Visualizing एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ डीएनए प्रतिकृति

Biology
 

Summary

इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय में व्यक्ति replisomes द्वारा डीएनए प्रतिकृति दृश्यमान करने के लिए एक सरल एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक को दर्शाता है.

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Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (32), e1529, doi:10.3791/1529 (2009).

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Abstract

हम एक सरल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आधारित वास्तविक समय एकल अणु स्तर पर डीएनए प्रतिकृति के अवलोकन के लिए विधि का वर्णन. एक परिपत्र, काँटेदार डीएनए टेम्पलेट एक functionalized कांच coverslip से जुड़ा हुआ है और प्रतिकृति प्रोटीन और nucleotides (चित्रा 1) की शुरूआत के बाद बड़े पैमाने पर दोहराया. बढ़ती उत्पाद डीएनए डबल भूग्रस्त (dsDNA) लामिना का प्रवाह के साथ बढ़ाया है और एक intercalating डाई का उपयोग द्वारा visualized. वास्तविक समय में बढ़ रही डीएनए के अंत में स्थिति को मापने प्रतिकृति दर की सटीक दृढ़ संकल्प (चित्रा 2) की अनुमति देता है. इसके अलावा, पूरा डीएनए उत्पादों की लंबाई प्रतिकृति के processivity पर रिपोर्ट. यह प्रयोग बहुत आसानी से और तेजी से किया जा सकता है और केवल एक हद तक संवेदनशील कैमरे के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है.

Protocol

एकल अणु एक प्रतिकृति प्रयोग प्रदर्शन से पहले, कुछ सामग्री के लिए अग्रिम में तैयार रहने की जरूरत है.

1. डीएनए प्रतिकृति टेम्पलेट

प्रतिकृति प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट एक biotinylated, पूंछ M13 रोलिंग मानक आण्विक जीव विज्ञान तकनीक 1,2 का उपयोग कर तैयार सर्कल है.

सामग्री: M13mp18 एकल असहाय डीएनए, Biotinylated पूंछ oligonucleotide प्राइमर (5'-बायोटिन टी 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 '), T7 डीएनए पोलीमरेज़, हीट ब्लॉक, Phenol / Isoamyl शराब / क्लोरोफॉर्म

  1. टीबीएस बफर (330 एनएम पूंछ oligo, 33 एनएम M13) में एक 10 गुना oligo से अधिक जोड़कर biotinylated पूंछ M13 oligo पानी रखना.
  2. 65 ° गर्मी ब्लॉक सी मिश्रण गर्मी. एक बार गर्म, गर्मी ब्लॉक बंद और धीमी ठंडा ठीक प्राइमर पानी रखना करने के लिए अनुमति.
  3. 64 एनएम T7 डीएनए पोलीमरेज़ और T7 प्रतिकृति dNTPs और 2 MgCl युक्त बफर के एक मिश्रण करने के लिए primed M13 जोड़ें.
  4. 37 पर प्रतिक्रिया ° सी 12 मिनट के लिए सेते हैं और 100 मिमी EDTA के साथ बुझाना.
  5. शुद्ध उत्पाद डीएनए phenol / / क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब निष्कर्षण और ते बफर या अन्य उपयुक्त भंडारण बफर में dialyze और डीएनए (प्रत्येक जैविक चरण वापस निकालने के लिए किसी भी M13 primed अवशिष्ट पुनर्प्राप्त) एकाग्रता का निर्धारण के साथ भरा.
  6. टेम्पलेट की तैयारी के एक चलना आसानी nanomolar एकाग्रता टेम्पलेट के कई मिलीलीटर कर सकते हैं एकल अणु प्रयोगों के हजारों की सैकड़ों के लिए पर्याप्त है.

2. Functionalized Coverslips

कांच coverslip करने के लिए डीएनए संलग्न करने के लिए, कांच पहले एक aminosilane है, जो तब biotinylated खूंटी अणुओं के लिए युग्मित है के साथ functionalized है. इस कोटिंग 1,3 सतह के साथ डीएनए प्रतिकृति और प्रोटीन की बातचीत nonspecific को कम करने में मदद करता है.

ग्लास coverslips, धुंधला जार, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy PEG5k - एनएचएस एस्टर, बायोटिन PEG5k - NHSester, एसीटोन, 1M KOH, इथेनॉल, ओवन, स्नान sonicator सामग्री:

  1. उन्हें जार धुंधला हो जाना और इथेनॉल के साथ जार भरने में रखकर अच्छी तरह से साफ कांच coverslips. 30 मिनट के लिए Sonicate और जार बाहर कुल्ला और एम 1 KOH के साथ भरें. Sonicate के लिए 30 मिनट दोनों washes दोहराएँ.
  2. पहली functionalization प्रतिक्रिया के लिए, पानी के सभी निशान को हटा दिया जाना चाहिए. एसीटोन और 10 मिनट के लिए sonicate के साथ जार भरें. एसीटोन के साथ जार फिर से कुल्ला.
  3. एसीटोन में silane अभिकर्मक की एक 2% v / v समाधान तैयार करें. धुंधला जार में जोड़ें और 2 मिनट के लिए आंदोलन. यह प्रतिक्रिया aminosilane के कांच के लिए alkoxy समूह जोड़े, के लिए अगले युग्मन कदम एक प्रतिक्रियाशील amine छोड़ने. पानी की एक बड़ी अतिरिक्त के साथ प्रतिक्रिया बुझाने.
  4. उन्हें ° 110 में 30 मिनट के लिए ओवन में सी पाक द्वारा coverslips सूखी.
  5. 100 मिमी NaHCO 3 8.2 पीएच में: 50:1 methoxy बायोटिन खूंटी मिश्रण तैयार कर लें. 0.2% के आसपास w / ध् biotinylated खूंटी के लिए निशाना लगाओ.
  6. पिपेट एक सूखी silanized coverslip और जगह के शीर्ष पर एक coverslip पर 100 खूंटी मिश्रण की μL. एक गिलास coverslip स्पेसर शामिल coverslips की जुदाई की अनुमति देगा.
  7. 3 घंटे के लिए खूंटी समाधान में coverslips सेते हैं, तो coverslips की प्रत्येक जोड़ी के अलग और धोने के पानी के साथ बड़े पैमाने पर. Functionalized coverslips पक्ष के रूप में केवल एक बार ओर खूंटी के साथ लेपित हो जाएगा रखने के लिए सावधान रहें.
  8. सूखी वैक्यूम के अंतर्गत coverslips और दुकान. सतहों कम से कम एक महीने के लिए स्थिर रहेगा, तो coverslips के दर्जनों एक बैच में बनाया जा सकता है है और के रूप में की जरूरत इस्तेमाल किया.

इन सामग्रियों को समय के आगे बना होना चाहिए है, और तब प्रत्येक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया. हर एक अणु प्रयोग शुरू करने के लिए, प्रवाह चैम्बर कोडांतरण द्वारा शुरू करते हैं.

3. फ्लो चैंबर तैयार

प्रयोग एक सरल प्रवाह चैम्बर एक functionalized coverslip, डबल पक्षीय टेप, एक क्वार्ट्ज स्लाइड और टयूबिंग के साथ निर्माण का उपयोग किया जाता है. एक प्रवाह कक्ष प्रत्येक एकल अणु प्रयोग 1,4 के लिए तैयार है .

डबल पक्षीय टेप, रेजर ब्लेड, टयूबिंग, त्वरित सूखी epoxy के लिए छेद के साथ क्वार्ट्ज स्लाइड, Functionalized coverslip (ऊपर देखें), streptavidin समाधान (1 पीबीएस में मिलीग्राम / एमएल के 25 μL), टयूबिंग, अवरुद्ध बफर (20 ​​मिमी सामग्री : Tris पीएच 7.5, 2 मिमी EDTA, 50 मिमी NaCl, 0.2 मिलीग्राम / एमएल BSA, 0.005 बीच 20%)

  1. Desiccator में अवरुद्ध बफर के 20-25 एमएल रखने के बाद के चरणों के लिए किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के द्वारा शुरू करो.
  2. खूंटी-functionalized coverslip लो और सतह पर 125 पीबीएस - पतला streptavidin समाधान के फैल गया. छोड़ो इस 20 मिनट के लिए सेते हैं जबकि चैम्बर के अन्य भागों की तैयारी, streptavidin सतह biotins बाध्य करने की अनुमति.
  3. डबल साइड का एक टुकड़ा कटघ टेप क्वार्ट्ज स्लाइड के आकार से मिलान करने के लिए. मार्क एक पेंसिल के साथ टेप पर टयूबिंग छेद इतना है कि प्रवाह चैम्बर की एक रूपरेखा (1 मिलीग्राम / एमएल) टेप पर खींचा जा सकता है की स्थिति.
  4. 2 छेद के आसपास आयत मिमी चौड़ा बनाओ. यह प्रवाह चैनल के रूप में काम करेंगे, तो सीधे पक्षों बनाने और टयूबिंग की Inlet और आउटलेट के आसपास कमरे में छोड़ सुनिश्चित हो. अगर वांछित, कई चैनलों या विभिन्न आकारों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. तैयार रूपरेखा के साथ कट, सीधे, साफ कटौती करने के चैनल में कोई चिपकने वाला protrudes सुनिश्चित करें.
  6. साफ़ क्वार्ट्ज अच्छी तरह का उपयोग एसीटोन या इथेनॉल पिछले प्रवाह कक्ष के निर्माण से चिपकने वाला हटाने.
  7. चैनल रूपरेखा का सबसे अच्छा संरेखण का पता लगाएं, चिपकने वाला समर्थन के एक तरफ हटा और ध्यान क्वार्ट्ज स्लाइड पर टेप की जगह है. टेप ठीक से संरेखित करने के लिए सावधान रहो, Inlet और आउटलेट के रूप में छेद करने के लिए unblocked रहने की जरूरत है.
  8. इनलेट और प्रवाह सेल के आउटलेट के लिए टयूबिंग की लंबाई कट. यह मदद करता है के बारे में एक 30 डिग्री कोण पर ट्यूब के अंत में कटौती इतना है कि ट्यूब चैम्बर नीचे के फ्लैट के खिलाफ प्रेस नहीं होगा. उन्हें अगले चरणों में प्रवाह सेल करने के लिए आसान लगाव के लिए निलंबित करने के लिए समर्थन के कुछ प्रकार पर ट्यूबों रखें.
  9. Streptavidin-लेपित coverslip अच्छी तरह से पानी से कुल्ला संपीड़ित हवा का उपयोग कर शुष्क. याद रखें कि केवल एक पक्ष functionalized है; coverslip नहीं बारी से अधिक सावधान रहना. टेप समर्थन के दूसरे पक्ष निकालें और coverslip पर क्वार्ट्ज स्लाइड जगह.
  10. हल्के coverslip पर प्रेस करने के लिए बाहर किसी भी चिपकने में फंस हवा धक्का. यह किसी भी हवाई बुलबुले के प्रवाह चैनल में हो रही से बचने में मदद मिलेगी.
  11. Epoxy के साथ कक्ष के पक्ष सील. क्वार्ट्ज और epoxy के साथ जगह में सील के छेद में कटौती टयूबिंग डालें. यह कुछ मिनट के लिए शुष्क करने की जरूरत है.
  12. एक बार सूखा, degassed अवरुद्ध बफर की ट्यूबों के माध्यम से कुछ खींच द्वारा सतह को अवरुद्ध शुरू. एक 21 गेज सुई 0.76 मिमी टयूबिंग के अंदर पूरी तरह से फिट बैठता है. कुछ समय बाहर फ्लश करने के लिए हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, और चैम्बर कम से कम आधे घंटे के लिए सेते करने के लिए अनुमति देते हैं.

4. एकल अणु प्रतिकृति प्रयोग

तैयार प्रवाह चैम्बर, SYTOX ऑरेंज, TIRF माइक्रोस्कोप, 532 एनएम लेजर, सीसीडी कैमरा, छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर, रोलिंग सर्कल डीएनए सब्सट्रेट, प्रतिकृति प्रोटीन सामग्री:

  1. प्रवाह सेल के बाद अवरुद्ध किया गया है, सब कुछ करने के लिए प्रयोग एकल अणु शुरू करने के लिए तैयार है.
  2. प्रवाह सेल ले लो और यह खुर्दबीन मंच पर जगह है. चरण क्लिप के साथ जगह में कक्ष पकड़ो और सुनिश्चित करें कि प्रवाह चैनल y-अक्ष के साथ सीधे तैनात है.
  3. प्रवाह सेल आउटलेट सिरिंज पंप ट्यूब एक बड़ा व्यास संबंधक टयूबिंग या एक सुई का उपयोग कर कनेक्ट. बफर अवरुद्ध में इनलेट प्लेस और ट्यूब में किसी भी हवा निकाल सिरिंज पर वापस खींच. आउटलेट ट्यूब के एक सज्जन झटका किसी भी हवा के प्रवाह कक्ष में फंस बुलबुले स्पष्ट में मदद मिलेगी.
  4. 25 बजे तक अवरुद्ध बफर के 1 एमएल में शेयर डीएनए टेम्पलेट पतला. उदारवादी प्रवाह दर पर चैम्बर में डीएनए की अच्छी सतह कवरेज की अनुमति देने के प्रवाह. 0.025 एमएल / 30 मिनट के लिए मिनट अच्छी तरह से काम करता है. कितने coverslips के प्रत्येक बैच के लिए डीएनए अणु सतह पर हैं या कितने प्रयोग के लिए वांछित हैं पर आधारित विभिन्न जा सकता है.
  5. एक बार डीएनए में है, बाहर अवरुद्ध बफर का उपयोग करते हुए अतिरिक्त डीएनए धोने. कम से कम 200 संस्करणों के लिए प्रवाह सेल धो सभी मुक्त डीएनए के छुटकारा.
  6. प्रतिकृति बफर degassing शुरू. ई. के लिए कोलाई प्रतिकृति प्रयोगों, 37 में इस डिग्री सेल्सियस गर्म प्रवाह चैम्बर में बुलबुले के जोखिम को कम .
  7. लेजर और कैमरे पर मुड़ें. ठंडा सीसीडी तापमान तक पहुँचने से पहले इसे इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है.
  8. यदि एक 37 डिग्री सेल्सियस प्रयोग के प्रदर्शन पर हीटर बारी है. यकीन है कि उद्देश्य प्रवाह सेल के साथ संपर्क में है या यह एक गर्मी सिंक बाद में किया जाएगा.
  9. धोने और degassing के बाद, प्रतिक्रिया तैयार किया जा सकता है. मिक्स nucleotides, डीटीटी, और प्रतिकृति बफर में SYTOX. फिर प्रोटीन जोड़ने और धीरे मिश्रण.
  10. प्रतिक्रिया मिश्रण प्रवाह सेल में प्रवाह. इस प्रवाह की गति को dsDNA खिंचाव करने के लिए पर्याप्त की जरूरत है. 2 मिमी चौड़ी, 100 सुक्ष्ममापी लंबा प्रवाह चैनल के लिए 0.04 एमएल / मिनट अच्छी तरह से काम करता है.
  11. कक्ष में प्रवेश और इमेजिंग शुरू करने के लिए मिश्रण के लिए समय की अनुमति दें. एक अच्छा टिप करने के लिए चैनल की ओर देखने के क्षेत्र को स्थानांतरित करने के लिए और चिपकने वाला पदार्थ पर ध्यान केंद्रित है. इससे यह सुनिश्चित होगा कि आप ध्यान केंद्रित करने के लिए सतह के पास हैं.
  12. लेजर शक्ति, खुर्दबीन ध्यान देते हैं, और TIRF कोण समायोजित करें. कम शक्ति के दाग डीएनए के किसी भी photocleavage से बचने रखें. डीएनए प्रतिकृति की दर के आधार पर कई मिनट के लिए 1-5 फ्रेम / दूसरे पर मोल. अगर वांछित, अब प्रतिकृति trajectories पाने के लिए या अधिक अणुओं को देखने के एक नए क्षेत्र को स्थानांतरित करने के लिए दोहराएँ.
  13. प्रतिक्रिया मिश्रण के बाद लगभग खाली है, यह एक अच्छा विचार है एस के साथ और अधिक बफर में प्रवाहYTOX देखने के अन्य क्षेत्रों को देखने के लिए. अलग दोहराया अणुओं की एकाधिक छवियों लेना processivity निर्धारण के लिए आँकड़े उपलब्ध कराता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

सक्रिय रूप से नकल अणुओं को आसानी से दाग डीएनए की लंबी लाइनों के रूप में देखा जाता है. हमारे प्रयोगों में, बह M13 सब्सट्रेट के 25 बजे एक 60x, 125 सुक्ष्ममापी x 125 देखने के सुक्ष्ममापी फ़ील्ड (चित्रा 1) 100-1000 अणुओं देता है. प्रतिकृति ई. का उपयोग प्रयोगों प्रदर्शन 37 पर कोलाई replisome प्रोटीन डिग्री सेल्सियस (विवरण के लिए सामग्री देखें) देखने के क्षेत्र के अनुसार 5-50 नकल अणुओं देता है . T7 replisome, जो सब्सट्रेट पर अधिक कुशलता से शुरू के बराबर सांद्रता में, हम एक क्षेत्र को दोहराने के में> अणुओं के 70% का पालन करें. इन शर्तों एक उत्पाद का घनत्व इतना अधिक है कि व्यक्तिगत अणुओं को हल करने के लिए और विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हैं उपज है, तो T7 प्रयोगों कम प्रोटीन सांद्रता में प्रदर्शन कर रहे हैं.

डेटा विश्लेषण: दर डेटा प्राप्त करने के लिए, बस डीएनए बनाम समय के endpoint साजिश और ढलान (चित्रा 2 ) की गणना. Processivity के लिए, डीएनए की कुल लंबाई निर्धारित. इन नंबरों के दोनों बेस जोड़े के लिए परिवर्तित किया जा आवश्यकता होगी. प्रयोग प्रदर्शन से पहले, आप उचित बढ़ाई कैमरे के पिक्सेल आकार पता होना चाहिए. Basepair रूपांतरण के लिए, एक अच्छा अनुमान बस डीएनए के crystallographic लंबाई, 2.9 बीपी / एनएम के आधार पर परिवर्तित होता है. हालांकि, लामिना का प्रवाह पूरी तरह डीएनए नहीं खिंचाव जाएगा, तो एक डीएनए की लंबाई अंशांकन एक ज्ञात लंबाई डीएनए, उदाहरण के 48,502 बीपी λ डीएनए ले, प्रवाह सेल करने के लिए और एक biotinylated oligo के साथ संलग्न पर SYTOX से सना हुआ इसकी लंबाई को मापने के द्वारा किया जाना चाहिए प्रवाह दर प्रतिकृति के प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया. बेस जोड़े / पिक्सेल की संख्या का निर्धारण प्रतिकृति दरों और processivities की सटीक गणना की अनुमति देगा. कई छवियों और फिल्मों लेते उत्पाद अणु की बड़ी संख्या प्रदान करते हैं, दर और processivity वितरण (चित्रा 2) 1 की साजिश रचने की अनुमति होगी.

चित्रा 1
चित्रा 1: (रेफरी से 1.)) प्रतिकृति रोलिंग - वृत्त परख के कार्टून. (एसए, streptavidin). अग्रणी भूग्रस्त संश्लेषण चक्र और पूंछ जोड़ने सतह फैली हुई है. पूंछ ठंड कतरा पोलीमरेज़ द्वारा dsDNA करने के लिए बदल जाती है और लामिना का प्रवाह द्वारा फैला.
ख) SYTOX ऑरेंज और 532 एनएम उत्तेजना के साथ दृश्य का उदाहरण क्षेत्र . लघु फ्लोरोसेंट स्पॉट सीमित, गैर दोहराया substrates हैं. उत्पादों की चरम लंबाई और क्षेत्र के प्रति उत्पादों (प्रत्येक प्रवाह कक्ष> 5000 में ऐसे क्षेत्रों में शामिल है) की बड़ी संख्या ध्यान दें.

चित्रा 2
चित्रा 2: (रेफरी से अनुकूलित 1.) A, b) ठेठ नकल अणुओं की T7 (क) और ई. से Kymographs कोलाई प्रयोगों (ख). ग) क) और ख) से अणुओं की Endpoint trajectories समय बनाम साजिश रची है. Trajectories रेखीय प्रतिगमन के साथ लगे हैं प्रतिकृति दर प्राप्त करने के लिए. दिखाया उदाहरण 99.4 बीपी एस -1 और 467.1 बीपी एस -1 रहे हैं. घ) प्रतिकृति उत्पादों की लंबाई के वितरण, एकल घातीय क्षय के साथ फिट करने के लिए प्राप्त processivity: 25.3 1.7 ± KBP T7 (), 85.3 ± 6.1 KBP (कोलाई ई.). ङ) एक अणु trajectories के दर वितरण, एकल Gaussians के साथ फिट. मतलब: 75.9 ± 4.8 बीपी (T7) -1, 535.5 ± 39 बीपी एस -1 (ई. कोलाई).

Discussion

ब्याज की प्रतिकृति प्रोटीन पर एक महत्वपूर्ण नियंत्रण दाग, SYTOX ऑरेंज के प्रभाव की जांच है. एक सरल तरीका यह करने के लिए प्रतिकृति के रूप में वर्णित प्रवाह कक्ष में लेकिन SYTOX की चूक के साथ प्रयोग करने के लिए है. बाद प्रतिक्रिया मिश्रण कक्ष के माध्यम से बह गया है, SYTOX के साथ बफर जोड़ने के लिए डीएनए दाग और दोहराया अणुओं की लंबाई के वितरण की जांच. वैकल्पिक रूप से, मानक थोक प्रतिक्रियाओं प्रतिकृति दर और दक्षता पर SYTOX के किसी भी प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित प्रयोग में केवल एक ही प्रवाह चैनल का उपयोग करता है. इस मल्टी चैनल प्रवाह कक्षों बनाने या PDMS या इसी तरह के microfluidic उपकरणों का उपयोग करके आसानी से बदला जा सकता है. चैनलों की संख्या बढ़ाने से बहुत प्रोटीन सांद्रता, म्यूटेंट, या अवरोध करनेवाला अणुओं की स्क्रीनिंग की सुविधा और प्रतिकृति डेटा संग्रह की तेज़ी बढ़ जाती है.

के रूप में उल्लेख किया है, हम ई. प्रदर्शन कोलाई 37 प्रतिकृति प्रयोगों डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर एक घर बनाया एल्यूमीनियम प्रवाह सेल हीटर, एक प्रतिरोधक हीटिंग तत्व (कारतूस हीटर) और चर बिजली की आपूर्ति. यह अच्छा तापमान स्थिरता देता है और एक उद्देश्य हीटर की खरीद टाल है. हीटर जांचना करने के लिए, हम बस एक क्वार्ट्ज प्रवाह सेल ऊपर के केंद्र में एक छेद drilled, प्रवाह चैनल में एक thermocouple डाला और सामान्य रूप में बफर बह. बढ़ती voltages में प्रवाह सेल बफर तापमान को मापने के लिए सही हीटिंग की अनुमति देता है.

Acknowledgments

समीर हमदान इस तकनीक के विकास में सहायता प्राप्त ई.. कोलाई प्रोटीन प्रो निक डिक्सन की प्रयोगशाला से हैं, वॉलोन्गॉन्ग विश्वविद्यालय, और T7 प्रोटीन प्रो चार्ल्स रिचर्डसन, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल से कर रहे हैं. कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (GM077248 AMvO) और जेन ताबूत Childs फाउंडेशन (JJL) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M13mp18 ssDNA New England Biolabs N4040
Biotinylated Tail Oligo Integrated DNA Technologies
T7 DNA Polymerase New England Biolabs M0274 Use T7 replication buffer for substrate preparation
Phenol/ Isoamyl Alcohol/ Chloroform Roche Group 03117987001 24:24:1 v/v
3-aminopropyl-triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648 Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG Nektar Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS Nektar
Double-sided tape Grace Bio-Lab Inc. SA-S-1L 100 μm thickness
Quartz slide Technical Glass 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing BD Biosciences 427416 0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin Sigma-Aldrich S4762 Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix New England Biolabs N0447
Ribonucleotide triphosphate solutions Amersham 272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange Invitrogen S11368 Other dsDNA stain can be used
Fluorescence Microscope with 60x TIRF objective Olympus Corporation IX-71 Microscope, camera, etc. can be substituted for similar equipment
Syringe Pump Harvard Apparatus 11 Plus Operate in refill mode to facilitate solution changes
532 nm laser Coherent Inc. Compass 215M-75 Select wavelength to correspond to stain of choice
EMCCD Camera Hamamatsu Corp. ImagEM
Emission filter Chroma Technology Corp. HQ600/75m

T7 Replication: 40 mM Tris pH 7.5, 50 mM potassium glutamate, 10 mM magnesium chloride, 100 μg/mL BSA, with 5 mM dithiothreitol, 600 μM dNTPs, 300 μM ATP, 300 μM CTP, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 5 nM gp4 (hexamer), 40 nM polymerase (1:1 gp5: thioredoxin), 360 nm gp2.51,5.

E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6

E. coli Replication: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 mM magnesium acetate, 80 mM potassium chloride, 100 μg/mL BSA with 10 mM dithiothreitol, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTPs, and 15 nM SYTOX Orange added immediately before use. Proteins added as: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ or τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6

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References

  1. Tanner, N. A., et al. Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication. Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).
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  3. Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
  4. Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. DNA replication: Methods and protocols. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
  6. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-562 (2006).

Comments

16 Comments

  1. Nice job!

    Reply
    Posted by: Gloria K.
    March 4, 2010 - 10:35 AM
  2. 1-Her voice makes me nervous.
    ²- What is the brand/manufacturer of the double sided tape?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 23, 2011 - 10:28 PM
  3. Double-sided tape is from Grace BioLabs, SecureSeal SA-S-1L

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 23, 2011 - 10:38 PM
  4. Thanks a lot for the response. One last question, s the tape waterproof too?
    ps. Her voice still bothers me!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 24, 2011 - 5:10 PM
  5. Random questions, where did you get your air gun from?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:59 PM
  6. I honestly don't remember, and another guy in the lab had ordered them, but it's a clean room product, so maybe some clean room supplier? Sorry.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2012 - 9:01 AM
  7. DŒs any part of the work need to be done under a fume hood? Or everything can be done in open air.
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 8, 2012 - 9:45 PM
  8. No, none of it requires a fume hood. If you don't like the smell of acetone you could do the glass drying/functionalization steps in a hood, but it's not necessary.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2012 - 9:02 AM
  9. Thanks for the answer. Really nice work!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2012 - 9:19 AM
  10. Did you face any problem with the laser focus drifting because of the flow? If that happens how do you handle it.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 5:34 PM
  11. No, the flow in the chamber is sufficiently independent of the microscope optics. The only thing that can affect focus is sudden, large pressure changes which could cause the glass to flex, and these would be only temporary. Flow dŒs affect TIRF, as molecules are stretched close to the surface and therefore in the TIRF evanescent wave, but that's the only way the optics and flow are connected.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 5:00 PM
  12. I am doing single molecule FRET experiments. My slide surfaces get very dirty (at single molecule level) after the silanisation step. I am using Piranha solution for surface cleaning and the surfaces are very clean just before silanisation. Is there something I should be careful about in the silanisation step, do you have a cleaning step in addition to what you have described?
    thanks and best regards

    Reply
    Posted by: Tunc Y.
    June 20, 2012 - 8:20 PM
  13. Hi! I have exactly the same problem! Before the silanization everything is completely clean, without any inpurity. Do you filter your aminosilane or do you treat it somehow (e.g centrifuging before applying?)
    Thanks for your help

    Reply
    Posted by: Ulf H.
    May 29, 2013 - 5:36 AM
  14. We certainly saw some surface variability, i.e. clean spots and dirty spots, but it was never really a big issue (though we're looking stained dsDNA here vs. single fluorophores). We didn't filter our silane solutions, but from the two comments it sounds like some sort of impurity is conferred in that step so perhaps some cleanup would help. We did notice that the fresher the silane, the better the surfaces, so I'd recommend the smallest bottle size and limited re-use. Sorry for not being more helpful, just never spent time dealing with that step. I'm not currently doing fluorescence experiments, though, so there may be improved methods out there.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 29, 2013 - 8:07 AM
  15. Thank you very much!

    Reply
    Posted by: Ulf H.
    May 30, 2013 - 4:35 AM
  16. Hi, I should say first it is a very nice technique that you developed. I was wondering if I can analyze long DNA chains with this tecnique. So, my question is; does this technique have a size limitation of DNA?

    Reply
    Posted by: Fabio C.
    November 20, 2015 - 11:40 PM

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