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大会,加载和分析超速离心机样品池对齐

Biology
 

Summary

分析超速离心机(AUC)的样品池持有样品和参考缓冲器,并在实验过程中,暴露在高真空和转子速度高达60,000 RPM。此影片将展示装配,装载和对准这非常重要的组成部分的AUC实验所必需的细节一丝不苟。

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Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. J. Vis. Exp. (33), e1530, doi:10.3791/1530 (2009).

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Abstract

分析超速离心机(AUC)的是一个强大的生物物理的工具,使我们能够在高速离心大分子沉积剖面记录。当正确的规划和执行,AUC的沉降速度或沉淀平衡实验可以揭示蛋白质的大小和形状方面,样品纯度,沉降系数,齐聚国家和蛋白质相互作用很大。

然而,这种技术需要严格的技术注意水平。样品细胞举行一个扇面的中心片,夹在两个窗口组件之间。它们是密封的120-140 /磅左右的扭矩压力。参考缓冲器和样品装入的核心部门,然后密封后,细胞正是成为一个钛金属转子对齐光学检测系统,使每个核心部门通过扫描样品和参考缓冲器,而在相同的径向路径中线旋转速度高达60,000 rpm和非常高的真空下

不仅是正确的样品池大会的关键,样本的细胞成分都非常昂贵,必须得到适当的照顾,以确保他们处于最佳工作状态,以避免在实验过程中的渗漏和破损。处理Windows小心,哪怕是一丁点的裂纹或划痕,可能会导致在离心机破损。的核心和Windows之间的联系必须尽可能紧;扭矩施加压力后,应该是可见的,即没有牛顿环。灰尘,棉绒,划痕和Windows或核心的所有妥协这种接触和油可以很容易导致泄漏的解决方案,从一个部门到另一个或泄漏的核心一起。不仅是珍贵的样品丢失,泄露的解决方案,在一个实验会造成不平衡,往往导致破碎的窗户和中心焦点在细胞内的压力。此外,插件垫圈和住房插头必须牢固到位,以避免解决方案的核心部门,通过在离心室的高真空的装载孔被拉。窗口衬里和衬垫必须免费断裂和裂缝可能导致运动破窗。

此影片将展示我们的样品电池组装程序,扭矩大,装载和转子对齐,以帮助减少元件损坏,泄漏的解决方案,在完美的AUC实验和破损。

Protocol

样细胞大会和扭矩

  1. 2窗口组件放在一起,我们开始样品池建设。
    放置到窗口的持有人窗口垫片。窗口的位置内衬窗口持有人(或它有时也被称为一个窗口,垫),使开放的眼线对面的持有人的键槽。在一个很小的角度,将持有人的窗口,窗口调整窗口持有人的关键标志线。在窗口两侧边缘轻轻下压。
  2. 为了确保合适的密封和准确扭矩的样品池,我们轻轻大衣Spinkote润滑剂住房垫片与螺丝环。你的拇指和食指之间传播Spinkote非常少量。涂层薄,Spinkote看不见的薄膜螺纹环线程。同样,大衣住房垫片。擦去任何可见的润滑剂。
  3. 样品电池组装,开始由一个窗口组件滑动的窗口,面向您进入细胞内的住房,调整住房键与键槽。住房的关键核心键槽对齐,并让它轻轻地落在窗口大会在细胞内的顶部。
  4. 切勿使用任何工具,推入细胞住房的核心。这可能会导致永久性损坏泄漏造成的CP在实验过程中。打开第二个窗口组件,使窗口是面向核心,远离你,对准键槽与住房的关键和核心的顶部滑动下来。放置在顶部的住房垫片,然后,一个螺丝环,所以“出”字可见。用手指和对齐工具,手拧紧螺丝环。
    如果CP不容易滑入住房每桶,首先对齐,然后放置在它上面的第二个窗口大会。窗口组件上的应用柔和的下调压力,在同一时间都滑入细胞住房。这样,我们避免直接CP上的迫切。
    现在是一个好时机,看看里面的灰尘,绒毛和指纹细胞。您还会注意到牛顿环,表明仍然有CP和Windows之间的空气。这些后会消失申请扭矩。
  5. 随着螺丝环比上涨和“出”看得见的话,将样品细胞内细胞扭矩夹头扭矩立场一路下滑。扭矩的立场处理申请恒压细胞固定到位。在一个连续的动作,拧紧螺丝环,以120-140磅之间。如果使用可调式千分尺扭矩扳手,将它设置为120-140 /磅之间,拧紧螺丝环,直到显示设置扭矩的扳手“点击”已达到。松开扭矩的立场处理,小心取出样品池,没有触摸的Windows。

装载和密封样品池

  1. 沉降速度实验中,我们经常加载到每个200ul移液器使用的12毫米的核心部门的400ul的体积。顶部和“出”字可见的螺丝环加载孔样品池的位置。枪头中途滑动到左边的核心部门,通过加载孔,并慢慢地免除200ul参考的解决方案。重复一次,共400ul。使用相同的枪头和相同的技术,小心缓慢地填补400ul样品溶液的核心部门。
    卷150-180 UL用于沉淀平衡实验,但应遵循同样的关怀和技术。

    这是必须匹配参考和样品溶液的体积,尽可能密切。坚决配件到移液器吸头,慢慢地装载和分配解决方案,避免装载泡沫和使用这两种解决方案中的所有卷保持尽可能平等的援助相同的枪头。
  2. 密封放置到每个装载确保它们之间的中心片和铝制外壳定位孔2个新的红色房屋插头垫圈紧贴的细胞。盖每一个住房插件。用手拧紧,一个小的平头螺丝刀。

在样品转子单元格对齐

  1. 装载转子之前,确保样品细胞泄漏的情况下,在相反的立场,制衡是不超过0.5克,比样品池轻。开始余额为零。首先权衡的样品池,将在对面的CB的位置。皮减去样品电池重量的平衡,然后,权衡CB。从抗衡的附件孔中添加或减去的重量。确保从顶部重量不突出。 Reweigh,以确保.5克内抗衡的最终重量轻是不是相反的样品池。
  2. 使用4位转子,放置到第4位的抗衡,是可见的白色箭头指向在T他方向的离心力。确保它是一路下来转子内。轻轻拧紧固定螺丝,发现抗衡对面的白色箭头上,直到抗衡坚决到位,但仍然能够对齐。插头面临的转子中心和“出”字可见的螺丝环,与房屋的位置平衡的样品池。
  3. 从下面的转子,配合使用对齐工具抗衡上的标志线内的标志线(最接近的转子中心的标志)。拧紧螺钉将其锁定到位对齐抗衡。以同样的方式,与转子上的位置2内标志线对齐的样品细胞标志线。

欲了解更多信息,请参阅 https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx

Discussion

正确的电池组装,样品插入,并在转子单元格对齐方式是为高品质的AUC实验的关键。这才是真正的,特别是需要一个非常详细的分析,大分子沉积剖面上采集到的数据的实验,例如,在研究蛋白质相互作用,并确定跟踪总额。实验装置的质量通常是从AUC的研究结果的准确性和精度的限制。实用的设计和AUC的实验进一步执行的详细信息,请参阅参考文献1 - 3。工作坊覆盖的实际设置,理论和AUC的实验数据的分析,在我们的实验室正在举行每年两次在美国国立卫生研究院[4]。

Acknowledgements

我们承认NIBIB,美国国立卫生研究院院内研究计划的研究支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-place Ti analytical rotor Beckman Coulter Inc. 361964
Torque stand assembly Beckman Coulter Inc. 361318
Cell alignment tool Beckman Coulter Inc. 362340
Spinkote Lubricant Beckman Coulter Inc. 306812
Counterbalance Beckman Coulter Inc. 360219
Cell Housing kit Beckman Coulter Inc. 334602
Window gasket Beckman Coulter Inc. 327021
Window liner Beckman Coulter Inc. 362329
Window, sapphire Beckman Coulter Inc. 307177
Window, quartz Beckman Coulter Inc. 301730
Window holder Beckman Coulter Inc. 305037
12mm double sector Epon centerpiece Beckman Coulter Inc. 306493
Cell plug gaskets Beckman Coulter Inc. 327022
Cell housing plug Beckman Coulter Inc. 362327

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References

  1. Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
  2. Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
  3. analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
  4. Home - Workshops [Internet]. National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.

Comments

1 Comment

  1. Very clear. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2011 - 3:55 PM

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