Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Biology

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Summary

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

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Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

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Abstract

Neste vídeo, demonstramos o método de nosso laboratório tem desenvolvido para analisar as mudanças de células forma e rearranjos necessários para dobrar e dobrar o cérebro zebrafish em desenvolvimento (Gutzman et al, 2008). Essa análise permite uma nova compreensão da biologia das células subjacentes necessários para o desenvolvimento da estrutura 3D do cérebro de vertebrados, e aumenta significativamente a nossa capacidade de estudar a morfogênese do tubo neural. O cérebro zebrafish embrionárias é moldada a partir das 18 horas pós-fertilização (hpf) como os ventrículos dentro do neuroepitélio inflar. Por 24 hpf, os passos iniciais da morfogênese do tubo neural estão completos. Usando o método descrito aqui, embriões em fase de uma célula são injetados com a codificação do mRNA membrana-alvo a proteína verde fluorescente (memGFP). Após a injeção e de incubação, o embrião, agora entre 18 e 24 hpf, é montado, invertido, em agarose e visualizados por microscopia confocal. Nomeadamente, o embrião do zebrafish é transparente tornando-se um sistema ideal para imagens fluorescentes. Enquanto nossas análises se concentraram na fronteira mesencéfalo e rombencéfalo o rombencéfalo, este método pode ser estendido para a análise de qualquer região do peixe-zebra a uma profundidade de 8-10 mM.

Protocol

1. Preparando o mRNA para Injeção

  1. O mRNA utilizado neste procedimento é transcrito a partir de um plasmídeo CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. Primeira linearizar o plasmídeo de acordo com Gutzman et al, 2008.
  2. Em seguida, transcrever mRNA memGFP usando o mMessage mMachine kit.
  3. Diluir o mRNA resultante para 1μg/μl, alíquota, e armazenar a -80 ° C.
  4. Prepare um molde de injeção de agarose 1% com faixas da largura de embriões no estágio uma célula.
  5. No dia antes da injeção, criada gaiolas de acasalamento separar o macho das fêmeas.
  6. No dia da injeção, agulhas de puxar capilar utilizando um extrator micropipeta para se preparar para injeção.

2. Injetando o mRNA

  1. No dia da injeção, descongelar uma alíquota de 1μg/μl mRNA memGFP no gelo.
  2. Diluir o mRNA 1:5 em água a uma concentração final de 200ng/μl, e manter em gelo.
  3. Carga a agulha capilar com 1μl de mRNA memGFP preparado em 200ng/μl.
  4. Lugar carregado de agulha em um micromanipulador anexado a um microinjetor movidos a gás.
  5. Ajustar o volume de injeção para 1nl.
  6. Puxe os divisores de peixes do tipo selvagem criado em gaiolas de acasalamento do dia anterior.
  7. Coletar os embriões logo que são colocados. Orientá-los no molde de injeção agarose coberta por meio de embrião (Westerfield, 1995) com a única célula do lado longe do micromanipulador.
  8. Injetar através do córion e gema de tal forma que o mRNA é depositado diretamente em uma única célula. Injetar cerca de 50 embriões por experiência. Não injetar se a célula tem dividido.
  9. Embriões incubar a 28 ° C durante a noite em meio embrião

3. Montagem e embriões de imagem

  1. Para a montagem ea imagem dos embriões, remova o córion com uma pinça dos embriões sob um estereomicroscópio uma hora antes do ponto de tempo de interesse.
  2. Prepare um slide para montagem de até quatro embriões.
    • Use graxa de vácuo silicone para selar uma lamela na parte inferior de uma lâmina de plástico especialmente concebidos dois milímetros de espessura, com um buraco de aproximadamente 1 centímetro de diâmetro.
    • Preencher o buraco no slide com agarose 0,7%, e deixe repousar cerca de 20 minutos ou até que endureceu
    • Uma vez que a agarose solidificou, remover uma pequena ficha usando 200μl ponteiras para formar buracos cilíndrico em que a montagem de cada embrião.
  3. Coloque os embriões no slide cheio de agarose sob um microscópio de dissecação. Adicionar 50μl de tricaina (Westerfield, 1995) para anestesiar os embriões.
  4. Use uma pinça para posicionar os embriões nos buracos cilíndricos no agarose com o cérebro ou região de interesse contra a lamela subjacente.
  5. Cobrir os embriões no agarose com outra lamínula fixada com graxa de silicone a vácuo.
  6. Imagem do embrião usando uma invertida, fluorescente, laser-scanning ou spinning microscópio confocal de disco. Imagem em 63x ou superior para coletar imagens de alta resolução de células individuais dentro do neuroepitélio.
  7. As imagens são exportadas como arquivos TIFF a partir do software LSM e analisados ​​utilizando Photoshop.

4. Resultados representante / Resultado

Mostrado na Figura 1 é uma imagem representativa de um confocal neuroepitélio zebrafish 24 hpf entre o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos. Cada célula é marcada com GFP ligada à membrana.


Figura 1. Vivem de imagem confocal de um memGFP injetado embrião zebrafish 24 hpf.
(A) neuroepitélio de um embrião de 24 hpf com cada célula delineada pelo GFP. Região fotografada separa o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos (M, H, respectivamente), formando a fronteira mesencéfalo rombencéfalo.

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Discussion

Neste vídeo, demonstramos um método para injeção de mRNA em embriões de peixe-zebra única célula. Aqui, usamos mRNA que codifica uma membrana GFP-alvo para rotular cada célula. Nós, então, demonstrar como montar e imagem do cérebro em desenvolvimento na resolução única célula. Esta técnica permitiu-nos a estudar um novo tipo de célula mudar de forma, a constrição basal, necessária para a formação da fronteira mesencéfalo rombencéfalo (Gutzman et al, 2008). Análise semelhante de outros fenômenos tem o potencial para expandir significativamente a nossa compreensão da morfogênese vertebrados e da biologia da célula subjacente.

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Acknowledgements

Muito obrigado a Dr. Jennifer Gutzman quem primeiro desenvolveu essa técnica no laboratório Sive. Graças também ao JB Verde no Dana-Farber Cancer Institute em Boston, MA que gentilmente forneceu o plasmídeo CAAX-GFP mRNA. A imagem confocal foi realizada na Fundação WM Keck Facilidade de imagem Biológicas da Whitehead. HS é suportada por NIHMH70926. EG é apoiado por uma bolsa NSF pré-doutoramento.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

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