共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

Biology

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Summary

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。

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Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

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Abstract

このビデオでは、我々の研究室が開発してゼブラフィッシュの脳(Gutzmanら、2008)曲げると折るために必要な細胞の形状の変更と再配置を分析するために開発した方法を示しています。このような分析は、脊椎動物の脳の三次元構造の開発に必要な基本的な細胞生物学の新たな理解物を得る、と大幅に神経管の形態形成を研究する我々の能力を向上させます。胚ゼブラフィッシュの脳は、神経上皮が膨らま内の心室として、18時間後に受精(HPF)で始まる形をしている。 24 HPFによって、神経管の形態形成の最初のステップは完了です。方法ここで説明を使用して、1細胞段階における胚をコードするmRNAの細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質(memGFP)を注入されています。注射やインキュベーション、胚、現在18〜24 HPF後、アガロースで、反転、マウントされ、共焦点顕微鏡で撮像。特に、ゼブラフィッシュの胚は、その蛍光イメージングのための理想的なシステムとなって透過的です。我々の分析は、中脳後脳境界と後脳に焦点を当てているが、この方法は80〜100μmの深さにゼブラフィッシュで任意の領域の分析のために拡張することができる。

Protocol

1。インジェクションのmRNAの準備

  1. この手順で使用されているmRNAがコードするプラスミドCAAX - EGFP(memGFP)mRNAから転写される。最初Gutzmanら、2008によるとプラスミドを線形化する。
  2. その後mMessage mMachineキットを使用してmemGFP mRNAを転写。
  3. -801μg/μl、分注し、およびストアに得られたmRNAを希釈℃を
  4. 一つの細胞の段階で胚の幅は、レーンと1%アガロースの射出成形金型を準備します。
  5. 注射の前日に、女性から男性を分離交尾ケージを設定します。
  6. 注射の日に、注射の準備をマイクロピペットプラーを使用してキャピラリー針を引き抜きます。

2。 mRNAを注入

  1. 注射の日に、氷上に1μg/μlmemGFPのmRNAのアリコートを解凍。
  2. 200ng/μlの最終濃度に水でmRNAが1:5に希釈し、氷上に置きます。
  3. 200ng/μlで準備memGFPのmRNAの1μlのでキャピラリー針をロードする。
  4. ガソリンインジェクターに接続されているマイクロマニピュレータにロードされた針を置きます。
  5. 1nlに注入量を調整します。
  6. 前日から交配のケージに設定野生型の魚で仕切りを引っ張る。
  7. とすぐにそれらが配置されるように胚を収集する。オリエントそれら離れてマイクロマニピュレータの側の単一細胞で胚の培地(ウェスター、1995)でカバーアガロースの射出成形金型インチ
  8. 絨毛膜とmRNAは単一のセルに直接堆積されるように、卵黄を介して注入する。実験ごとに約50の胚を注入する。セルが分割されている場合に注入しないでください。
  9. 28℃で一晩胚の培地でインキュベートする胚

3。マウントおよびイメージング胚

  1. 胚をマウントし、イメージに、興味のある時点の前に実体顕微鏡一時間で胚から鉗子で絨毛膜を除去。
  2. 4胚まで取り付けるためのスライドを準備します。
    • 直径約1cm穴を内蔵した特別設計の2ミリメートルの厚さのプラスチック製のスライドの下側にカバースリップを密封するために、シリコーン真空グリースを使用してください。
    • 0.7%アガロースでスライドの穴を埋める、と約20分または硬化するまで放置
    • アガロースが固化した後、それぞれの胚をマウントするに円筒状の穴を形成するために、200μlのピペットチップを使用して、小さなプラグを取り外します。
  3. 解剖顕微鏡下でアガロースを充填したスライド上に胚を置きます。胚を麻酔tricaine50μlの(ウェスター、1995)を追加します。
  4. 基本的なカバースリップに対する脳や関心領域とアガロースの円筒形の穴に胚を配置するために鉗子を使用してください。
  5. シリコン真空グリースで保護された別のカバースリップとアガロースの胚をカバーする。
  6. 反転、蛍光灯、レーザー走査型または回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて画像胚を。神経上皮内の単一セルの高解像度の画像を収集するために63x以上で画像。
  7. 画像は、LSMソフトウェアからのTIFFファイルとしてエクスポートし、Photoshopを使用して分析している。

4。代表的な結果/成果

図1に示すように、中脳と後脳の心室の間に24 HPFのゼブラフィッシュの神経上皮の代表的な共焦点画像です。各セルは、膜結合型GFPで標識されている。


図1。 memGFP注入24 HPFのゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングを生きる。
GFPによる概説、各セルで24 HPFの胚の(A)神経上皮。地域撮像さは中脳後脳境界を形成し、中脳と後脳の脳室(M、Hはそれぞれ)を分離。

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Discussion

このビデオでは、我々は単一細胞のゼブラフィッシュの胚へのmRNAの注入のための方法を示しています。ここでは、各セルにラベルを付けるために細胞膜をターゲットとしたGFPをコードするmRNAを使用してください。我々は、単一セルの分解能で脳の発達をマウントし、イメージする方法を示しています。このテクニックは、私たちは中脳後脳境界(Gutzmanら、2008)の形成に必要な細胞の形状変化、基底くびれ、新しいタイプを検討することができました。他の現象の同様の分析が大幅に脊椎動物の形態形成と基礎細胞生物学の我々の理解を拡大する可能性を秘めています。

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Acknowledgements

第一Siveラボでこのテクニックを開発した博士ジェニファーGutzmanに感謝します。親切にコードするプラスミドCAAX - GFPのmRNAを提供Dana - Farber癌研究所ボストン、マサチューセッツ州でもJBグリーンのおかげで。共焦点イメージングは​​、ホワイトヘッドでWMケック財団生体イメージング施設で行われた。 HSはNIHMH70926によってサポートされています。 EGは、NSFの事前博士フェローシップでサポートされています。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

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