חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה במעבדה שלנו פיתחה לנתח את צורת התא שינויים rearrangements נדרש לכופף ולקפל את המוח דג הזברה מתפתח (Gutzman et al, 2008). ניתוח כזה מאפשר הבנה חדשה של ביולוגיה של התא הבסיסי הדרוש לפיתוח של מבנה 3D של המוח החוליות, מגביר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד המורפוגנזה בצינור העצבי. המוח העוברי היא בצורת דג הזברה החל הפריה 18 שעות שלאחר (hpf) כמו החדרים בתוך neuroepithelium לנפח. עד hpf 24, השלבים הראשונים של המורפוגנזה בצינור העצבי הושלמו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, עוברים בשלב מסוים התא מוזרקים עם קידוד mRNA קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (memGFP). לאחר hpf הזרקת הדגירה, העובר, בין 18 ל 24 עכשיו, הוא רכוב, הפוך, ב agarose הדמיה על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש לציין כי העובר דג הזברה שקוף שהופך אותו אידיאלי עבור מערכת דימות פלואורסצנטי. בעוד ניתוחים שלנו התמקדו גבול למוח האחורי, המוח התיכון לבין למוח האחורי, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב לניתוח האזור כל דג הזברה עד לעומק של 8-10 מיקרומטר.

Protocol

1. הכנת ה-mRNA עבור הזרקה

  1. MRNA השתמשו בהליך זה הוא עיבד מ קידוד פלסמיד CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. ראשית linearize פלסמיד לפי Gutzman et al, 2008.
  2. ואז לתמלל mRNA memGFP באמצעות mMachine mMessage ערכת.
  3. לדלל את ה-mRNA שנוצר 1μg/μl, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C.
  4. הכן עובש הזרקת agarose של 1% עם נתיבים ברוחב של עוברים בשלב אחד את התא.
  5. יום לפני ההזרקה, להקים כלובי ההזדווגות הפרדת הזכר מן הנקבות.
  6. ביום של הזריקה, למשוך מחטים נימי באמצעות חולץ micropipette להתכונן ההזרקה.

2. הזרקת ה-mRNA

  1. ביום של הזריקה, להפשיר aliquot של mRNA memGFP 1μg/μl על הקרח.
  2. לדלל את ה-mRNA 01:05 במים לריכוז סופי של 200ng/μl, ולשמור על הקרח.
  3. טען את המחט נימי עם 1μl של mRNA memGFP מוכן ב 200ng/μl.
  4. מקום טעון מחט לתוך micromanipulator מצורף בנזין microinjector.
  5. התאם את עוצמת הזריקה כדי 1nl.
  6. משוך את חוצצים על דגים סוג בר להגדיר בכלובים זיווג מן היום הקודם.
  7. אסוף את העוברים ברגע שהם הניחו. אוריינט אותם עובש הזרקת agarose מכוסה על ידי בינוני העובר (Westerfield, 1995) עם תא בודד בצד הרחק micromanipulator.
  8. הזרק דרך סיסית ו חלמון כזה mRNA מופקד ישירות לתא בודד. להזריק כ 50 עוברים לכל ניסוי. אין להזריק אם התא חילק.
  9. עוברים דגירה על 28 ° C במשך הלילה בינוני העובר

3. הרכבה ועוברים הדמיה

  1. כדי לטעון את התמונה עוברי, להסיר את סיסית עם מלקחיים מן העוברים תחת stereomicroscope שעה אחת לפני נקודת הזמן של עניין.
  2. הכינו שקופית עבור הרכבה עד 4 עוברים.
    • השתמש ואקום גריז סיליקון לאטום coverslip על החלק התחתון של שקופית 2 מ"מ בעובי במיוחד פלסטיק עם חור בקוטר של כ 1cm.
    • ממלאים את החור שקופית עם agarose 0.7%, ולתת לעמוד כ -20 דקות או עד מוקשה
    • לאחר agarose יש הקרושה, להסיר תוסף קטן בעזרת פיפטה 200μl טיפים ליצירת חורים גליליים שבו לעלות כל העובר.
  3. מניחים את העוברים בשקופית agarose המלא תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 50μl של tricaine (Westerfield, 1995) כדי להרדים את העוברים.
  4. שימוש במלקחיים לתפקיד עוברים את החורים גלילי ב agarose עם המוח או באזור של עניין נגד coverslip הבסיסית.
  5. מכסים את העוברים על agarose עם coverslip נוסף מאובטח עם גריז סיליקון ואקום.
  6. תמונה העובר באמצעות הפוכה, פלורסנט, לייזר או סריקת דיסק ספינינג מיקרוסקופ confocal. תמונה ב 63x או יותר לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך neuroepithelium.
  7. תמונות מיוצאים כקובצי TIFF מתוך התוכנה LSM ונותחו באמצעות Photoshop.

4. תוצאות נציג / תוצאה

שמוצג באיור 1 היא תמונה confocal נציג neuroepithelium hpf 24 דג הזברה בין המוח התיכון, ואל החדרים למוח האחורי. כל תא מסומן עם GFP קרום הנכנס.


באיור 1. חיים הדמיה confocal של העובר memGFP-מוזרק hpf 24 דג הזברה.
(א) Neuroepithelium של עובר 24 hpf עם כל תא שהותוו על ידי ה-GFP. אזור צילמו מפריד בין המוח התיכון ואת החדרים למוח האחורי (ז, ח, בהתאמה), ויצרו את הגבול המוח התיכון, למוח האחורי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה הזרקת mRNA עוברי דג הזברה לתוך תא בודד. כאן, אנו משתמשים mRNA קידוד GFP קרום במיקוד לתייג כל תא. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד הר התמונה במוח המתפתח ברזולוציה של תא בודד. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד סוג חדש של שינוי צורת התא, ההתכווצות הבזליים, נדרש היווצרות גבול למוח האחורי, המוח התיכון (Gutzman et al, 2008). ניתוח דומה של תופעות אחרות יש פוטנציאל להרחיב באופן משמעותי את הבנתנו המורפוגנזה החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

תודה רבה ד"ר ג'ניפר Gutzman מי הראשון שפותח את הטכניקה הזו במעבדה אלימה. תודה גם JB גרין בבית דנה פרבר סרטן המכון בבוסטון, מסצ'וסטס, אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד CAAX-GFP-mRNA. הדמיה confocal נערך במתקן קק WM ביולוגית הדמיה הקרן ב וייטהד. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. EG הוא נתמך על ידי מענק NSF מראש דוקטורט.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics