Bioengineering
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3 डी सेल कल्चर के लिए माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल स्काफोल्ड्स में कण अंश को नियंत्रित करना
Chapters
Summary October 28th, 2022
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दानेदार मचानों के भीतर कण अंश में परिवर्तनशीलता को कम करने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोग की सुविधा मिलती है। यह काम इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रित कण अंशों के साथ दानेदार मचानों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है।
Transcript
दानेदार सामग्री, जैसे कि एमएपी मचान, छिद्रपूर्ण इंजेक्शन योग्य सामग्री हैं जो आपस में जुड़े सूक्ष्म आकार के हाइड्रोगेल कणों से बने होते हैं। कण अंश को नियंत्रित करना भौतिक गुणों और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। एमएपी मचानों में परिवर्तनीय कण अंशों के परिणामस्वरूप पाड़ गुणों और सेल प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला होती है, लेकिन यह तकनीक उपयोगकर्ताओं को उनके द्वारा बनाए गए एमएपी मचानों में अंतिम कण अंश को परिभाषित करने की अनुमति देती है।
एमएपी मचानों का उपयोग जटिल घावों की मरम्मत और पुनर्जनन को बढ़ावा देने के साथ-साथ दवाओं को वितरित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कण अंश, सेलुलर घुसपैठ और पुनर्जनन की दर और डिग्री को प्रभावित करता है। इस विधि को दानेदार हाइड्रोगेल के सभी वर्गों में लागू किया जा सकता है।
अब जब हम उपयोगकर्ता-नियंत्रित कण अंशों के साथ एमएपी मचान बना सकते हैं, तो हम इन सामग्रियों की जैव गतिविधि का अध्ययन कर सकते हैं और अद्वितीय सेल प्रतिक्रियाओं की जांच कर सकते हैं, जैसे कि कारावास। माइक्रोफ्लुइडिक माइक्रोजेल पीढ़ी को स्थापित करने के लिए समय और धैर्य की आवश्यकता होती है क्योंकि आप तकनीक सीखते हैं। यदि आप सेटअप के साथ समस्याओं में चलते हैं तो कई उपकरणों को तैयार करना और तैयार रखना सबसे अच्छा है।
हायलूरोनिक एसिड, या एचए, और नॉरबोर्निन, या एनबी, माइक्रोगेल के माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन से शुरू करें। माइक्रोगेल को सुखाने से पहले, एक क्रायो-सुरक्षित स्क्रू-कैप ट्यूब का वजन करें। फिर एक बाँझ हुड में, धोए गए और शुद्ध माइक्रोगेल को सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके क्रायो-सुरक्षित स्क्रू-कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
शुद्ध माइक्रोगेल में 70% इथेनॉल जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। 5,000 ग्राम पर पांच मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला, और 70% इथेनॉल जोड़ें।
अच्छी तरह मिलाएं और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, माइक्रोगेल ट्यूब के निचले भाग में हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। क्रायोजेनिक कंटेनर में तरल नाइट्रोजन जोड़ें, और माइक्रोगेल की ट्यूब को फ्लैश फ्रीज में रखें।
पांच से 10 मिनट के बाद, बल के साथ माइक्रोगेल की ट्यूब को हटा दें। जल्दी से टोपी को हटा दें, और ट्यूब को लैब-ग्रेड ऊतक के साथ कवर करें। एक रबर बैंड के साथ ऊतक को सुरक्षित करें, और इसे एक लियोफिलाइजेशन कंटेनर, या कक्ष में स्थानांतरित करें।
निर्माता के निर्देशों के बाद लियोफिलाइज़र पर नमूना लोड करें, और 0.066 टॉर और माइनस 63 डिग्री सेल्सियस पर लियोफिलाइज़ करें। कमरे के तापमान पर संग्रहीत करने से पहले ट्यूब से लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल का वजन करें। द्रव्यमान द्वारा 10 से एक अनुपात में इलाज एजेंट के साथ पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन, या पीडीएमएस इलास्टोमेर बेस मिलाएं।
पीडीएमएस मिश्रण को एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश में डालें और 30 मिनट के लिए डेसिकेटर में डेगैस करें, या जब तक कि सभी बुलबुले गायब न हो जाएं। एक बार जब सभी बुलबुले गायब हो जाते हैं, तो नए बुलबुले के गठन को कम करने के लिए पीडीएमएस में 3 डी-मुद्रित मोल्ड को सावधानीपूर्वक रखें। पीडीएमएस को ठीक करने के लिए ओवन में दो घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
इलाज के बाद, संस्कृति उपकरण की परिधि के चारों ओर धीरे से पता लगाने के लिए चाकू, या रेजर ब्लेड का उपयोग करें, और मोल्ड को सावधानीपूर्वक हटा दें। कुओं के तल से किसी भी पीडीएमएस को हटाने के लिए चार मिलीमीटर बायोप्सी पंच का उपयोग करें। ग्लास कवर स्लिप पर फिट होने के लिए उपकरणों को काटें।
संस्कृति डिवाइस के निचले हिस्से से धूल हटाने के लिए टेप का उपयोग करें। नमी हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 135 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर साफ ग्लास कवर स्लिप और कल्चर डिवाइस रखें। फ्यूम हुड में, ग्लास कवर स्लिप पर एक कोरोना प्लाज्मा गन का उपयोग करें और डिवाइस के निचले हिस्से में 30 सेकंड के लिए।
फिर जल्दी से इलाज की गई सतहों को एक साथ बांधें। कल्चर डिवाइस और ग्लास कवर स्लिप के बीच एक अच्छी सील सुनिश्चित करने के लिए धीरे से दबाव लागू करें। बंधन को सुरक्षित करने के लिए डिवाइस को रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
अगले दिन, विट्रो में उपयोग करने से पहले डिवाइस को निष्फल करने के लिए ऑटोक्लेव करें। इसके बाद, एमएपी मचानों में सेल कल्चर के लिए वांछित कण अंश के आधार पर माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल, या एमएपी पाड़ घटक तैयार करें। माइक्रोगेल के द्रव्यमान को निर्धारित करने के लिए लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल का वजन करें।
फिर चुने हुए वजन प्रतिशत एमएपी के आधार पर सेल मीडिया के अंतिम एमएपी वॉल्यूम के 84% में माइक्रोगेल का पुनर्गठन करें। माइक्रोगेल को 20 मिनट तक फूलने दें। अंतिम एमएपी मात्रा के 16% में हाइलूरोनिक एसिड, या एचए-टेट्राज़िन और सेल मीडिया को भंग करें।
एक बार जब कोशिकाएं वांछित संयोजन तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को उठाएं और गिनती करें। एक नई ट्यूब में प्रति माइक्रोलीटर एमएपी 10, 000 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और कोशिकाओं को एस्पिरेटेड किए बिना गोली से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
विस्थापन पिपेट का उपयोग करके गोली में माइक्रोगेल और क्रॉस-लिंकर जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और प्रति अच्छी तरह से 10 माइक्रोलीटर बीज लें। पिपेट एक गोलाकार गति में मिश्रण को कुएं में समान रूप से वितरित करने के लिए।
कुओं को भरने के लिए सेल मीडिया जोड़ने से पहले माइक्रोगेल को 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नष्ट होने दें। 3 डी संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें, और आवश्यकतानुसार मीडिया बदलें। मचान को रोकने से बचने के लिए, ऊपरी कुएं के रिज के साथ पिपेट टिप को स्थिर करें।
वांछित समय बिंदुओं पर, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रति कुएं 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 माइक्रोलीटर के साथ मीडिया को प्रतिस्थापित करके नमूने ठीक करें। नमूनों को पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर, या पसंदीदा बफर के साथ तीन बार धोएं, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या प्रतिदीप्ति धुंधला पन के लिए आगे बढ़ें। प्रवाह-केंद्रित क्षेत्र के साथ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को व्यास में 50, या 100 माइक्रोन के एचए-एनबी माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था।
माइक्रोगेल को लियोफिलाइज़ करने के लिए माध्यम को 70% इथेनॉल का उपयोग करके क्रायोगेल गठन को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि, क्रायोगेल गठन की सुविधा के लिए आइसोप्रोपिल अल्कोहल, पानी और एसिटोनिट्राइल जैसे अन्य मीडिया का परस्पर उपयोग किया जा सकता है। एचए-एनबी माइक्रोगेल के बायो-ऑर्थोगोनल इंटरलिंकिंग की सुविधा के लिए एक रैखिक एचए-टेट्राज़िन क्रॉस-लिंकर को संश्लेषित किया गया था।
प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक टेट्राज़िन पेंडेंट समूह के साथ एचए रिपीट इकाइयों के 11% का एक सफल संशोधन दिखाता है। सूखे लियोफिलाइज्ड माइक्रोजेल उत्पाद को विशेष मात्रा के साथ पुनर्जलीकृत किया गया था और एमएपी मचानों में माइक्रोगेल के विभिन्न वजन प्रतिशत योगों को प्राप्त करने के लिए नष्ट कर दिया गया था। एमएपी मचानों में माइक्रोगेल के ये वजन प्रतिशत अद्वितीय कण अंशों के अनुरूप थे।
एमएपी मचानों में सेल संस्कृति यहां दिखाई गई है। एमएपी मचानों में 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं को पांचवें दिन तय किया गया था, दाग और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया गया था। एकल जेड-स्लाइस सेल विकास और मचानों में अंतर दिखाते हैं जिसमें विभिन्न वजन प्रतिशत एमएपी शामिल हैं।
अपने लियोफिलाइजेशन मीडिया का चयन उचित रूप से करें जो इस बात पर निर्भर करता है कि आप क्रायोगेल चाहते हैं, या नहीं। इनक्यूबेशन चरणों को न छोड़ें, ताकि आपके माइक्रोगेल के पास मीडिया में सूजन के लिए पर्याप्त समय हो। माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री, आरएनए अनुक्रमण, और अधिक जैसी मानक तकनीकों का उपयोग परिभाषित छिद्रों के साथ इन दानेदार सामग्रियों के भीतर सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
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