胞的阈值。使用模拟处理样本设定报告基因阳性细胞的门控范围。根据长期沉默效率筛选出表现最佳的三条gRNA。利用FACS分选出在这些样本中稳定维持的报告基因阴性亚群。同时，在相同条件下对模拟处理样本进行FACS分选，以便在后续分析中进行恰当比较。通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复，将tdTomato荧光报告基因整合至人类B2M基因的第一个内含子中。整合后，处理样本中出现报告基因阳性的K-562细胞。在瞬时递送三联ETRs组合及gRNA后，进行纵向流式细胞术分析，以评估荧光报告基因的表达情况。急性期分析中观察到报告基因抑制的峰值，但随着时间推移，由于ETRs编码质粒在有丝分裂中被稀释，抑制效果部分恢复。ETRs与gRNA组合在目标位点有效沉积CpG甲基化，表现为处理细胞中有相当比例的细胞实现了报告基因的持久抑制。不同gRNA表现出不同的长期沉默效率。实现持久且高效表观遗传沉默的关键步骤之一是鉴定高效的gRNA。为此，无论何种应用，均需首先识别最敏感的序列，包括启动子、增强子及其他转录调控位点。一旦确定了最敏感且有效的区域，应设计不同的gRNA并单独或组合测试其效果。表观基因组编辑最明显的一个应用是治疗由功能获得性突变引起的疾病。此外，我们仍需牢记，特异性改变特定启动子表观遗传调控的能力，对于转化医学和基础科学研究而言，都可能成为一种极为有用的工具。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

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本方案描述了使用失活融合蛋白SID4X-dCas9-KRAB（也称为增强子干扰，Enhancer-i）对增强子进行多重靶向设计与操作的步骤。该方案可用于鉴定调控基因表达的增强子，并有助于解析调控同一靶基因的多个增强子之间的相互关系。...

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利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。...

体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

可以从识别部分简并序列的酶出发，开发出具有新序列特异性的限制性内切酶。本文提供了我们成功用于改变NlaIV酶序列特异性的详细实验方案。该方案的关键要素包括转录/翻译反应的体外区室化，以及具有新序列特异性的变体筛选。...

体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

本方案描述了利用质粒DNA转染和mRNA核转染技术，在人源细胞系中进行基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的表观基因组编辑的方法。...

利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

本方案描述了一种非整合型、附加体型的CRISPR/dCas9系统，用于在K562细胞中进行靶向表观遗传编辑。该系统结合dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1效应蛋白与特异性sgRNA，可精确诱导位点特异性的DNA甲基化，并降低脱靶效应。...

K562细胞的表观遗传工程：利用dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1融合蛋白的双载体附加体策略实现稳定的靶向DNA甲基化

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

了解工程化转录抑制因子体外筛选方法，用于实现高效稳定的表观遗传沉默。本方案利用CRISPR/Cas9技术筛选低脱靶效应的ETR候选分子，为基因治疗应用提供可靠的技术基础。

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

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