Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denna video visar vi en metod för att analysera utvecklingen av ryggradsdjur hjärnan i levande zebrafisk embryon till en enda cell upplösning av konfokalmikroskopi. Detta inkluderar den metod som vi injicerar encelliga zebrafisk embryo och därefter montera och bild den växande hjärnan.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I denna video visar vi metoden vårt laboratorium har utvecklats för att analysera de cellförändringar form och omflyttningar som krävs för att böja och vika utveckla zebrafisk hjärnan (Gutzman et al, 2008). En sådan analys ger en ny förståelse av de underliggande cellbiologi som krävs för utveckling av 3D-strukturen för ryggradsdjur hjärnan, och betydligt ökar vår förmåga att studera neuralrörsdefekter morfogenes. Den embryonala zebrafisk hjärnan är formad som börjar vid 18 timmar efter befruktning (HPF) som ventriklarna inom neuroepithelium blåsa. Genom 24 HPF, de första stegen i neuralrörsdefekter morfogenes är kompletta. Med hjälp av metoden som beskrivs här, är embryon till en cell scenen injiceras med mRNA kodning membran riktade grönt fluorescerande protein (memGFP). Efter injektion och inkubation, embryot, nu mellan 18 och 24 HPF, är monterad, inverterad, i agaros och avbildat av konfokalmikroskopi. Noterbart är zebrafisk embryot transparent vilket gör det till ett idealiskt system för lysrör avbildning. Medan våra analyser har fokuserat på mellanhjärnan-hindbrain gränsen och hindbrain, skulle denna metod förlängas för analys av en region i zebrafisk till ett djup av 80-100 ìm.

Protocol

1. Förbereda mRNA för injektion

  1. MRNA används i detta förfarande är transkriberas från en plasmid kodning CAAX-EGFP (memGFP) mRNA. Först linjärisera plasmiden enligt Gutzman et al, 2008.
  2. Sedan transkribera memGFP mRNA med mMessage mMachine kit.
  3. Späd den resulterande mRNA 1μg/μl, uppmätt, och förvara vid -80 ° C.
  4. Förbered en injektion mögel på 1% agaros med körfält bredden av embryon i en cell skede.
  5. Dagen före injektionen, inrätta parning burar separera hanen från honorna.
  6. På dagen för injektionen, dra kapillär nålar med hjälp av en mikropipett avdragare för att förbereda för injektion.

2. Injektion av mRNA

  1. På dagen för injektionen, tina en alikvot av 1μg/μl memGFP mRNA på is.
  2. Späd mRNA 1:05 i vatten till en slutlig koncentration av 200ng/μl, och hålla på is.
  3. Ladda kapillär nålen med 1μl preparerade memGFP mRNA vid 200ng/μl.
  4. Placera laddade nål i ett mikromanipulator ansluten till en gasdriven microinjector.
  5. Justera injektionsvolymen till 1nl.
  6. Dra avdelare på vilda typen fisk inrättades parning burar från föregående dag.
  7. Samla embryon så snart de läggs. Orientera dem i agarosen injektion mögel som omfattas av embryo medium (Westerfield, 1995) med en enda cell på sidan bort från mikromanipulator.
  8. Injicera genom chorion och äggulan så att mRNA sätts in direkt i en enda cell. Injicera ca 50 embryon per försök. Injicera inte om cellen har delat.
  9. Inkubera embryon vid 28 ° C över natten i embryot medelstora

3. Montering och Embryon Imaging

  1. Att montera och bild embryona, ta bort chorion med pincett från embryon under ett stereomikroskop en timme före tidpunkten av intresse.
  2. Förbered en bild för montering upp till 4 embryon.
    • Använd fett silikon vakuum för att täta ett täckglas på undersidan av en specialdesignad 2mm tjock plast bild med ett hål med ca 1 cm i diameter.
    • Fyll hålet i bilden med 0,7% agaros, och låt stå ca 20 minuter eller tills härdade
    • När agarosen stelnat, ta bort en liten plugg med 200μl pipettspetsar att bilda cylindriska hål på sig att montera varje embryo.
  3. Placera embryon på agarosen fyllda glider under en dissekera mikroskop. Tillsätt 50μl av tricaine (Westerfield, 1995) att söva embryona.
  4. Använd pincett för att placera embryon i den cylindriska hål i agarosen med hjärnan eller regionen intresse mot den underliggande täckglas.
  5. Täck embryona i agaros med en annan täckglas säkrad med silikon vakuum fett.
  6. Bild ett embryo med ett inverterat, lysrör, laser-scanning eller spinning disk konfokalmikroskop. Bild på 63x eller högre för att samla in högupplösta bilder av enstaka celler i neuroepithelium.
  7. Bilderna exporteras som TIFF-filer från LSM programvara och analyserades med hjälp av Photoshop.

4. Representativa resultat / Utfall

Visas i figur 1 är en representant konfokala bild av en 24 HPF zebrafisk neuroepithelium mellan mellanhjärnan och ventriklarna hindbrain. Varje cell är märkt med membranbundna GFP.


Figur 1. Live konfokal avbildning av en memGFP-injicerade 24 HPF zebrafisk embryo.
(A) Neuroepithelium av en 24 HPF embryo med varje cell anges av GFP. Region avbildade separerar mitthjärnan och ventriklarna hindbrain (M, H respektive), bildar mellanhjärnan-hindbrain gränsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna video visar vi en metod för mRNA injektion i enstaka embryon cell zebrafisk. Här använder vi mRNA som kodar för ett membran riktade GFP att etikettera varje cell. Vi visar sedan hur man monterar och bild den växande hjärnan på en enda cell upplösning. Denna teknik har gett oss möjlighet att studera en ny typ av celler formen förändring, basala sammandragning, som krävs för bildandet av mitthjärnan-hindbrain gränsen (Gutzman et al, 2008). Liknande analys av andra fenomen har potential att kraftigt öka vår förståelse av ryggradsdjur morfogenes och den underliggande cellbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Ett stort tack till Dr Jennifer Gutzman som först utvecklade denna teknik i Sive labbet. Tack även till JB Green på Dana-Farber Cancer Institute i Boston, MA som välvilligt lämnat plasmiden kodning CAAX-GFP mRNA. Den konfokala bildhantering genomfördes på WM Keck stiftelsen biologisk avbildning Facility vid Whitehead. HS stöds av NIHMH70926. EG stöds av en NSF doktorander gemenskap.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics