De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Biology

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Summary

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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Abstract

Gestión de la diabetes tipo 1 es una carga, tanto para el individuo y la sociedad, con un costo de más de 100 millones de dólares anuales. A pesar del uso generalizado de la monitorización de la glucosa y las nuevas formulaciones de insulina, muchas personas aún se desarrollan devastadoras complicaciones secundarias. El trasplante de islotes pancreáticos puede restaurar un control casi normal a la glucosa en pacientes diabéticos

Protocol

1. La purificación de los islotes

  1. Para iniciar el procedimiento de purificación de islotes, la carga de la bolsa de COBE, pinza de todos los tubos, excepto el tubo verde, y establecer la velocidad a 1.500 y la súper a 0.
  2. En la capilla establecer los vasos de la bomba y el gradiente y conectar la tubería de recogida en el tubo verde.
  3. Ahora la carga de la Ficoll 1,100 puede comenzar: push "giro" a continuación, añadir 110 ml de Ficoll 1.100 en el vaso delante, y arrancar la bomba para cargar la bolsa de COBE. A medida que el Ficoll se ha cargado, pulse súper a cabo, parar la bomba, despinzar la cabeza de la bomba y ajustar la velocidad de súper y 100.
  4. Cuando el Ficoll alcanza el vaso y todo el aire es expulsado de la tubería, re-clamp en el cabezal de la bomba. Ajustar la velocidad de giro de 3.000, y la velocidad de súper a 0.
  5. Ahora se preparan para cargar los gradientes vertiendo el gradiente pesada en el vaso principal. Ligeramente la liberación de la abrazadera entre los dos vasos para eliminar el aire. A continuación, vierta el gradiente de luz en el vaso de la espalda.
  6. Encienda el agitador magnético, pulse "giro" en la máquina de COBE, quitar la pinza del tubo que conecta los dos vasos, y verificar visualmente que los gradientes pesadas y ligeras se están mezclando.
  7. Una vez que los gradientes inició la mezcla, a su vez en la centrífuga. Espere un minuto, y vuelva a encender la bomba para cargar los gradientes de mezcla.
  8. Para cargar el tejido que el gradiente de agotarse en el vaso delante, pero no lo suficientemente baja como para permitir la entrada de aire en el tubo de carga, entonces reclamp el tubo que conecta los vasos y el tejido de carga.
  9. Continúe agregando el resto de los tejidos. Luego lave el tubo que contenía el tejido con 50 ml de solución de lavado, y lo utilizan para lavar el vaso principal.
  10. Como el último de los tejidos entra en la bolsa, al mismo tiempo detener la bomba, despinzar en el cabezal de la bomba y pinza de la línea por encima de la bolsa. Siguen centrifugar durante 5 minutos.
  11. Mientras continúa la centrifugación, traer los 12 tubos de recogida de la capota y aflojar la gorra. Conecte el tubo de recogida en el tubo de color amarillo, y coloque la punta de recogida estéril en un tubo cónico. Luego despinzar el tubo de color amarillo, y la abrazadera del tubo verde.
  12. Cuando el giro termina, levante lentamente Superout a 100. Recoger 150 ml en el tubo 1. A continuación, recoger 30 ml en tubos de 2-12 (200-230 ml).
  13. Una vez que la colección está completa, pulse "STOP" en el COBE. Ahora que ha terminado la purificación, los islotes pueden ser evaluados y culta.

2. Muestreo y la cultura

  1. Después de recoger las fracciones purificadas islotes, extraer una muestra de cada uno de los 12 tubos de recogida y se tiñen con ditizona. La tinción se muestran cuales son las capas contienen islotes de alta pureza frente a las capas con islotes de baja pureza.
  2. Obtener tejido de alta pureza y baja y la piscina cada conjunto.
  3. Giro y lavar dos veces. Tras el segundo lavado, llevar el volumen de cada una de 250 ml con medio de lavado final.
  4. Para evaluar las fracciones agrupadas comenzar por tomar dos muestras de 1 ml desde lo alto de las fracciones en común y un 1 ml de muestra de la baja. Transfiera cada muestra de 1 ml en un tubo cónico que contiene 9 ml de solución de lavado.
  5. A continuación, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a un plato de conteo. Examinar y contar las células en el microscopio.
  6. Después de contar las células de calcular el número de frascos necesarios para la cultura de los islotes mediante la siguiente fórmula: (EIN total / pureza de los islotes en decimal) / (30000 EIN por frasco). Por ejemplo, 100.000 islotes con un 90% de pureza se cultivan en cuatro frascos.
  7. La transferencia de los islotes para T175 frascos y la cultura en un 37 ˚ C y 5% de CO 2 incubadora.

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Discussion

A pesar de importantes avances en las técnicas de aislamiento de islotes humanos, el rendimiento de los islotes siguen siendo muy variable e impredecible. Purificación del tejido pancreático digieren es crucial para recuperar una masa suficiente isla después de la digestión enzimática con éxito para el trasplante. El método de purificación de la UIC se recomienda debido a una recuperación superior de los islotes de alta pureza se demostró mediante el uso de este método. Por otra parte, hasta 50 ml de tejido digerido se puede cargar en una sola corrida de Cobe para la purificación, lo que reduce la isquemia asociada a lesiones de los islotes humanos, acortando el tiempo total utilizado en el aislamiento.

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Acknowledgements

Con el apoyo de la fundación de la Universidad de Illinois en Chicago, así como células de los islotes del Centro de Recursos NIH (RFA-05-003 RR), la Fundación Christopher, la Fundación Efroymson, y la Fundación Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

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