Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Biology

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Summary

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp. (27), e1343, doi:10.3791/1343 (2009).

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Abstract

Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l'individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all'anno. Nonostante l'uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici

Protocol

1. Purificazione di isolotti

  1. Per avviare la procedura di purificazione isolotto, caricare la borsa COBE, morsetto tutti i tubi, tranne il tubo verde, e impostare la velocità di 1.500 e il super fuori a 0.
  2. Nel cofano impostare la pompa e bicchieri gradiente e collegare il tubo di raccolta al tubo verde.
  3. Ora il caricamento del Ficoll 1,100 può iniziare: spingere "spin", quindi aggiungere 110 ml di Ficoll 1,100 al bicchiere davanti, e avviare la pompa per caricare il sacchetto COBE. Mentre il Ficoll è caricato, premere super-out, fermare la pompa, sbloccaggio la testa della pompa e impostare la super velocità verso 100.
  4. Quando il Ficoll raggiunge il bicchiere e tutta l'aria viene espulsa dai, tubi ri-clamp a testa della pompa. Impostare la velocità di rotazione a 3.000, e la velocità fuori super 0.
  5. Ora si preparano a caricare le pendenze versando il gradiente pesante nel becher anteriore. Leggermente rilasciare la pinza tra i due bicchieri per rimuovere l'aria. Versare quindi il gradiente di luce nel becher schiena.
  6. Accendere l'agitatore magnetico, premere "girare" sulla macchina COBE, rimuovere la pinza dal tubo che collega i due bicchieri, e verificare visivamente che i gradienti pesanti e leggeri sono miscelazione.
  7. Una volta iniziate le pendenze di miscelazione, accendere la centrifuga. Attendere un minuto, quindi accendere la pompa per caricare il gradienti di miscelazione.
  8. Per caricare il tessuto lasciare che il gradiente di esaurirsi nel bicchiere davanti, ma non sufficientemente basso per permettere all'aria di entrare nel tubo di carico, poi reclamp il tubo di collegamento alla bicchieri e caricare il tessuto.
  9. Continuare ad aggiungere il resto del tessuto. Quindi lavare il tubo che tiene il tessuto con 50 ml di soluzione di lavaggio, e utilizzarla per lavare il bicchiere davanti.
  10. Come l'ultimo del tessuto entra nella borsa, allo stesso tempo fermare la pompa, sbloccaggio alla testa della pompa, pinza e tubo sopra il sacchetto. Continuare a centrifugare per 5 minuti.
  11. Mentre centrifugazione continua, portare il 12 tubi di raccolta alla cappa e allentare i loro berretti. Collegare il tubo di raccolta al tubo giallo e posizionare la punta sterile raccolta nel tubo conico 1. Poi sbloccaggio del tubo giallo, e bloccare il tubo verde.
  12. Quando il giro finisce, sollevare lentamente Superout a 100. Raccogliere 150 ml in tubo 1. Poi raccogliere in provette da 30 ml 2-12 (200-230 ml).
  13. Una volta che la raccolta è completa, premere "STOP" sulla COBE. Ora che la purificazione è finita, le isole possono essere valutati e colto.

2. Campionamento e cultura

  1. Dopo aver raccolto le frazioni purificate isolotti, rimuovere un campione da ciascuno dei 12 tubi di raccolta e la macchia con ditizone. La colorazione mostrerà quali sono strati contenenti isolotti di elevata purezza vs strati con isolotti bassa purezza.
  2. Raccogliere il tessuto ad alta purezza e bassa e la piscina ogni insieme.
  3. Spin e lavare due volte. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume di ciascuna a 250 ml con i media lavaggio finale.
  4. Per valutare le frazioni in pool inizia prendendo due campioni da 1 ml dall'alto delle frazioni messe in comune e un 1 ml di campione dal basso. Trasferire 1 ml di ogni campione in una provetta conica contenente 9 ml di soluzione di lavaggio.
  5. Poi trasferire 1 ml da ciascuna provetta 15 ml di un piatto di conteggio. Esaminare e contare le cellule al microscopio.
  6. Dopo il conteggio delle cellule calcolare il numero di flaconi necessari per cultura gli isolotti con la seguente formula: (EIN totale / purezza di isolotti in decimale) / (30.000 EIN per cilindro). Per esempio, 100.000 isole con il 90% di purezza sono coltivate in 4 fiaschi.
  7. Trasferire le isolette di T175 fiaschi e cultura in un 37 ˚ C e 5% CO 2 incubatore.

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Discussion

Nonostante significativi progressi nelle tecniche di isolamento delle isole umana, resa isolotto rimangono estremamente variabile e imprevedibile. Purificazione del tessuto pancreatico digerito è fondamentale per recuperare una sufficiente massa isola dopo il successo digestione enzimatica per il trapianto. Il metodo di purificazione UIC è raccomandato farlo poiché un recupero superiore di isole umane ad alta purezza è stato dimostrato utilizzando questo metodo. Inoltre, fino a 50 ml di tessuto digerito possono essere caricati in un Cobe singola corsa per la depurazione, minimizzando così l'ischemia associata lesione delle isole umane riducendo il tempo totale usato in isolamento.

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Acknowledgements

Supportato da fondazione presso la University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule insulari Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
Cobe 2991 Cell Processor equipment Gambro. BCT 2556 islet purification
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
COBE bag disposable equipment O.R. Solution 66707003
T175 culture flask disposable equipment Sarstedt Ltd 83.1812.500
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
Ficoll 1.100 reagent Bichrom AG L6155
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Final wash/Culture Medium reagent Mediatech, Inc. 99-785-CV
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
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  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
  9. Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).

Comments

1 Comment

  1. dear jove:
    how can I calculat the density of ficoll solution when I dillute ficoll powder in water with different percentages?forexample ficol ²3%

    Reply
    Posted by: mahvash h.
    June 22, 2009 - 4:44 AM

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