人类胰岛的分离:第二部分:人类胰岛的分离纯化及文化

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

实现高​​品质和适当数量的人类胰岛是胰岛移植成功的突出的先决条件之一。在这个视频中,我们描述一步一步人类胰岛隔离(第二部分:人类胰岛的纯化和文化)的程序,采用改良的自动方法。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

1型糖尿病的管理负担,既要对个人和社会,每年耗资超过100亿美元。尽管血糖监测和新的胰岛素制剂的广泛使用,许多人仍然发展毁灭性的继发性并发症。胰岛移植可以恢复接近正常的糖尿病患者血糖控制

Protocol

1。胰岛的分离纯化

  1. 要启动胰岛的纯化过程,加载的COBE袋,所有的管子钳,除了绿管,并设置速度到1500超到0。
  2. 在引擎盖成立泵和梯度烧杯和收集管连接到绿管。
  3. 现在可以开始加载聚蔗糖1.100:推“旋转”,然后添加110毫升聚蔗糖1.100前烧杯,并启动水泵,以负载的COBE袋。由于聚蔗糖加载,按超,停泵,松开泵的扬程,并设置超出速度100。
  4. 当聚蔗糖达到烧杯中,所有空气管,泵头重新钳开除。设置到3000的转速,超出速度为0。
  5. 现在,准备装载前的烧杯中倒入沉重的梯度梯度。稍微松开钳之间的两个烧杯,以消除任何空气。然后倒入后面的烧杯中的光线梯度。
  6. 打开磁力搅拌器上,按“旋转”的COBE机上,取出钳管连接两个烧杯,直观地验证,重工业和轻工业的梯度混合。
  7. 梯度一旦开始搅拌,打开离心机。等待一分钟,然后打开泵负载的混合梯度。
  8. 要加载的组织让跑在前面的烧杯中低梯度,但没有足够低,让空气进入装载管,然后reclamp管连接烧杯和负载的组织。
  9. 继续添加其他组织。然后洗管,洗涤液50毫升举行组织,并用它来洗前烧杯。
  10. 作为最后的组织进入囊中,同时停泵,松开在泵头,和钳管袋以上。继续离心5分钟。
  11. 虽然离心继续,带来了12个收集管罩,松开帽子。将收集管,黄管,并放置到无菌收集尖锥形管1。然后松开黄色管,夹绿管。
  12. 当旋转结束时,慢慢提高到100 Superout。收集管1 150毫升。然后收集管2-12 30毫升(200-230毫升)。
  13. 一旦收集完成后,按下“停止”的COBE。现在已经结束净化,胰岛,可评估和培养。

2。采样和文化

  1. 收集纯化胰岛分数后,取出的12个收集管中的每一个样品,并用双硫腙染色。染色层含有高纯度低纯度的胰岛,胰岛细胞与层。
  2. 高和低纯度的组织和游泳池,每年收集。
  3. 自旋和洗两次澡。第二次洗涤后,将每250毫升的量,最后洗媒体。
  4. 为了评估汇总分数开始汇总分数和一个1 ml样品从低到两个1毫升样品。每1ml样品转移到一个圆锥形含9毫升洗涤液管。
  5. 然后将1毫升每15毫升管计数盘。检查和计数细胞,在显微镜下。
  6. 后计数细胞计算需要文化的胰岛,使用下列公式烧瓶号码:(总的EIN /十进制胰岛纯度)/(30,000元烧瓶的EIN)。例如,10万个胰岛,纯度90%,是4烧瓶培养。
  7. 传输T175烧瓶和文化的小岛在37˚C和5% 二氧化碳培养箱。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

尽管在人胰岛分离技术方面取得了长足的进步,胰岛产量仍充满变数和不可预知的。净化消化胰腺组织移植成功的酶消化后的恢复足够岛大规模的关键。 UIC的净化方法的建议,因为优越的高纯度的人类胰岛复苏,通过使用这种方法来证明。此外,可装载高达50毫升的消化组织进行净化处理运行一个单一的COBE,从而最大限度地减少缺血相关的人类胰岛的损伤,单独使用的总时间缩短。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

胰岛细胞资源中心美国国立卫生研究院授予(05-003 RFA - RR),克里斯托弗基金会,Efroymson基金会,和泰乐基金会成立在芝加哥伊利诺伊大学以及支持。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics