En direct l'imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Biology

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Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

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Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

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Abstract

Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode de notre laboratoire a développé pour analyser les changements de forme des cellules et des réarrangements nécessaire pour courber et plier le cerveau de poisson zèbre en développement (Gutzman et al, 2008). Une telle analyse permet une nouvelle compréhension de la biologie cellulaire sous-jacentes nécessaires au développement de la structure 3D du cerveau des vertébrés, et augmente considérablement notre capacité d'étudier la morphogenèse du tube neural. Le cerveau de poisson zèbre embryonnaire est façonné à partir de 18 heures après fécondation (HPF) et les ventricules dans le neuroépithélium gonfler. Par 24 HPF, les étapes initiales de la morphogenèse du tube neural sont complets. En utilisant la méthode décrite ici, des embryons au stade une cellule sont injectés avec l'ARNm codant la membrane-cible la protéine fluorescente verte (memGFP). Après l'injection et l'incubation, l'embryon, maintenant entre 18 et 24 HPF, est monté sur le dos dans l'agarose et imagée par microscopie confocale. Notamment, l'embryon de poisson zèbre est transparent ce qui en fait un système idéal pour l'imagerie de fluorescence. Bien que nos analyses ont porté sur la frontière du mésencéphale-rhombencéphale et le rhombencéphale, cette méthode pourrait être étendue à l'analyse de toutes les régions du poisson-zèbre à une profondeur de 80-100 um.

Protocol

1. Préparation de l'ARNm pour injection

  1. L'ARNm utilisés dans cette procédure est transcrit à partir d'un plasmide codant pour CAAX-EGFP (memGFP) ARNm. D'abord linéariser le plasmide selon Gutzman et al, 2008.
  2. Puis de transcrire l'ARNm memGFP utilisant le kit mMessage mMachine.
  3. Diluer l'ARNm résultant d'1μg/μl, aliquote, et conserver à -80 ° C.
  4. Préparer un moule d'injection de 1% d'agarose avec des voies de la largeur d'embryons au stade une cellule.
  5. Le jour avant l'injection, mis en place des cages d'accouplement qui sépare le mâle de la femelle.
  6. Le jour de l'injection, tirez aiguilles capillaires aide d'un extracteur micropipette pour se préparer à l'injection.

2. L'injection de l'ARNm

  1. Le jour de l'injection, le dégel d'une partie aliquote de l'ARNm memGFP 1μg/μl sur la glace.
  2. Diluer l'ARNm 01h05 dans l'eau à une concentration finale de 200ng/μl, et de garder sur la glace.
  3. Chargez l'aiguille capillaire avec 1 microlitre de l'ARNm memGFP préparé à 200ng/μl.
  4. Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à un microinjecteur alimentés au gaz.
  5. Réglez le volume d'injection pour 1NL.
  6. Tirez les diviseurs sur les poissons de type sauvage mis en place dans des cages d'accouplement de la journée précédente.
  7. Recueillir les embryons dès qu'ils sont pondus. Orientez-les dans le moule d'injection d'agarose couverts par moyen d'embryons (Westerfield, 1995) avec la cellule unique sur le côté éloigné de la micromanipulateur.
  8. Injecter dans le chorion et le jaune de telle sorte que l'ARNm est déposé directement dans la cellule unique. Injecter environ 50 embryons par expérience. Ne pas injecter si la cellule a divisé.
  9. Embryons Incuber à 28 ° C pendant la nuit dans le milieu de l'embryon

3. Montage et embryons d'imagerie

  1. Pour monter l'image et les embryons, supprimer le chorion avec une pince à partir des embryons sous un stéréomicroscope, une heure avant le point de temps d'intérêt.
  2. Préparer une diapositive pour le montage jusqu'à 4 embryons.
    • Utilisez de la graisse à vide de silicone pour sceller une lamelle sur la partie inférieure d'une lame en plastique 2mm d'épaisseur spécialement conçu avec un trou d'environ 1cm de diamètre.
    • Remplissez le trou dans la diapositive avec 0,7% d'agarose, et laisser reposer environ 20 minutes ou jusqu'à durcis
    • Une fois que l'agarose solidifié, enlever un petit bouchon en utilisant 200 pl embouts de pipette pour former des trous cylindriques dans lesquels de monter chaque embryon.
  3. Placer les embryons sur la lame d'agarose-remplie sous un microscope à dissection. Ajouter 50 pl de tricaïne (Westerfield, 1995) pour anesthésier les embryons.
  4. Utilisez une pince pour la position de l'embryon dans les trous cylindriques dans l'agarose avec le cerveau ou la région d'intérêt contre la lamelle sous-jacent.
  5. Couvrir les embryons dans l'agarose avec une autre lamelle sécurisé avec de la graisse à vide de silicone.
  6. Image de l'embryon en utilisant une inversion, fluorescent, balayage laser ou la filature de microscope confocal à disque. Image à 63x ou plus pour recueillir des images haute résolution des cellules individuelles au sein du neuroépithélium.
  7. Les images sont exportées sous forme de fichiers TIFF à partir du logiciel LSM et analysées à l'aide de Photoshop.

4. Résultats Représentant / résultat

Montre la figure 1 est une image représentative confocale d'un neuroépithélium 24 zebrafish HPF entre le mésencéphale et rhombencéphale ventricules. Chaque cellule est étiqueté avec membranaires GFP.


Figure 1. En direct d'imagerie confocale d'un memGFP-injecté 24 embryons de poissons zèbres HPF.
(A) d'un embryon neuroépithélium 24 HPF, chaque cellule étant définies par la GFP. Région imagé sépare le mésencéphale et rhombencéphale ventricules (M, H, respectivement), formant la limite du mésencéphale-rhombencéphale.

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Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour l'injection d'ARNm dans les embryons de poissons zèbres seule cellule. Ici, nous utilisons ARNm codant pour la GFP membrane cible d'étiqueter chaque cellule. Nous avons ensuite montrer comment monter et l'image du cerveau en développement à la résolution seule cellule. Cette technique nous a permis d'étudier un nouveau type de cellules changent de forme, la constriction basale, nécessaire à la formation de la frontière du mésencéphale-rhombencéphale (Gutzman et al, 2008). Une analyse similaire des autres phénomènes a le potentiel d'augmenter considérablement notre compréhension de la morphogenèse des vertébrés et de la biologie cellulaire sous-jacent.

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Acknowledgements

Un grand merci à la Dre Jennifer Gutzman qui a le premier développé cette technique dans le laboratoire Sive. Merci aussi à JB vert au Boston Dana-Farber Cancer Institute, MA qui a aimablement fourni le plasmide codant pour la GFP CAAX-ARNm. L'imagerie confocale a été réalisée à l'installation de WM Keck Foundation Imaging biologique au Whitehead. SH est soutenue par NIHMH70926. EG est soutenu par une provision de pré-doctorat.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

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