조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

Published 11/05/2009
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Biology
 

Summary

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

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Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. J. Vis. Exp. (33), e1530, doi:10.3791/1530 (2009).

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Abstract

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 우리 고속 원심 분리하는 동안 macromolecular의 침강 프로필을 기록 수있는 강력한 biophysical 도구입니다. 적절하게 계획하고 실행하면, AUC의 침강 속도 또는 침강 평형 실험은 크기와 모양에 관해서는 단백질, 샘플 순도, 침강 계수, oligomerization 상태 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 상당한 정보를 공개하실 수 있습니다.

이 기술은, 그러나, 기술주의의 엄격한 수준이 필요합니다. 샘플 세포는 두 윈도우 사이에 끼워 넣으면 어셈블리 sectored 센터 기사를 개최. 그들은 / 파운드에서 약 12​​0-140의 토크 압력과 봉쇄하고 있습니다. 속도로 회전하는 동안 광학 탐지 시스템은 각 핵심 분야를 통해 동일한 요골 경로 정중선의 샘플 및 참조 버퍼를 모두 스캔 수 있도록 참조 버퍼와 샘플은 중심 부문으로 로드된 후 실링 후, 세포가 정확하게 티타늄 회전자로 정렬됩니다 최대 60, 000 RPM 매우 높은 진공 하에서으로

뿐만 아니라 적절한 샘플 셀 조립 중요한 건, 샘플 전지 구성 요소는 매우 고가이며 또한 그들이 실험 도중에 누수 및 파손을 방지하기 위해 최적의 작업 상태로되도록하는 제대로 든다고해야합니다. 심지어 사소한 균열이나 흠집이 원심 분리기의 파손을 초래할 수있는 경우, 신중하게 창문을 처리합니다. 중심과 Windows 사이의 접촉은 가능한 한 꼭해야합니다, 토크 압력이 적용 후 즉 노 뉴턴의 고리가 표시됩니다. 먼지, 보풀, 긁힘 및 Windows 또는 중심 모든 손상이 연락도에 오일이 매우 쉽게 한 부문에서 다른 솔루션의 누수 또는 모두 함께 중심 밖으로 유출로 이어질 수 있습니다. 귀중한 샘플 실험 기간 동안 솔루션의 누출, 손실 종종 깨진 유리창과 중앙에 이르게 세포에서 압력의 불균형을 초래하게됩니다뿐만 아니라. 또한, 플러그 가스켓 및 주택 플러그는 원심 챔버에서 높은 진공으로 로딩 구멍 중심 부문에서 철수하고 솔루션을 피하기 위해 장소에 안전해야합니다. 윈도우 라이너와 가스켓은 운동이 깨진 유리창의 결과로 발생할 수 휴식과 균열 무료로해야합니다.

이 동영상이 샘플 셀 조립 우리의 절차를 선보일 예정, 도움 토크, 하중 및 로터 정렬 완벽한 AUC 실험 도중 구성 요소 손상, 누설 솔루션 및 파손을 최소화.

Protocol

샘플 셀 조립 및 토크

  1. 우리는 함께이 창 어셈블리를 넣어 샘플 셀 건설을 시작합니다.
    창 홀더에 창문 가스켓를 놓습니다. 위치는 라이너의 개통은 소유자의 키웨이 반대 창 홀더 내부 창 라이너 (또는 그것이 때때로 윈도우 쿠션라고)되도록. 약간 각도에서 창의 소유자의 주요 방법으로 윈도우에있는 학자 표시를 정렬 홀더에 창을 놓습니다. 창의 양쪽에 매우 가장자리에 가볍게 아래로 누르십시오.
  2. 적절한 씰링 및 샘플 세포의 정확한 토크를 보장하기 위해 가볍게 코트 Spinkote 윤활제와 주택 가스켓과 나사 링. 당신의 엄지와 집게손가락 사이 Spinkote의 매우 작은 금액을 확산. Spinkote의 얇은 필름으로 보이지 않는 문장 나사​​ 링 스레드를. 마찬가지로, 코트 주택 개스. 모든 보이는 윤활유를 닦아주십시오.
  3. 주택 키를 키웨이를 정렬하여 세포 주택에, 당신쪽으로 향하게 창문으로 하나의 창에서 어셈블리를 슬라이딩하여 샘플 셀 조립을 시작합니다. 주택 키를 사용하여 중앙의 키웨이 정렬하고 부드럽게 세포 내부의 윈도우 어셈블리의 상단에 가을 보자.
  4. 셀 주택에 중심을 밀어 도구의 어떤 종류를 사용하지 마십시오. 이것은 실험 중에 누출에 발생하는 CP에 영구적인 손상을 일으킬 수 있습니다. 창이 멀리에서 중심을 향해 마주되도록 두 번째 윈도우 어셈블리를 턴, 주택 열쇠 키웨이 정렬과 중심 위에 내려 슬라이드. 위에 주택 개스 플레이스, 다음, 나사 링 단어 "아웃"이 표시되도록. 손가락과 정렬 도구를 사용하여 손으로 나사 반지를 조입니다.
    CP는 주택 배럴에 쉽게 슬라이드하지 않는 경우, 먼저 정렬하고, 그 위에 두 번째 창에서 어셈블리를 놓으십시오. 윈도우 어셈블리에 완만한 하향 압력을 적용하여, 동시에 세포 주택에 모두 밀어. 이 방법, 우리는 CP에 직접 눌러 마십시오.
    지금은 먼지, 보풀 및 지문에 대한 세포 속을 살펴볼 수있는 좋은 시간입니다. 당신은 또한 CP와 Windows 사이에 공기가 여전히 나타냅니다 뉴턴의 반지를 통지합니다. 이것은 토크를 적용한 후에 사라집니다.
  5. 나사 링 위 표시 "아웃"이라는 단어와 함께, 토크 스탠드의 세포 토크 콜레 내부의 샘플 세포에게 모든 방법을 내려 놓으십시오. 토크 스탠드 손잡이에 지속적인 압력을 적용하여 장소에 세포를 잡아. 하나의 연속 동작에서 - 파운드에 120-140 사이에 나사 고리를 조이십시오. 조정 마이크로 미터의 토크 렌치를 사용하는 경우 / 파운드에 120-140 사이로 설정하고 설정 토크 렌치를 나타내는 "클릭"에 도달했습니다 때까지 나사 반지를 조입니다. 토크 스탠드 핸들을 해제하고 조심스럽게 창문을 건드리지 않고도 샘플 세포를 제거합니다.

샘플 셀을 로딩 및 씰링

  1. 침강 속도 실험을 위해, 우리는 정기적으로 200ul의 피펫을 사용하여 12mm 중심의 각 분야에 400ul의 볼륨을로드합니다. 상단과 눈에 보이는 나사 링에있는 단어 "아웃"에 로딩 구멍 샘플 세포를 놓습니다. 로딩 구멍 왼쪽 중심 부문에 피펫 팁 절반 방법을 아래로 슬라이드 천천히 참조 솔루션의 200ul를 분배. 400ul를 총 한 번 반복합니다. 같은 피펫 팁과 같은 기술을 사용하여 조심스럽게 천천히 샘플 솔루션의 400ul과 올바른 중심 섹터를 입력하십시오.
    150-180 UL의 볼륨이 침강 평형 실험에 사용되지만 동일한 관리 및 기술을 따라야한다.

    그것은 가능한 한 가깝게으로 레퍼런스와 샘플 솔루션의 볼륨을 일치하는 필수적입니다. 로딩 거품을 피하고 두 솔루션 가능한 동급생으로 볼륨을 유지의 모든 지원에 대해 동일한 피펫 팁을 사용하여 천천히 솔루션을 로딩하고 분배, 단단히 피펫에 피펫 팁을 피팅.
  2. 그들은 중앙 조각과 알루미늄 하우징 사이에 위치하고 있는지하고 각각의 로딩이 구멍에 snugly 2 개의 신규 주택 빨간색 플러그 가스켓을 배치하여 세포를 밀봉합니다. 주택 플러그 각각 커버. 손이 작은 납작 머리 드라이버로 조입니다.

로터의 샘플 셀 정렬

  1. 회전자를로드하기 전에 균형을 맞출 그 샘플 세포 누출 사건의 반대 위치에 샘플 세포보다 더 이상 0.5 이상의 g 가벼운 있는지 확인하십시오. 제로의 밸런스와 함께 시작합니다. 먼저 CB 반대 위치에있을 것이다 샘플 세포를 달다. 샘플 셀 무게를 뺄 테어 잔액은 다음 CB를 달다. 추가하거나 균형을 맞출의 부착 구멍에서 무게를 빼야. 중량은 위로부터 내다하지 않도록합니다. 균형을 맞출 최종 무게는 0.5 g 내에서 반대 샘플 세포보다 가볍고 수 있도록 Reweigh.
  2. 4 자리 로터를 사용하여 흰색 화살표가 표시되도록 게재 순위가 4로 균형을 맞출을 배치하고 t에 포인팅원심력의 그 방향. 그것은 회전자 내부에 내려가 있는지 확인하십시오. 반대 급부가 단단히 자리 때까지 부드럽게 그냥 흰색 화살표 건너편 균형을 맞출 상단에있는 설정 나사를, 고정하지만, 정렬 아직도 수 있습니다. 주택과 균형 샘플 셀 위치를 회전자의 중심 보이는 나사 링에있는 단어 "아웃"을 직면 플러그.
  3. 회전자 수렁에서 찾고, 정렬 도구를 사용하여 균형을 맞출에있는 학자 표시가있는 내부 학자 표시를 (회전자의 중심에 가장 가까운 마르크) 맞춥니다. 장소에 정렬 보상을 잠글 수있는 설정 나사를 조이십시오. 동일한 방식으로, 회전자의 위치 2 내부 학자 마크와 함께 샘플 세포 학자 표시를 맞춥니다.

자세한 내용은 참조를위한 https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx

Discussion

회전자에 적절한 셀 조립, 샘플 삽입하고, 셀 정렬 높은 품질의 AUC 실험을위한 중요합니다. 이것은 macromolecular의 침강 프로필에서 취득한 데이터의 매우 상세한 분석을 필요로 실험을 위해, 특히 사실입니다, 예를 들어, 단백질 상호 작용을 공부하고 추적 집계 금액을 결정할 때. 종종 실험 설정의 품질은 AUC 연구에서 결과의 정확성을 위해 제한됩니다. 3 - 실용적인 디자인과 AUC 실험의 자세한 실행에 대한 자세한 내용은 참조 1 참조하십시오. AUC 실험의 실용적인 설정, 이론, 및 데이터 분석을 다루는 워크숍은 국립 보건원에서 우리 실험실에서 회 개최되고있다 [4].

Acknowledgements

우리는 NIBIB, NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 연구 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-place Ti analytical rotor Beckman Coulter Inc. 361964
Torque stand assembly Beckman Coulter Inc. 361318
Cell alignment tool Beckman Coulter Inc. 362340
Spinkote Lubricant Beckman Coulter Inc. 306812
Counterbalance Beckman Coulter Inc. 360219
Cell Housing kit Beckman Coulter Inc. 334602
Window gasket Beckman Coulter Inc. 327021
Window liner Beckman Coulter Inc. 362329
Window, sapphire Beckman Coulter Inc. 307177
Window, quartz Beckman Coulter Inc. 301730
Window holder Beckman Coulter Inc. 305037
12mm double sector Epon centerpiece Beckman Coulter Inc. 306493
Cell plug gaskets Beckman Coulter Inc. 327022
Cell housing plug Beckman Coulter Inc. 362327

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
  2. Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
  3. analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
  4. Home - Workshops [Internet]. National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. Very clear. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2011 - 3:55 PM

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