Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

В этом видео мы продемонстрируем метод, при котором для анализа развивающихся мозга позвоночных в живых эмбрионов данио на одной резолюции ячейки с помощью конфокальной микроскопии. Это включает в себя метод, посредством которого мы вводим одноклеточного эмбриона полосатого данио, а затем смонтировать и изображение развивающегося мозга.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В этом видео мы продемонстрируем метод нашей лаборатории разработаны для анализа формы клеток изменения и перестановки требуется согнуть и сложить развивающихся данио мозга (Gutzman и др., 2008). Такой анализ дает новое понимание основных клеточной биологии, необходимые для развития 3D-структуры мозга позвоночных, а также значительно увеличивает нашу способность к обучению нейронных морфогенеза трубки. Эмбрионального мозга данио формируется, начиная с 18 часов после оплодотворения (ФВЧ), а желудочки в нейроэпителия надуваться. К 24 HPF, первые шаги нейронных морфогенеза трубки являются полными. Использование метода, описанного здесь, эмбрионов на стадии одной клетки вводят мРНК, кодирующей мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (memGFP). После инъекции и инкубации эмбриона, в настоящее время от 18 до 24 HPF, монтируется, перевернутый, в агарозном и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Следует отметить, что данио эмбрион прозрачной что делает его идеальной системой для флуоресцентной визуализации. Хотя наши анализы были направлены на средний мозг, задний мозг границы и задний мозг, этот метод может быть распространен для анализа любой регион данио на глубину 80-100 мкм.

Protocol

1. Подготовка мРНК для инъекций

  1. МРНК, используемых в этой процедуре расшифрованы с плазмидой, кодирующей CAAX-EGFP (memGFP) мРНК. Первый линеаризовать плазмиды в соответствии с Gutzman и др., 2008.
  2. Затем записать memGFP мРНК с использованием mMessage mMachine комплект.
  3. Развести в результате мРНК к 1μg/μl, Алиготе, и хранить при температуре -80 ° C.
  4. Подготовка литья под давлением в 1% агарозном с полосами шириной эмбрионов на одну ячейку стадии.
  5. За день до инъекции, созданная спаривания клетки разделяющая мужчин от женщин.
  6. В день инъекции, потяните капиллярных игл использованием съемника микропипетки подготовить для инъекций.

2. Потребители инъекционных мРНК

  1. В день инъекции, оттепель аликвоту 1μg/μl memGFP мРНК на льду.
  2. Развести мРНК 1:5 в воду, чтобы конечная концентрация 200ng/μl, и держать на льду.
  3. Нагрузка капиллярной иглой с 1 мкл подготовленных мРНК memGFP на 200ng/μl.
  4. Место загружены иглу в микроманипулятора придается газе microinjector.
  5. Отрегулируйте объемом впрыска до 1nl.
  6. Вытяните делителей на диких рыб типа создана в брачный клетки от предыдущего дня.
  7. Сбор эмбрионов, как только они проложены. Ориентировать их в форме инъекций агарозном покрыта зародыш среды (Уэстерфилд, 1995) с одной клетки на стороне от микроманипулятора.
  8. Inject через хорион и желток, что мРНК наносится непосредственно в одну ячейку. Inject примерно 50 эмбрионов в эксперименте. Не вводить, если ячейка разделена.
  9. Инкубируйте эмбрионов при 28 ° С в течение ночи в зачаточном состоянии среды

3. Монтаж и обработка изображений эмбрионов

  1. Для монтажа и изображения эмбрионов, удалить хориона щипцами из эмбрионов под стереомикроскопа за один час до времени достопримечательность.
  2. Подготовка слайдов для установки до 4-х эмбрионов.
    • Использование силиконовой смазкой для уплотнения вакуумных покровное на нижней специально разработанных 2 мм толщиной пластиковых слайдов с отверстием около 1 см в диаметре.
    • Заполните отверстие в слайд с 0,7% агарозы, и дать постоять около 20 минут или до закаленной
    • После агарозном укрепил, удалить небольшой плагин использовании 200 мкл наконечники для пипеток формировать цилиндрические отверстия, в которых для монтирования каждого эмбриона.
  3. Место эмбрионов на агарозном заполненный слайд при вскрытии микроскопом. Добавить 50 мкл tricaine (Уэстерфилд, 1995), чтобы обезболить эмбрионов.
  4. Используйте пинцет, чтобы положение эмбриона в цилиндрических отверстий в агарозном с мозгом или область интереса от основной покровное.
  5. Обложка эмбрионов в агарозном с другим покровное обеспеченных смазкой вакуумных силикона.
  6. Изображение эмбриона использованием перевернутой, люминесцентные, лазерное сканирование или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Изображение на 63x или выше, чтобы собирать изображения высокого разрешения отдельных клеток в течение нейроэпителия.
  7. Изображения экспортируются в виде файлов формата TIFF с LSM программного обеспечения и проанализированы с помощью Photoshop.

4. Представитель Результаты / Результаты

Показанный на рисунке 1 является представителем конфокальной образ 24 HPF данио нейроэпителия между средний мозг и задний мозг желудочков. Каждая ячейка имеет метку с мембраной GFP.


Рисунок 1. Живая конфокальной микроскопии в memGFP впрыском 24 эмбрионов данио HPF.
(А) нейроэпителия из 24 HPF эмбриона с каждой ячейки намеченных GFP. Регион отображаемого отделяет средний мозг и задний мозг желудочков (M, H соответственно), образуя средний мозг, задний мозг границы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видео мы продемонстрируем метод мРНК инъекции в одно эмбрионов данио клетки. Здесь мы используем мРНК, кодирующей мембраны ориентированных GFP на этикетке каждой ячейке. Затем показано, как монтировать и изображение развивающегося мозга в одной резолюции клетки. Этот метод позволил нам изучить новый тип ячейки меняют форму, базально-перетяжка, необходимых для формирования среднего мозга, заднего мозга границы (Gutzman и др., 2008). Подобный анализ других явлений, есть потенциал, чтобы значительно расширить наше понимание позвоночных морфогенеза и лежащий в основе клеточной биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Большое спасибо доктор Дженнифер Gutzman который первым разработал эту технику в Sive лаборатории. Спасибо также JB Зеленый в Dana-Farber института рака Boston, MA который любезно предоставил плазмиды, кодирующей CAAX-GFP мРНК. Конфокальной микроскопии было проведено в WM Keck Фонд фонда изображений Биологические на Уайтхеда. HS поддерживается NIHMH70926. Е. поддерживается NSF предварительно докторских стипендий.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics