Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
3D Hücre Kültürü için Mikro Gözenekli Tavlanmış Partikül İskelelerinde Partikül Fraksiyonunun Kontrol Edilmesi
Chapters
Summary October 28th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Granüler iskeleler içindeki partikül fraksiyonundaki değişkenliği en aza indirmek, tekrarlanabilir deneyleri kolaylaştırır. Bu çalışma, in vitro doku mühendisliği uygulamaları için kontrollü parçacık fraksiyonlarına sahip granüler iskeleler üretme yöntemlerini açıklamaktadır.
Transcript
MAP iskeleleri gibi granüler malzemeler, birbirine bağlı mikro boyutlu hidrojel parçacıklarından yapılmış gözenekli enjekte edilebilir malzemelerdir. Parçacık fraksiyonunu kontrol etmek, malzeme özellikleri ve hücresel tepkiler için kritik öneme sahiptir. MAP iskelelerindeki değişken parçacık fraksiyonları bir dizi iskele özelliği ve hücre tepkisi ile sonuçlanır, ancak bu teknik, kullanıcıların oluşturdukları MAP iskelelerinde nihai parçacık fraksiyonunu tanımlamalarına izin verir.
MAP iskeleleri, karmaşık yaraların onarımını ve yenilenmesini teşvik etmek ve ayrıca ilaç vermek için kullanılabilir. Örneğin parçacık fraksiyonu, hücresel infiltrasyon ve rejenerasyonun hızını ve derecesini etkiler. Bu yöntem, tüm granüler hidrojel sınıflarına uygulanabilir.
Artık kullanıcı kontrollü parçacık fraksiyonlarına sahip MAP iskeleleri yapabildiğimize göre, bu malzemelerin biyoaktivitesini yeniden üretilebilir bir şekilde inceleyebilir ve hapsetme gibi benzersiz hücre tepkilerini araştırabiliriz. Mikroakışkan mikrojel üretimini ayarlamak, teknikleri öğrenirken zaman ve sabır gerektirir. Kurulumla ilgili sorunlarla karşılaşmanız durumunda birden fazla cihazın hazır ve hazır olması en iyisidir.
Hyaluronik Asit veya HA ve Norbornen veya NB mikrojellerinin mikroakışkan üretimi ile başlayın. Mikrojelleri kurutmadan önce, kriyo-güvenli bir vidalı kapak tüpünü tartın. Daha sonra steril bir davlumbazda, yıkanmış ve saflaştırılmış mikrojelleri, pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak kriyo-güvenli bir vidalı kapak tüpüne aktarın.
Saflaştırılmış mikrojellere% 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. Tüpü 5.000 g'da beş dakika santrifüj yapın. Süpernatanı aspire edin ve% 70 etanol ekleyin.
İyice karıştırın ve gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mikrojellerin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için kısaca santrifüj yapın. Kriyojenik bir kaba sıvı azot ekleyin ve mikrojellerin tüpünü dondurmak için yerleştirin.
Beş ila 10 dakika sonra, mikrojel tüpünü forseps ile çıkarın. Kapağı hızla çıkarın ve tüpü laboratuvar sınıfı doku ile örtün. Dokuyu lastik bir bantla sabitleyin ve bir liyofilizasyon kabına veya odaya aktarın.
Numuneyi üreticinin talimatlarını izleyerek liyofilizatöre yükleyin ve 0.066 Torr ve eksi 63 santigrat derecede liyofilize edin. Liyofilize mikrojelleri oda sıcaklığında saklamadan önce tüpten tartın. Polidimetilsiloksan veya PDMS elastomer bazını, kürleme maddesi ile kütlece 10 ila bir oranında karıştırın.
PDMS karışımını büyük bir plastik Petri kabına dökün ve kurutucuda 30 dakika boyunca veya tüm kabarcıklar kaybolana kadar gaz verin. Tüm kabarcıklar kaybolduktan sonra, yeni kabarcıkların oluşumunu en aza indirmek için 3D baskılı kalıbı PDMS'ye dikkatlice yerleştirin. PDMS'yi iyileştirmek için iki saat boyunca 60 santigrat derecede fırına koyun.
Kürledikten sonra, kültür cihazının çevresini nazikçe izlemek için bir bıçak veya tıraş bıçağı kullanın ve kalıbı dikkatlice çıkarın. Herhangi bir PDMS'yi kuyucukların dibinden çıkarmak için dört milimetrelik bir biyopsi punch kullanın. Cihazları cam kapak kaymasına sığacak şekilde kesin.
Kültür cihazının alt tarafındaki tozu temizlemek için bant kullanın. Nemi gidermek için temiz cam kapak kayma ve kültür cihazını 135 santigrat derecede bir sıcak plakaya 15 dakika boyunca yerleştirin. Bir duman başlığında, cam kapak kayması ve cihazın alt tarafında 30 saniye boyunca yüksek bir korona plazma tabancası kullanın.
Daha sonra işlenmiş yüzeyleri hızla birbirine bağlayın. Kültür cihazı ile cam kapak kayması arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için yavaşça basınç uygulayın. Bağı sabitlemek için cihazı gece boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin.
Ertesi gün, in vitro kullanmadan önce sterilize etmek için cihazı otoklav edin. Daha sonra, MAP iskelelerinde hücre kültürü için istenen parçacık fraksiyonuna dayanan Mikro Gözenekli Tavlanmış Parçacık veya MAP iskele bileşenlerini hazırlayın. Mikrojellerin kütlesini belirlemek için liyofilize mikrojelleri tartın.
Daha sonra, seçilen ağırlık yüzdesi MAP'ye dayanarak hücre ortamının nihai MAP hacminin% 84'ünde mikrojelleri yeniden oluşturun. Mikrojellerin 20 dakika şişmesine izin verin. Hyaluronik Asit veya HA-tetrazin'i ve hücre ortamını nihai MAP hacminin% 16'sında çözün.
Hücreler istenen akıcılığa ulaştığında, hücreleri kaldırın ve sayın. Mikrolitre MAP başına 10.000 hücreyi yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüj edin ve hücreleri aspire etmeden süpernatantı peletten aspire edin.
Deplasmanlı pipet kullanarak pelete mikrojeller ve çapraz bağlayıcı ekleyin. İyice karıştırın ve kuyu başına 10 mikrolitre tohumlayın. Karışımı kuyuya eşit olarak dağıtmak için dairesel bir hareketle pipet.
Kuyucukları doldurmak için hücre ortamı eklemeden önce mikrojellerin 25 dakika boyunca 37 santigrat derecede tavlanmasına izin verin. 3B kültürleri 37 santigrat derecede tutun ve medyayı gerektiği gibi değiştirin. İskelenin aspire edilmesini önlemek için, pipet ucunu üst kuyucuğun sırtı boyunca stabilize edin.
İstenilen zaman noktalarında, ortamı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyucuk başına 50 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile değiştirerek numuneleri sabitleyin. Numuneleri 50 mikrolitre PBS veya tercih edilen tamponla üç kez yıkayın ve çalışma hacminin yanı sıra 50 mikrolitre kullanarak immünofloresan veya floresan boyama işlemine devam edin. Akış odaklı bir bölgeye sahip mikroakışkan cihazların, çapı 50 veya 100 mikron olan HA-NB mikrojelleri ürettiği gösterilmiştir.
Mikrojelleri liyofilize etme ortamı,% 70 etanol kullanılarak kriyogen oluşumunu en aza indirgemek için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, izopropil alkol, su ve asetonitril gibi diğer ortamlar, kriyogen oluşumunu kolaylaştırmak için birbirinin yerine kullanılabilir. HA-NB mikrojellerinin biyo-ortogonal birbirine bağlanmasını kolaylaştırmak için doğrusal bir HA-tetrazin çapraz bağlayıcı sentezlendi.
Proton NMR spektroskopisi, tetrazin kolye grubu ile HA tekrar ünitelerinin% 11'inin başarılı bir modifikasyonunu göstermektedir. Kurutulmuş liyofilize mikrojel ürünü, özel hacimlerle rehidre edildi ve MAP iskelelerinde mikrojellerin farklı ağırlık yüzdesi formülasyonlarını elde etmek için tavlandı. MAP iskelelerindeki mikrojellerin bu ağırlık yüzdeleri, benzersiz parçacık fraksiyonlarına karşılık geliyordu.
MAP iskelelerindeki hücre kültürü burada gösterilmiştir. MAP iskelelerindeki 3D kültürdeki hücreler beşinci günde sabitlendi, boyandı ve konfokal mikroskopta görüntülendi. Tek Z-dilimleri, hücre büyümesinde farklılıklar gösterir ve farklı ağırlık yüzdesi MAP'yi içeren iskeleler.
Liyofilizasyon ortamınızı kriyojenleri isteyip istemediğinize bağlı olarak uygun şekilde seçin. Kuluçka adımlarını atlamayın, böylece mikrojelleriniz medyada şişmek için yeterli zamana sahip olur. Mikroskopi, akış sitometrisi, RNA dizilimi ve daha fazlası gibi standart teknikler, tanımlanmış gözeneklere sahip bu granüler materyallerdeki hücre yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
