يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح طريقة مختبرنا وقد وضعت لتحليل التغييرات وإعادة ترتيب شكل الخلية المطلوبة لثني والطي الدماغ الزرد النامية (Gutzman وآخرون ، 2008). مثل هذا التحليل يعطي فهما جديدا للبيولوجيا الخلية الأساسية اللازمة لتطوير البنية 3D الفقاريات من الدماغ ، ويزيد بشكل كبير من قدرتنا على دراسة التشكل أنبوب العصبي. يتشكل الدماغ الزرد الجنينية ابتداء من الساعة 18 التسميد آخر ساعة (HPF) والبطينين داخل الظهارة العصبية تضخيم. بنسبة 24 HPF ، والخطوات الأولية التشكل الأنبوب العصبي كاملة. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، يتم حقن الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع ترميز الغشاء مرنا استهداف بروتين الفلورية الخضراء (memGFP). HPF بعد الحقن ، والحضانة ، وجنين ، وبين 18 و 24 الآن ، هي التي شنت ، مقلوب ، في agarose والتقط بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومن الجدير بالذكر أن الجنين الزرد شفافة مما يجعلها مثالية لنظام التصوير الفلورسنت. في حين ركزت تحليلاتنا على الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر والدماغ المؤخر ويمكن تمديد هذه طريقة لتحليل أي منطقة في الزرد إلى عمق 8-10 ميكرون.

Protocol

1. إعداد مرنا للحقن

  1. وكتب على مرنا المستخدمة في هذا الإجراء من ترميز البلازميد CAAX - eGFP (memGFP) مرنا. يصبح خطي لأول مرة وفقا لبلازميد Gutzman آخرون ، 2008.
  2. ثم نسخ مرنا memGFP باستخدام mMachine mMessage عدة.
  3. تمييع مرنا مما أدى إلى 1μg/μl ، قسامة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. إعداد قالب حقن agarose 1 ٪ مع الممرات عرض الأجنة في مرحلة خلية واحدة.
  5. في اليوم قبل الحقن ، وإقامة أقفاص التزاوج فصل الذكور عن الإناث.
  6. في يوم من الحقن ، وسحب الإبر الشعرية باستخدام مجتذب micropipette للتحضير للحقن.

2. حقن مرنا

  1. في يوم من الحقن ، وأذاب an قسامة من مرنا memGFP 1μg/μl على الجليد.
  2. تمييع 01:05 مرنا في الماء إلى التركيز النهائي لل200ng/μl ، والحفاظ على الجليد.
  3. تحميل الإبرة الشعرية مع 1μl من مرنا memGFP أعدت في 200ng/μl.
  4. مكان تحميل إبرة في micromanipulator تعلق على microinjector التي تعمل بالغاز.
  5. ضبط مستوى الصوت لحقن 1nl.
  6. سحب فواصل على الأسماك نوع البرية التي أنشئت في أقفاص التزاوج من اليوم السابق.
  7. جمع الأجنة في أقرب وقت وضعت فيه. توجيهها في قالب حقن agarose تغطيها المتوسطة الجنين (Westerfield ، 1995) مع خلية واحدة على الجانب بعيدا عن micromanipulator.
  8. من خلال ضخ المشيماء وصفار البيض بحيث يتم إيداع مرنا مباشرة في خلية واحدة. ضخ ما يقرب من 50 الأجنة في التجربة. لا حقن إذا كانت الخلية قد تنقسم.
  9. احتضان الأجنة عند 28 درجة مئوية خلال الليل في وسط جنين

3. التركيب والتصوير الأجنة

  1. لتحميل الصور والأجنة ، وإزالة المشيماء بالملقط من الأجنة في إطار ساعة واحدة قبل نقطة stereomicroscope الوقت للاهتمام.
  2. إعداد شريحة متزايدة لتصل إلى 4 أجنة.
    • استخدام سيليكون الشحوم فراغ لابرام ساترة على الجانب السفلي من شريحة مصممة خصيصا 2mm وسميكة من البلاستيك مع وجود ثقب 1cm تقريبا في القطر.
    • سد ثقب في الشريحة مع agarose 0.7 ٪ ، واسمحوا الوقوف حوالي 20 دقيقة أو حتى تصلب
    • مرة واحدة وقد عززت agarose ، إزالة المكونات الصغيرة باستخدام ماصة 200μl نصائح لتشكيل الثقوب الأسطوانية التي لتحميل كل جنين.
  3. وضع الأجنة على الشريحة agarose مليئة تشريح تحت المجهر. إضافة 50μl من tricaine (Westerfield ، 1995) لتخدير الأجنة.
  4. استخدام ملقط لوضع الأجنة في ثقوب اسطوانية في agarose مع الدماغ أو المنطقة التي تهم ضد ساترة الكامنة.
  5. تغطي الأجنة في agarose مع آخر ساترة المضمون مع الشحوم فراغ السيليكون.
  6. صورة الجنين باستخدام مقلوب ، فلوري ، ليزر أو مسح القرص مبائر الغزل المجهر. الصورة في 63x أو أعلى لجمع صور عالية الدقة واحدة من الخلايا داخل الظهارة العصبية.
  7. ويتم تصدير الصور على هيئة ملفات TIFF من برنامج LSM وتحليلها باستخدام برنامج فوتوشوب.

4. نتائج ممثل / نتائج

هو مبين في الشكل رقم 1 هو صورة من ممثل مبائر الظهارة العصبية 24 الزرد HPF بين الدماغ المتوسط ​​والبطينين الدماغ المؤخر. هو المسمى مع كل خلية غشاء محدد GFP.


الشكل 1. يعيش التصوير مبائر من memGFP حقن الجنين 24 الزرد HPF.
(A) الظهارة العصبية للجنين 24 HPF مع كل خلية التي حددها GFP. المنطقة تصوير الدماغ المتوسط ​​ويفصل بين البطينين الدماغ المؤخر (M ، H على التوالي) ، والتي تشكل الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لحقن مرنا في واحد الأجنة الزرد الخلية. هنا ، فإننا نستخدم مرنا ترميز GFP غشاء استهداف لتسمية كل خلية. ثم نظهر كيفية تحميل وصورة الدماغ النامية في قرار خلية واحدة. وقد سمحت لنا هذه التقنية لدراسة نوع جديد من تغيير شكل الخلية ، وانقباض القاعدية ، المطلوبة لتشكيل الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر (Gutzman وآخرون ، 2008). تحليل مماثل من الظواهر الأخرى لديها القدرة على التوسع بشكل كبير من فهمنا التشكل الفقاريات وبيولوجيا الخلايا الكامنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

جزيل الشكر للدكتور جنيفر Gutzman الذين طوروا الاولى من هذا الأسلوب في مختبر SIVE. أيضا بفضل الخضراء JB في بوسطن دانا فاربر معهد السرطان ، MA الذين قدموا يرجى الترميز البلازميد CAAX - GFP مرنا. أجري التصوير مبائر في مرفق WM مؤسسة كيك التصوير البيولوجي في وايتهيد. معتمد من قبل النظام المنسق NIHMH70926. معتمد من قبل المصري الزمالة بعد الدكتوراه قبل جبهة الخلاص الوطني.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics