تطبيق أساليب حركية متوقف تدفق بالتحقيق في آلية عمل لإصلاح الحمض النووي من البروتين

Published 3/31/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

MSH2 - Msh6 مسؤولة عن الشروع في إصلاح أخطاء النسخ المتماثل في الحمض النووي. هنا نقدم مقاربة حركية عابرة نحو فهم كيفية عمل هذا البروتين الحرجة. ويوضح التقرير توقف تدفق التجارب لقياس الحمض النووي ملزمة تقترن الكامنة والحركية أتباز MSH2 - Msh6 آلية العمل في إصلاح الحمض النووي.

Cite this Article

Copy Citation

Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

لا غنى عن التحليل الحركي عابرة لفهم طرق عمل الجزيئات البيولوجية ، لأن هذا النهج يعطي معلومات الآلية بما في ذلك تركيزات موقع نشط والثوابت الجوهرية التي تحكم سعر الدالة الجزيئات. في حالة من الإنزيمات ، على سبيل المثال ، وقياسات حالة عابرة أو المستقرة قبل تحديد وتوصيف الأحداث الفردية في مسار التفاعل ، بينما القياسات حالة ثابتة العائد فقط الكفاءة والنوعية الشاملة الحفاز. أحداث فردية مثل البروتين البروتين أو البروتين يجند - التفاعلات ومعدل الحد من التغييرات متعلق بتكوين غالبا ما تحدث في مقياس ميلي ثانية واحدة ، ويمكن قياسها بصورة مباشرة وتوقف تدفق الكيميائية إخماد أساليب التدفق. إعطاء إشارة ضوئية مثل مضان ، توقف تدفق بمثابة أداة قوية للتقدم والوصول إلى رد فعل من رصد الركيزة ملزم لاطلاق سراح المنتج والمحفز 1،2 دوران.

هنا ، نحن تقرير تطبيق وقف تدفق حركية للبحث في آلية عمل Msh6 - MSH2 ، وإصلاح الحمض النووي حقيقية النواة البروتين الذي يعترف الزوج قاعدة عدم التطابق والإدراج / حذف التكرار في الحمض النووي وإصلاح عدم تطابق إشارات (MMR) 3-5. وهو يفعل ذلك ، MSH2 - Msh6 يزيد من دقة تكرار الحمض النووي من ثلاثة أوامر من حجم (تردد يقلل من الخطأ ~ 10 -6 -9 قواعد to10) ، وبالتالي يساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم. ليس من المستغرب أن يرتبط الإنسان المعيبة MSH2 - Msh6 الدالة مع سرطان القولون الوراثي غير المرجلات وسرطانات أخرى متفرقة 6-8. من أجل فهم آلية عمل هذا البروتين DNA الأيضية حرجة ، ونحن الذين يحققون في ديناميات MSH2 - Msh6 التفاعل مع الحمض النووي متطابقة ، فضلا عن النشاط الذي يغذي أتباز أفعالها في MMR. ويتم قياس الحمض النووي ملزمة بسرعة عن طريق خلط MSH2 - Msh6 مع الحمض النووي يحتوي على 2 - aminopurine (2 - CNN) fluorophore مجاور لG : T عدم تطابق ومراقبة الزيادة الناتجة في 2 - aminopurine مضان في الوقت الحقيقي. ويتم قياس الحمض النووي عن طريق خلط تفارق قبل تشكيل MSH2 - G Msh6 : T (2 - CNN) معقدة مع عدم تطابق الحمض النووي فخ غير المسماة وانخفاض الرصد في مضان بمرور الوقت 9. تقاس قبل مطرد حركية أتباز الدولة عن تغيير في مضان من 7 diethylamino - 3 - (((((2 - maleimidyl) الإيثيل) الأمينية) الكربونيل) الكومارين) البروتين المسمى الفوسفات تجليد (MDCC - PBP) على الفوسفات ملزم بي) نشرته Msh6 - MSH2 التالية المائي ATP 9،10.

وتكشف البيانات ملزمة السريع لMsh6 - G MSH2 إلى : عدم تطابق تي وتشكيل لG - MSH2 Msh6 طويلة الأمد : T المعقدة ، والتي تؤدي بدورها في قمع المائي وتحقيق الاستقرار للاعبي التنس المحترفين من البروتين في شكل محدد للاعبي التنس المحترفين . رد فعل حركية واضحة لتقديم دعم الفرضية القائلة بأن بطولة متجهة MSH2 - Msh6 إشارات إصلاح الحمض النووي على قاعدة ملزمة لزوج غير متطابقة في الحلزون المزدوج.

ساهم F. نوح Biro وتشاي جي لهذه الورقة على قدم المساواة.

Protocol

ألف قياس حركية تجليد MSH2 Msh6 - DNA

1. إعداد نموذج للتجربة حركية ملزمة MSH2 Msh6 - DNA

إعداد الكواشف لتجربة مضان على أساس الحمض النووي الحركية ملزما لوقف تدفق مماثلة لتلك التي لتجربة التوازن على مقياس التألق. بل ينبغي أن يتم تنفيذ تحليل التوازن الملزمة الأولى لتقدير ثابت التفكك (K D) للتفاعل من أجل تحسين ظروف التفاعل للتحليل الحركي. توقف تدفق التجارب تتطلب كميات أكبر من المواد البيولوجية مقارنة مع توازن ثابت للدولة أو التجارب ، وبالتالي ، فإن هذا النهج هو الأكثر جدوى عندما كميات منخفضة مليغرام من البروتين 11،12 متاحة ويمكن تحضير كميات مماثلة من يغاندس أو شراؤها.

  1. نحن الإفراط في التعبير عن س. الجعوية MSH2 - Msh6 في E. القولونية وتنقية كميات مليغرام من البروتين بواسطة التبادل الأيوني اللوني (الشكل 1) 11.
  2. كواشف الحمض النووي يمكن أن يكون مع أو بدون fluorophore 2 - Aminopurine تصنيعه كيميائيا. نقوم بشراء 37 النوكليوتيدات طول واحد الذين تقطعت بهم السبل مع السلطات الوطنية المعينة تعديل Aminopurine - 2 ويصلب شقين مكملة لإعداد الحمض النووي على الوجهين مع Aminopurine - 2 مجاور لG : عدم تطابق T (الشكل 2). يمكن تنقية الحمض النووي من قبل الشركة المصنعة أو في المختبر بواسطة تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، وهذا الأخير يعطي عموما عائدات أعلى.
  3. الحمض النووي ملزم للحركية ، وإعداد مجموعة منفصلة : T (2 - CNN) عينات الحمض النووي والبروتينات MSH2 - Msh6 العازلة في الحمض النووي الملزمة (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 5 ملم MgCl 2 ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم). MSH2 - Msh6 وتركيزات الحمض النووي هي 0.8 ميكرومتر وميكرومتر 0.12 على التوالي ، والتي ينتج 0.4 ميكرومتر و 0.06 ميكرومتر تركيزات النهائي في تجربة واحدة مع خلط خلط نسبة 1:1. لحركية تفارق الحمض النووي ، وتحضير عينة واحدة تحتوي على 0.8 ميكرومتر MSH2 Msh6 - G و 0.12 ميكرومتر : T (2 - CNN) الحمض النووي ، وعينة أخرى مع 8 ميكرومتر غير المسماة G : T DNA بمثابة فخ مجانا MSH2 - Msh6. إعداد وتخزين العينات في الثلج. في ردود الفعل هذه ، وتركيز البروتين هو أعلى بكثير من نانومتر D K - 10 لMSH2 Msh6 الدنا DNA التفاعل وتركيز غير كاف للإشارة قوية ومضان (تحدد تجريبيا). وبلغ حجم العينة في 400 ميكرولتر كافية للحصول على نحو 10 في آثار الحركية (الجدول 1).
  4. استخدام المواد الكيميائية عالية الجودة التي تكون خالية من الشوائب الفلورسنت في البروتين والحمض النووي ، والاستعدادات العازلة. تصفية جميع المخازن عبر غشاء 0.2 ميكرومتر لتفادي انسداد توقف التدفق مع الجسيمات.
  5. يجب إذا fluorophore تمتص الضوء المرئي ، وإعداد والتجربة أن تجرى في ظروف الإضاءة الخافتة.

2. إعداد أداة لحركية الحمض النووي ملزم MSH2 - Msh6

صك توقف تدفق بسيط جدا من حيث المبدأ. ويستخدم محرك الأقراص بسرعة لدفع اثنين من الحلول في محرك الحقن في جهاز خلط ، فإن الحل تدفقات مختلطة ثم إلى خلية المراقبة لجمع البيانات (الشكل 3). نستخدم KinTek توقف التدفق ، الأمر الذي يتطلب انخفاض حجم العينة ، ويسمح الكشف عن واحدة أو متتابعة خلط المواد الداخلة في التفاعل ، من مجموعة متنوعة من الإشارات الضوئية ، وسهل جدا للاستخدام. توقف تدفق الأدوات متوفرة من عدة شركات مصنعة أخرى كذلك.

  1. من أجل إعداد وثيقة لوقف تدفق التجارب ، وتأكد من تشغيل الكمبيوتر وحدة تحكم إيقاف. بدوره على حمام ماء المتداولة لتعيين درجة حرارة الغرفة (25 درجة ج) لتبريد المصباح. اشعال المصباح. تعيين مستوحد اللون على طول موجة الإثارة المطلوبة (315 نانومتر في حالة Aminopurine - 2). بدوره عجلة شق لعرض الشق المطلوب (الإثارة تجريبيا التوازن fluorophore عالية مع photobleaching منخفض). بدوره على وحدة تحكم والكمبيوتر. بدوره على حمام ماء المتداولة لملء سترة المياه التي تحافظ على المواد الداخلة في التفاعل في درجة الحرارة المطلوبة خلال التجربة (30 درجة مئوية في حالة الجعوية S. MSH2 - Msh6).
  2. المقبل ، تنفيذ البرنامج توقف التدفق. بدوره على كشف الاختيار ، وهو في هذه الحالة عبارة عن أنبوب مضخم (PMT) مع مرشح التدخل المناسب لfluorophore (350 نانومتر قطع التصفية في حالة Aminopurine - 2). تطبيق الجهد لPMT. قياس الحالي المظلم لتصحيح أي ضجيج الخلفية الكهربائية.
  3. يجب غسل محرك الحقن توقف تدفق خلية المراقبة وقبل التحميل العينات. تعيين صمام تحميل نموذج لموقف LOAD. حقنة ملء 1ml بالماء ، منزوع الأيونات تصفيتها وإرفاقه مرفأ التحميل الموجود تحت حقنة محرك الأقراص ، ودفع المياه يدويا بين اثنين في المحاقن عدة مرات. تكرار هذه العملية مرتين لكل محرك المحاقن لاستخدامها في التجربة. المقبل ، وملء محرك الحقن بالماء لغسل خلية المراقبة. تبديل صمام تحميل نموذج لموقف ضد الحريق. استخدم محرك ضبط الحقنةالأمر الذي يسيطر على محرك الأقراص ، وانخفاض لوحة محرك لدفع المياه من خلال الملاحظة وخلية في خط الخروج. الحرص على عدم دفع المكبس إلى نهاية جدا من الحقنة محرك الأقراص. رفع لوحة القيادة. تبديل الصمام لموقف LOAD. تغسل يدويا المحاقن مع العازلة رد فعل وترك فارغا. الصك هو الآن جاهز للاستخدام.

3. MSH2 DNA - Msh6 التجربة ملزمة وتحليل البيانات

  1. نقل كل عينة من أنبوب لحقنة جديدة 1 مل. نعلق كل حقنة العينة إلى ميناء التحميل ودفع حل في حقنة محرك الأقراص. الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق دفع يدويا حل بين اثنين في المحاقن عدة مرات متقطعة مع مؤقتا. أقل لوحة محرك الأقراص حتى إنها تجري اتصالات مع المحاقن العلوي من محرك الأقراص. اسمحوا المواد المتفاعلة إلى درجة الحرارة المحيطة تتوازن لبضع دقائق.
  2. لجمع البيانات ، وفتح في الوقت المحدد / نافذة القنوات ، حدد القناة لجمع البيانات (PMT) ، وطريقة تحليل البيانات (الإسفار) ، والتي يتعين جمعها من عدد من اثار (تسديدات). أدخل وقت جمع البيانات التي سيتم خلالها جمع البيانات 1000 نقطة. وينبغي رصد رد فعل غير معروف على مدى عدة ثوان من أجل الكشف عن أي مراحل بطيئة. تقدير الوقت اللازم تجريبيا للوصول إلى توازن أو حالة ثابتة والوقت المحدد لجمع البيانات لحياة half ≥ 6. في حالة Msh6 - MSH2 الإطار الزمني الأمثل هو 2 ثانية لG : عدم تطابق حركية T ملزمة و60 ثانية لG : T تفارق حركية. الآن تعيين صمام لموقف إطلاق النار وانقر على زر جمع البيانات. هذا العمل يبدأ من الخلط MSH2 - Msh6 والحمض النووي ، دخول للتفاعل في الخلية المراقبة ، والإثارة من fluorophore 2 - Aminopurine وجمع إشارة مضان على مر الزمن. جمع ما لا يقل عن 5 آثار الحركية للحصول على بيانات عالية الجودة وحفظ الملف.
  3. عند اكتمال التجربة ، تشغيل المصباح. المحاقن وغسل بالماء خلية المراقبة كما هو موضح سابقا. ثم ، إيقاف بقية المعدات ، باستثناء حمام المياه المنتشرة. هو تعميم هذه المياه لمدة 15 دقيقة إضافية لتبريد المصباح.
  4. يمكن إجراء عمليات الرياضيات وتركيب البيانات مع برنامج KinTek نفسها ، من أجل الحصول على شعور من حركية التفاعل أثناء التجربة. ويمكن أيضا إجراء مزيد من التحليل أن يؤديها في المتوسط ​​آثار الحركية المتعددة والادخار وبلغ متوسط ​​تصدير الملف إلى غيرها من برامج التحليل / الرسوم البيانية البيانات.

4. ممثل عن النتائج حركية ملزمة MSH2 Msh6 - DNA

يمكن أن يكون لائقا عدم تطابق الحمض النووي T ، إلى وظيفة واحدة والأسي تسفر عن معدل سريع ك الربط المستمر على مقربة من 3 × 10 7 M - 1second - 1 (الشكل 4A) وبطيئة أ : بيانات الحركية لMSH2 - Msh6 التفاعل مع G ك التفكك المستمر OFF من 0.012 -1 الثانية (الشكل 4B) ، والذي يكشف عن أن MSH2 - Msh6 تربط بين G : عدم تطابق تي بسرعة وأشكال معقدة مستقرة جدا مع نصف عمر ما يقرب من 60 13 ثانية.

باء قياس حركية أتباز MSH2 - Msh6

1. إعداد نموذج للتجربة MSH2 - Msh6 حركية أتباز

  1. إعداد MSH2 - Msh6 وكواشف الحمض النووي كما هو موضح سابقا ، وذلك باستخدام الحمض النووي غير المسماة. بالإضافة إلى ذلك ، تنقية البروتين الفوسفات تجليد (PBP) من E. القولونية وتسميته مع fluorophore MDCC (الشكل 5) 14،15. MDCC - PBP يربط الفوسفات مجانا بسرعة ON يساوي 1 × 10 8 م -1 second -1) ومع تقارب عالية (K D = 100 نانومتر) ، مما أدى إلى زيادة كبيرة في مضان MDCC (الشكل 6). MDCC - PBP بالتالي مراسل قوية من قبل الدولة المطرد للاعبي التنس المحترفين المائي والافراج عن الفوسفات حركية 14،15. علما أنه من الضروري للحد من مستويات الفوسفات الخلفية لهذا الاختبار ، وبالتالي ، يجب استخدام الزجاج تجنبها تماما في جميع مراحل إعداد كاشف.
  2. إعداد عينة مع 4 ميكرومتر MSH2 - Msh6 البروتين مع او بدون G ميكرومتر (6) : T الحمض النووي ، والتي ينتج عنها 2 و 3 ميكرومتر ميكرومتر تركيزات النهائي في تجربة واحدة مع خلط خلط نسبة 1:1. علما ان التجارب السابقة للدولة ثابتة تتطلب تركيز انزيم عالية منذ إشارة الفائدة من واحد أو دوران أول تحولات الحفاز قليلة. تحضير عينة أخرى تحتوي على 1 ملم حل طازجة و 20 ميكرومتر ATP مراسل MDCC - PBP. إضافة 0.10 وحدات / مل من البيورين فسفوريلاز نوكليوزيد و 200 ميكرومتر 7 - methylguanosine للعينات ، والذي يعمل على التخلص من أي تلوث الفوسفات. احتضان هذه العينات في الثلج لمدة 20 دقيقة على الأقل (الجدول 2).

2. إعداد أداة لحركية أتباز MSH2 - Msh6

  1. إعداد صك توقف تدفق للتجارب كما هو موضح سابقا. بالإضافة إلى ذلك ، التخلص من الملوثات الفوسفات من المحاقن مع محرك 0.5 وحدة / مل نو البيورينcleoside فسفوريلاز و 200 ميكرومتر 7 - methylguanosine لمدة 20 دقيقة. تعيين الطول الموجي إلى 425 نانومتر الإثارة واستخدام 450 نانومتر قطع تصفية مع PMT للكشف عن MDCC - PBP مضان.

3. MSH2 - Msh6 أتباز التجربة وتحليل البيانات

  1. تحميل محرك الحقن مع العينات كما هو موضح سابقا. انقر على جمع البيانات لخلط MSH2 - Msh6 مع ATP وMDCC PBP ورصد اطلاق سراح فوسفات Msh6 - MSH2 والزيادة في جانب MDCC - PBP مضان على مر الزمن. جمع ما لا يقل عن 5 آثار الحركية للحصول على مجموعة البيانات عالية الجودة وحفظ الملف. متوسط ​​آثار الحركية المتعددة وتصدير ملف البيانات للتحليل.
  2. إعداد منحنى المعايرة لتحديد العلاقة الخطية بين تركيز الفوسفات ومضان MDCC - PBP. من أجل القيام بذلك ، مزيج MDCC - PBP مع تركيزات الفوسفات المختلفة في ظل الظروف التجريبية نفسها في توقف تدفق ، وقياس أقصى MDCC - PBP مضان في كل تركيز الفوسفات.
  3. مؤامرة الأقصى MDCC - PBP مضان مقابل كل تركيز الفوسفات لمنحنى المعايرة (الشكل 7) ، واستخدم للحصول على منحدر تركيز الفوسفات في ردود الفعل MSH2 - Msh6. مؤامرة تركيز الفوسفات مقابل الوقت وتناسب البيانات إلى الدالة الأسية والخطية. توضح هذه الوظيفة وابلا من قبل الدولة المطرد للاعبي التنس المحترفين المائي والافراج عن الفوسفات تليها مرحلة حالة مستقرة خطية من رد الفعل.

4. ممثل عن النتائج حركية أتباز MSH2 - Msh6

البيانات تظهر أن الحركية MSH2 - Msh6 hydrolyzes بطولة الفوسفات والنشرات بسرعة 1.4 -1 الثانية في دوران المحفز الأول. ويتبع هذه المرحلة من قبل خطوة بطيئة في رد الفعل الذي يحد من تحولات لاحقة أبطأ 7 أضعاف حالة ثابتة قدرها 0.2 القط ك -1 الثانية (الشكل 8A). ومع ذلك ، عندما قمعت منضما MSH2 - Msh6 على الحمض النووي متطابقة ، والتحلل من انفجار وإطلاق بطولة الفوسفات وMSH2 - Msh6 يبقى في حالة ATP محدد لفترة أطول.

الشكل 1
الشكل 1. تنقية س. الجعوية MSH2 - Msh6 من E. وقد استنسخ القولونية. MSH2 Msh6 وناقلات الجينات في pET11a والإفراط في المعبر عنها في E. BL21 القولونية (DE3) الخلايا. وكان مجمع تنقية البروتين اللوني على العمود SP - sepharose ، الهيبارين ، وراتنج Q - sepharose. SDS - PAGE تحليل الظاهرة هنا يحتوي على البروتين من كسور العمود Q - sepharose.

الشكل 2
هي صلب الشكل 2 التكميلية واحد الذين تقطعت بهم السبل لتشكيل سلطة وطنية معينة تحتوي على الوجهين G : عدم تطابق مع تي الادينوساين المجاورة (للتجارب أتباز) أو 2 - Aminopurine الفلورسنت التناظرية قاعدة الادينوساين (الحمض النووي للتجارب ملزم).

الشكل 3
توقف تدفق الشكل 3. تدفق المواد المتفاعلة في KinTek خلال تجربة خلط واحد.

الشكل 4A
الشكل 4A حركية MSH2 - Msh6 التفاعل مع G : عدم تطابق تي. خلط الحمض النووي على الوجهين (0.12 ميكرومتر) تحتوي على G : المتاخمة لAminopurine T - 2 - MSH2 مع Msh6 (0.8 ميكرومتر) يؤدي إلى زيادة في مضان بمرور الوقت ، وتعطي ك ثنائي الجزيء المستمر على معدل 2.4 = 10 7 م ق -1 -1 للتفاعل.

الشكل 4B
الشكل 4B حركية MSH2 - Msh6 التفاعل مع G : عدم تطابق تي. خلط قبل تشكيل MSH2 - G Msh6 : T (2 - CNN) المعقدة مع G الزائدة غير المسماة : T الحمض النووي (8 ميكرومتر) التي يعوض أي مجانا MSH2 - Msh6 يؤدي إلى انخفاض في مضان بمرور الوقت ، وتعطي معدل التفكك البطيء المستمر ، ك ق OFF 0.012 = -1 ، مشيرا الى مجمع مستقرة مع نصف عمر طويل من 60 ثانية ~. تركيزات النهائي : 0.4 ميكرومتر MSH2 - Msh6 ، 0.06 ميكرومتر الحمض النووي المسمى ، 4 ميكرومتر غير المسماة G : T فخ الحمض النووي.

الشكل 5
الشكل 5. MDCC - PBP التحضير. SDS - PAGE تحليل E. القولونية بروتين ملزمة الفوسفات (PBP) ، والمسمى المنقى مع fluorophore MDCC.

الشكل 6
الشكل 6. MDCC - PBP ردا على الفوسفات. معايرة MDCC - PBP مع النتائج (بي) الفوسفات في مضان MDCC متزايدة.

الرقم 7A
7A الرقم. التحضير للفوسفات (بي) القياسية المنحنى. يتم خلط MDCC - PBP (20 ميكرومتر) مع كميات متفاوتة من بي (0-8 ميكرومتر) anقياس د مضان بمرور الوقت حتى يتم التوصل إلى التوازن. تركيزات النهائي : 10 ميكرومتر MDCC - PBP ، 0-4 ميكرومتر بي.

الرقم 7B
7B الرقم. التحضير للفوسفات (بي) القياسية المنحنى. يتم رسم الحد الأقصى MDCC - PBP مضان مقابل [بي] إلى منحنى العائد القياسية. تم استخدام منحدر من الخط (0.383 ميكرومتر -1 في هذه الحالة) لتحويل MDCC - PBP مضان في تركيز بي.

الرقم 8A
الرقم 8A. MSH2 - Msh6 أتباز حركية. المعارض T الحمض النووي ، ومختلطة بسرعة مع ATP (1 ملم) وMDCC - PBP (20 ميكرومتر) موجة من التحلل وإطلاق بطولة بي : MSH2 - Msh6 (4 ميكرومتر) ، في غياب G. تحليل البيانات أن معدل الغلة المائي = 1.4 ق -1) والسعة (2 ميكرومتر (1) ؛ موقع في Msh6 - MSH2) من مرحلة الانفجار ، والتي تبعتها الخطية ، ومرحلة الدولة ثابتا عند معدل 0.4 ميكرومتر من ليالي -- 1 القط = 0.2 ق -1).

الرقم 8B
8B الرقم. MSH2 - Msh6 أتباز حركية. إضافة G : T الحمض النووي للتفاعل (6 ميكرومتر) يمنع انفجار المائي ATP ، استقرار معقدة في حالة ATP محدد. تركيزات النهائي : 2 ميكرومتر MSH2 - Msh6 و 500 ميكرومتر ATP ، 3 ميكرومتر الحمض النووي ، و 10 ميكرومتر MDCC - PBP. صالحة حركية انفجر بواسطة المعادلة التالية : [بي] = A 0 البريد ك ر + VT ، حيث [بي] هو تركيز الفوسفات ، والسعة 0 هو الاندفاع ، ك هو معدل الاندفاع المستمر والملاحظة الخامسة هي سرعة المرحلة الخطية القط = V / [MSH2 - Msh6]).

عينة بروتين الحمض النووي
الكاشف الأوراق المالية عامل المجلد ، ميكرولتر الأوراق المالية عامل المجلد ، ميكرولتر
MSH2 - Msh6 5 ميكرومتر 0.8 ميكرومتر 64 -- -- --
2ApG : T -- -- -- 10 ميكرومتر 0.12 ميكرومتر 4.8
العازلة 10X 1X 40 10X 1X 40
DDH 2 O -- -- 296 -- -- 355
مجموع 400 400

الجدول 1 رد فعل ملزم الحمض النووي

عينة بروتين بروتين DNA ATP
الكاشف الأوراق المالية عامل المجلد ، ميكرولتر الأوراق المالية عامل المجلد ، ميكرولتر الأوراق المالية عامل المجلد ، ميكرولتر
MSH2 - Msh6 20 ميكرون 4 ميكرومتر 80 20 ميكرون 4 ميكرومتر 80 -- -- --
G : T -- -- -- 100 6 24 -- -- --
ATP -- -- -- -- -- -- 50 ملي 1 ملم 8
7 - MEG 250x 1X 1.6 250x 1X 1.6 250x 1X 1.6
PNPase 100X 1X 4 100X 1X 4 100X 1X 4
PBP - MDCC 150 ميكرومتر 20 ميكرون 53.3 150 ميكرومتر 20 ميكرون 53.3 -- -- --
العازلة 10X 1X 40 10X 1X 40 10X 1X 40
DDH 2 O -- -- 221 -- -- 197 -- -- 346
مجموع 400 400 400

الجدول تفاعل أتباز 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على سبيل المثال لعدم تطابق الحمض النووي من البروتين ملزمة الموصوفة هنا يوضح قوة وفائدة أساليب حركية عابرة لدراسة آليات للجزيئات البيولوجية. شريطة توقف تدفق القياسات على مقياس دوران مرة واحدة أدلة لا لبس فيها للربط السريع ومحددة من MSH2 - Msh6 البروتين إلى زوج قاعدة متطابقة وتشكيل لبروتين معقد طويل عاش الحمض النووي في التفاعل X 9. وعلاوة على ذلك ، شريطة توقف التدفق (تدفق ويشفي) تحليل النشاط أتباز أدلة مباشرة لMSH2 - Msh6 التحول إلى التشكل ATP محدد بعد الحمض النووي متطابقة ملزمة 11،16. وافترض هذا التبديل للإشارة إلى إصلاح الحمض النووي 17،18. مثل هذه البيانات عالية الدقة الحركية ، جنبا إلى جنب مع بيانات عالية الدقة التكميلية الهيكلية ضرورية لتعزيز التفاهم وظيفة الجزيئات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التوظيف NSF (MMH) ، ومحمد باري غولدووتر منحة دراسية (FNB) ، وجائزة البحوث الجامعية ASBMB (CWD). ويعود الفضل في استنساخ للتعبير عن أكثر من PBP الدكتور مارتن ويب (MRC ، المملكة المتحدة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats