慢病毒生产

Published 10/02/2009
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Biology

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Summary

为了使慢病毒,DNA载体转染到人293细胞。收获后,集中上清液,荧光表达,流式细胞仪,是由病毒滴度。

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Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499, doi:10.3791/1499 (2009).

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Abstract

RNA干扰(RNAi)是在活细胞中的基因沉默系统。 RNA干扰,基因同源序列短干扰RNA(siRNA)的沉默转录后的状态。短发夹RNA的siRNA的前体,可使用慢病毒,允许在多种细胞类型中的RNAi表达。慢病毒,如人类免疫缺陷病毒,能够感染分裂和非分裂细胞。我们将描述一个程序包慢病毒。包装是指主管病毒DNA载体的准备。慢病毒载体的生产系统是基于一个“分裂”的制度,其中病毒的天然基因组已分割成单独的辅助质粒结构。这种不同的病毒分子分裂成4个独立的向量,减少不定的慢病毒基因组的重组创造了复制能力的病毒的风险。在这里,一个载体,利息和3个包装载体的shRNA(P - VSVG,PRSV,pMDL)瞬时转染到人293细胞。至少48小时的潜伏期后,病毒上清收获和集中。最后,记者(荧光灯)的表达,流式细胞仪,是由病毒滴度。

Protocol

第1部分:生产慢病毒转染的HEK 293细胞

* 24小时前转,板2.5 × 10 6细胞在50-70%,第二天汇合10厘米菜。

  1. 开始准备稍后会转染的细胞,使病毒的DNA与本议定书​​。首先,淡化FuGENE 6转染试剂罗氏公司,脂质体试剂,使细胞组成DNA。在1.5 ml管,移液器30μlFuGENE 6(SFDMEM)为600ul无血清培养基。小心不要让FuGENE触摸管方,因为它是进入中期交付。让这个FuGENE SFDMEM混合,在室温下孵育5分钟。
  2. 管帽,混合4微克慢病毒质粒4微克每第三代病毒包装载体(pMDL,PRSV和pVSV - G)。慢病毒载体包含病毒插入基因组的每一个细胞,它感染,而包装载体含有慢病毒所需的所有其他蛋白质的基因的DNA。
  3. 关闭颠倒离心管几次的盖子,混合。
  4. 在室温下孵育15-20分钟。
  5. 到293盘管吸取的全部内容。通过倾斜板混合轻轻地来回。
  6. 返回细胞的孵化器,并允许病毒生产继续在收获前48-96小时。
  7. 孵化过程中,293细胞转录从慢病毒质粒DNA的利益,创造慢病毒构建的RNA副本。他们还抄写并翻译成病毒蛋白的包装载体的基因。这些蛋白质进行病毒含有RNA的版本,你慢病毒构建将反向转录病毒,它感染的所有细胞的基因组插入。

第2部分:慢病毒丰收

  1. 潜伏期后,细胞外的孵化器,并使用一个一次性的,10ml注射器,去除上清,它现在包含病毒。将有大约上清10毫升。
  2. 将一个0.45μm的注射器过滤器,尖和病毒过滤成贝克曼超速离心机管。过滤器只允许病毒和细胞通过。
  3. 在丢弃之前,孵化所有病毒产生细胞培养板中,注射器和10%的漂白水45分钟的过滤器。

第3部分:通过慢病毒超速离心浓缩

  1. SW - 41Ti或SW - 28转子水桶装入离心管。
  2. 使用无血清DMEM,以平衡所有病毒含有管内0.2克。
  3. 密封关闭转子桶和他们勾到转子前放置超速离心机转子
  4. 超速离心机在90分钟的旋转病毒在4 ° SW - 41Ti转子在25000转或24000 SW - 28转子的转速C。
  5. 在组织培养罩,反转管倒挂倒入一个含有10%的漂白粉的货柜上清。
  6. 使用Kimwipe周围的颗粒吸收多余的液体和倒置在一个不超过五分钟,方便机架管。
  7. 要重新挂起的病毒颗粒,使用一个过滤嘴管加入100μL无菌PBS,然后吸管向上和向下的20倍左右。
  8. 保留病毒在4 ° C过夜完成重新悬浮。一个可以存放在4度,约1周,在-80度长达一年的病毒​​PREPS。请记住10%丢弃前漂白处理所有空管。
  9. 如果打算使用超过1周的病毒的准备,为未来的实验和1 3等份滴定5μL,最小的5 -20μL等分。冻结和储存在零下80等份。

第4部分:用流式细胞仪的慢病毒滴定

  1. 下一步是通过流式细胞仪来确定病毒滴度。这种方法只适用于在包含一个荧光报告基因的慢病毒载体。我们的想法是,当病毒感染细胞,它引入到该细胞的基因组慢病毒质粒DNA。被感染的细胞,然后将抄写和翻译的慢病毒载体的基因,包括,如果你包括一个荧光报告基因,感染的细胞会发出荧光。荧光水平的效用,或病毒滴度。
  2. 对于每一个病毒的股票滴度,浓缩病毒液稀释成1.5毫升(DMEM培养液,钢笔链球菌,谷氨酰胺,FBS),完整的媒体。
  3. 在1-6井在96孔板单列,执行以下的系列稀释:所有6个井加100μL完全DMEM媒体。第一添加媒体100μL无病毒(这是你的未染色的控制),第二孔加100μL稀释后的病毒(这相当于TO1毫升未经稀释的病毒),第三孔加100μL从第二口井的组合,第四以及100毫升,添加以及从第三至第五好添加100μL从4井,到第六孔加100μL从5井。最后采取100ul第六以及丢弃在漂白剂。串行稀释,每口井有一半的病毒量相比之前。
  4. 带来的所有井的总体积为200μL。请注意,这些只是建议的稀释,这应该为滴定最集中的病毒。如果病毒滴度低,或花心,可能需要调整稀释。
  5. 任何未使用的稀释病毒治疗丢弃前45分钟与10%的漂白水溅入一个生物危险废物的容器。
  6. 6口井,每年新增〜15000健康,积极除以293细胞。一个单一的96孔板,可用于病毒滴度16 PREPS。
  7. 返回细胞至37度的孵化器,5%CO 2,并允许进行至少48小时的感染。
  8. 潜伏期后,细胞对记者表达,流式细胞仪(在本例中荧光)分析。病毒颗粒定量%,每口井的荧光细胞。

用下面的公式计算出每毫升传染性单位:

(每口井每天感染X记者阳性细胞的细胞)× 1000
______________________________________________________
载体毫升补充嘛

第5部分:代表性的成果:

经过48小时的潜伏期后转染293细胞的板应在90%左右,荧光。一个荧光细胞的高比例是高比例的病毒产生细胞的迹象。

离心后,病毒颗粒resuspending时隐约可见。颗粒是明确的和非常小的,这是正常的的。

解释流式细胞仪检测结果时,请注意,只可以实现准确的效价计算,当受感染的细胞(日光灯)已经收到不超过每一个细胞病毒融合。为了确保这种情况下,使用细胞<15%计算感染率。细胞具有较高的感染率可能已经收到了每个单元的多个病毒integrants。在步骤2中建议的稀释应该产生这种感染的范围内的几个样本。理想的情况下,使用几个样本生成滴定曲线(线性),从中可以计算出最终的滴度,但你可以使用单个样本计算滴度,如有必要。可以预期,滴度为1.0 × 10 7涂/毫升联合国浓缩病毒和1.0 × 10 8恩/毫升浓缩病毒。

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Acknowledgements

桑德勒哮喘基本法研究中心(SABRE)
桑德勒基金会

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG Roche Group
Bleach Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes Falcon BD 353003
Multichannel pipette Rainin
Filtered pipette tips Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) Eppendorf
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2 Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope Coulter
FACS Array Beckman Coulter Inc.

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References

  1. Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. 72-7211 (2000).
  2. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).

Comments

3 Comments

  1. Thank you, is very useful for me.

    Reply
    Posted by: Ken L.
    September 8, 2011 - 11:59 PM
  2. Thank you very much, it give me a big help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 20, 2012 - 12:05 PM
  3. 谢谢 thanksA²81;

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 2:13 AM

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