DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

Published 3/31/2010
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Biology

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Summary

Msh2 - Msh6는 DNA의 복제 오류의 복구를 시작 책임이 있습니다. 여기 우리는이 중요한 단백질의 작동 방식 이해 향해 과도 속도론의 접근 방식을 제시한다. 보고서는 결합된 DNA 바인딩과 DNA 수리의 행동의 Msh2 - Msh6 메커니즘을 기본 ATPase의 속도론을 측정하는 정지 흐름 실험을 보여줍니다.

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Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

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Abstract

이 접근법은 macromolecular 기능을 적용 활성 사이트 농도 및 내장 속도 상수를 포함 기계론의 정보를 산출 이후 과도 운동 분석, 생물 학적 macromolecules의 동작을 이해하는 데 필수입니다. 정상 상태 측정은 전체 촉매 효율과 특이성을 낼 반면, 효소의 경우, 예를 들어, 과도하거나 사전 안정된 상태 측정 식별 및 반응 경로에서 개별 이벤트를 특징. 이러한 단백질 - 단백질 또는 단백질 리간드 상호 작용과 속도 - 제한 conformational 변화에 따라 개별 사건들은 종종 밀리초 timescale 발생하고, 정지 - 흐름과 화학 잃게 흐름 방법으로 직접 측정할 수 있습니다. 이러한 형광으로 광 신호를 감안할 때 중지 흐름은 제품 릴리스 및 촉매 매출 1,2에 바인딩 기판에서 모니터링 반응 진행에 대한 강력하고 접근 도구로 제공하고 있습니다.

여기, 우리는 정지 흐름 속도론의 응용 프로그램 Msh2 - Msh6의 행동의 메커니즘,베이스 - 페어 불일치 및 DNA와 신호 불일치 복구 (MMR) 3-5의 삽입 / 삭제 루프를 인식 진핵세포의 DNA 수리 단백질을 프로브에 신고. 이렇게에 따라서 Msh2 - Msh6 증가 정도의 세 주문 (오류 주파수 ~ 10 -6 to10 -9 기지에서 감소)에 의해 DNA 복제의 정확성하고 게놈 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 되지 놀랍게도, 결함이있는 인간 Msh2 - Msh6 기능이 유전이 아닌 polyposis 결장암 및 기타 산발적 암 6-8와 연결되어 있습니다. 이 중요 DNA의 신진 대사 단백질의 행동의 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 일치하지 않는 DNA뿐만 아니라 ATPase 활동과 Msh2 - Msh6 상호 작용의 역학을 탐색하는 연료 MMR에서의 행동. T 불일치 및 모니터링 실시간으로 2 aminopu​​rine의 형광의 발생 증가 : DNA 바인딩은 빠르게 G에 인접한 2 aminopu​​rine (2 - AP = 연합 뉴스) 형광단를 포함하는 DNA와 Msh2 - Msh6를 혼합하여 측정됩니다. T (2 - AP = 연합 뉴스) 레이블이 지정되지 않은 트랩 DNA와 시간 9 이상 형광의 모니터링 감소와 불일치 단지 : DNA 분리는 사전에 형성 Msh2 - Msh6 G를 혼합하여 측정됩니다. 사전 꾸준한 상태 ATPase의 속도론은 7 diethylamino - 3 - ((((2 - maleimidyl) 에틸) 아미노) 카르보닐) coumarin) - 라벨 바인딩 인산염의 인산 바인딩 단백질 (MDCC - PBP) (의 형광의 변화에​​ 의해 측정 PI)는 ATP 가수 분해 9,10 다음 Msh2 - Msh6 발표.

T 불일치와 긴 Msh2 - Msh6 G 형성 : 데이터는 G에 Msh2 - Msh6의 급속한 결합 밝히지 T 복잡한을하는 ATP - 바운드 형태의 단백질이 ATP의 가수 분해 및 안정화의 억제에 차례 결과에 . 반응 속도론은 가설에 대한 명확한 지원을 제공하는 ATP - 바운드 Msh2 - Msh6 신호 이중 나선 구조에 일치하지 않는 기본 쌍을 결합에 DNA 수리가.

F. 노아 비로 및 지에 Zhai 똑같이이 문서에 기여.

Protocol

Msh2 - Msh6 DNA 바인딩 속도론의 A. 측정

1. Msh2 - Msh6 DNA 바인딩 속도론 실험을위한 샘플 준비

정지 흐름에 형광 기반의 운동 DNA 바인딩의 실험을위한 시약의 준비 fluorometer에 평형 실험 위해 비슷합니다. 사실 평형 바인딩 분석은 운동 분석을위한 반응 조건을 최적화하기 위해 상호 작용에 대한 해리 상수 (K D)를 추정 먼저 수행해야합니다. 정지 흐름 실험은 평형 또는 정상 상태 실험에 비해 생물 학적 물질의 큰 수량을 요구, 단백질의 낮은 밀리그램 금액 11,12 사용할 수 있으며, 리간드 비슷한 금액을 준비하거나 구입할 수있을 때 따라서, 접근이 가장 가능합니다.

  1. 우리는 이상 - 특급 S. cerevisiae E.에 Msh2 - Msh6 대장균 및 이온 교환 크로마 토그래피 (그림 1) 11 단백질의 정화 밀리그램 수량.
  2. 또는 2 Aminopu​​rine의 형광단없이 DNA의 시약은 화학적으로 합성 수 있습니다. 우리는 2 Aminopu​​rine로 수정 37 뉴클레오 티드 길이 단일 좌초 DNAs를 구입하고 G에 인접 2 Aminopu​​rine와 이중 DNA를 준비하는 두 보완 긴 어닐링 : T 불일치 (그림 2). DNA는 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing하여 제조 업체 또는 실험실에서 정화 수 있으며, 후자는 일반적으로 높은 수율을 제공합니다.
  3. T (2 - AP = 연합 뉴스) DNA 바인딩을 버퍼에 DNA와 Msh2 - Msh6 단백질 샘플 (20 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 5 MM MgCl 2, 100 MM NaCl) : DNA 바인딩 속도론 경우, 별도의 G를 준비합니다. Msh2 - Msh6 및 DNA의 농도 1:1 혼합 비율로 단일 혼합 실험에서 0.4 μm의 및 0.06 μm의 최종 농도를 산출 각각 0.8 μm의 및 0.12 μm의입니다. T (2 - AP = 연합 뉴스) DNA와 G를 레이블이 지정되지 않은 8 μm의 다른 예제 : DNA 분리 운동의 경우, 0.8 μm의 Msh2 - Msh6 및 0.12 μm의 G를 포함하는 한 샘플을 준비 T의 DNA 무료 Msh2 - Msh6위한 함정으로. 준비하고 얼음에 샘플을 저장합니다. 이 반응에서는 단백질 농도는 (경험적으로 결정) 강력한 형광 신호 충분 Msh2 - Msh6 - DNA 상호 작용과 DNA 농도에 대해 잘 10 NM K D 이상입니다. 샘플 당 400 μl의 볼륨은 약 10 운동 흔적 (표 1)을 구하는 충분합니다.
  4. 단백질, DNA, 그리고 버퍼 준비에 형광 불순물 무료 높은 품질의 화학 물질을 사용합니다. 입자와 중지 - 흐름을 막히는 것을 방지하기 위해 0.2 μm의 막 통해 모든 버퍼를 필터링합니다.
  5. 형광단은 가시 광선의 준비와 실험을 흡수하면 낮은 조명 조건 하에서 수행되어야합니다.

2. Msh2 - Msh6 DNA 바인딩 속도론을위한 악기 준비

정지 흐름 악기는 원칙적으로 매우 간단합니다. 그것은 빠르게 혼합 장치로 드라이브 주사기에 두 솔루션을 밀어 드라이브 모터를 사용하여 혼합 솔루션은 다음 데이터 수집 (그림 3) 관찰 세포에 흐르고 있습니다. 우리는 KinTek 낮은 샘플 볼륨이 필요 중지 흐름은, 광학 신호의 다양한 단일 또는 혼합 reactants의 연속 검출이 가능하고, 사용하기 매우 쉽습니다 사용합니다. 정지 흐름 악기뿐만 아니라 여러 다른 제조 업체에서 구할 수 있습니다.

  1. 실험 중지 흐름 악기를 준비하기 위해 컴퓨터와 컨트롤러가 꺼져 있는지 확인하십시오. 램프를 냉각, 주위 온도로 설정 순환 물 목욕 (C 25 데그)를 켭니다. 램프를 켜는. 원하는 여기 파장 (2 Aminopu​​rine의 경우 315 nm의)에 단색을 설정합니다. 원하는 슬릿 폭 (낮은 photobleaching과 경험적으로 균형 높은 형광단 여진)로 슬릿 바퀴를 돌립니다. 컨트롤러와 컴퓨터를 켭니다. 실험 (30 ° C S. cerevisiae의 Msh2 - Msh6의 경우) 중 원하는 온도에서 reactants을 유지 물 자켓을 채울 수있는 순환 물 목욕을 켜십시오.
  2. 다음, 정지 흐름 프로그램을 실행합니다. 이 경우에는 형광단 (350 nm의 컷 - 오프 2 Aminopu​​rine의 경우 필터)에 해당하는 간섭 필터 photomultiplier 튜브 (PMT)입니다 선택의 검출기를 켭니다. PMT에 전압을 적용합니다. 어떤 배경 전기 노이즈에 대한 해결하기 위해 어둠의 전류를 측정합니다.
  3. 정지 흐름 드라이브 주사기 및 관찰 세포는 샘플을 로딩하기 전에 씻어해야합니다. 부하 위치로 샘플 로딩 밸브를 설정합니다. deionized, 여과 물을 1ml 주사기를 채우기, 드라이브 주사기 아래에있는 로딩 포트에 연결하고 수동으로 두 개의 주사기 몇 번 사이의 물을 밀어. 실험에 사용되는 각 드라이브 주사기에 대해 두 번 과정을 반복합니다. 다음, 물로 드라이브 주사기가 관찰 세포를 씻어 입력합니다. 화재 위치로 샘플 로딩 밸브를 전환합니다. 조정 주사기 드라이브를 사용하여드라이브 모터 및 관찰 세포 통해 출구 라인에 물을 밀어 낮은 드라이브 플레이트를 제어 명령. 드라이브 주사기의 끝까지 플런저를 밀어 안됩니다. 드라이브 플레이트를 올립니다. LOAD 위치에 밸브를 전환합니다. 수동으로 반응 버퍼와 주사기를 씻어하고 비워 두십시오. 악기는 이제 사용할 수 있습니다.

3. Msh2 - Msh6 DNA 바인딩 실험 및 데이터 분석

  1. 튜브에서 새로운 하나의 주사기 ML 각 샘플을 전송합니다. 로딩 포트에 각각의 샘플 주사기를 첨부하여 드라이브 주사기에 솔루션을 누르십시오. 수동으로 간헐와 함께 몇 시간이 일시 중지 두 주사기 사이의 솔루션을 추진하여 모든 기포를 제거하는데주의를 기울여야. 드라이브 플레이트 로우어는 연락처 드라이브 주사기의 상단을 때까지. reactants가 몇 분 동안 주위 온도로 평형하자.
  2. 데이터 수집을 위해, 설정 시간 / 채널 창을 열고 데이터 분석의 데이터 수집 채널 (PMT), 모드 (형광)을 선택하고 흔적의 숫자는 (샷) 수집될 수 있습니다. 1000 데이터 포인트가 수집되는 동안 데이터 수집 시간을 입력합니다. 알 수없는 반응은 어떤 속도가 느린 단계를 감지하기 위해 몇 초 동안 모니터해야합니다. 경험적으로 평형 또는 정상 상태와 ≥ 6 반이 삶에 설정 데이터 수집 시간을 도달하는 데 필요한 시간을 예상하고있다. Msh2 - Msh6의 경우 최적의 시간 프레임은 G 2 초입니다 : T 분리 운동 : G를위한 T 불일치 바인딩 속도론 60 초. 이제 화재 위치로 밸브를 설정하고 데이터 수집 버튼을 클릭합니다. 이 작업은 관찰 세포, 2 Aminopu​​rine의 형광단의 여기와 시간이 지남에 따라 형광 신호의 수집에 반응 Msh2 - Msh6과 DNA, 항목의 혼합 시작합니다. 고품질의 데이터를 획득하고 파일을 저장할 최소 5 운동 추적을 수집합니다.
  3. 실험이 완료되면 램프의 켜십시오. 앞에서 설명한 것처럼 물을 주사기 및 관찰 세포 씻으십시오. 그런 다음, 순환 물 목욕을 제외하고, 장비의 나머지 부분을 해제합니다. 물이 램프를 냉각 추가 15 분 순환이다.
  4. 수학 운영 및 데이터 피팅은 실험 기간 동안 반응 속도론의 이해를 위해, KinTek 소프트웨어 자체와 함께 수행할 수 있습니다. 더 자세한 분석은 또한 여러 운동 성분을 평균하고 저장 및 다른 데이터 분석 / 그래프 소프트웨어 평균 파일을 수출하여 수행할 수 있습니다.

4. Msh2 - Msh6 DNA 바인딩 속도론에 대한 대표적인 결과를

G와 함께 Msh2 - Msh6 상호 작용에 대한 운동 데이터 : T 불일치의 DNA는 하나의 지수 함수에 맞게 3 가까이에서 빠르게 결합 속도 상수 K를 얻을 수있는 X 10 7 M - 일초 - 1 (그림 4A)과 느린 빠르게 T 불일치하고 닫습니다 60초 13 반 인생을 매우 안정 복잡한를 형성 : Msh2 - Msh6은 G 결속 것을 보여줍니다 0.012 초 -1 (그림 4B)의 해리 상수 k를 OFF.

Msh2 - Msh6 ATPase 속도론의 B. 측정

1. Msh2 - Msh6 ATPase 속도론 실험을위한 샘플 준비

  1. Msh2 - Msh6를 준비하고 DNA 검사 시약은 레이블이 지정되지 않은 DNA를 사용하여, 앞에서 설명한. 또한, E.부터 인산 바인딩 단백질 (PBP)을 정화 대장균과 MDCC의 형광단 (그림 5) 14,15로 레이블을 붙입니다. MDCC - PBP는 MDCC 형광 (그림 6)의 극적인 증가 결과, (1 X 10 8 M -1-1 같은지 ON K)를 높은 친화력 (K D = 100 nm의)와 함께 급속하게 무료로 인산염을 바인딩합니다. MDCC - PBP 따라서 이전 정상 상태 ATP의 가수 분해 및 인산 릴리스 속도론 14,15의 견고한 기자입니다. 그것이 분석에 대한 배경 인산 수준을 최소화하기 위해 필수적인 참고, 따라서, 유리의 사용은 엄격하게 시약 준비의 모든 단계에서 피해야한다.
  2. T DNA, 1시 1분 혼합 비율로 단일 혼합 실험 2 μm의 3 μm의 최종 농도를 산출 : 6 μm의 G 여부와 상관없이 Msh2 - Msh6 단백질 4 μm의와 샘플을 준비합니다. 관심의 신호가 단일 매출 또는 처음 몇 촉매 turnovers에서이기 때문에 미리 정상 상태 실험이 높은 효소 농도가 필요합니다. 갓 ATP와 20 μm의 MDCC - PBP 기자를 해산 1 ㎜를 포함하는 다른 샘플을 준비합니다. purine 뉴클레오 phosphorylase의 / ML 200 μm의 모든 오염 인산염을 청소하기 위해 제공하는 샘플에 7 methylguanosine 0.10 단위를 추가합니다. 최소한 20 분 (표 2) 얼음에 샘플을 품어.

2. Msh2 - Msh6 ATPase 속도론을위한 악기 준비

  1. 앞에서 설명한로 실험을위한 정지 흐름 악기를 준비합니다. 또한, 0.5 단위 / ML purine 뉴와 드라이브 주사기에서 인산 오염 물질을 청소cleoside의 phosphorylase 200 μm의 20 분 7 methylguanosine. 425 nm의로 여기 파장을 설정하고 MDCC - PBP의 형광 검출을위한 PMT와 450 nm의 컷 - 오프 필터를 사용합니다.

3. Msh2 - Msh6 ATPase 실험 및 데이터 분석

  1. 앞서 설명한 샘플 드라이브 주사기를로드합니다. Msh2 - Msh6 및 시간이 지남에 따라 MDCC - PBP 형광의 결합 증가에 의해 ATP와 MDCC - PBP 및 모니터 인산 릴리스 Msh2 - Msh6를 섞어 데이터를 수집을 클릭합니다. 높은 품질의 데이터 집합을 획득하고 파일을 저장할 최소 5 운동 추적을 수집합니다. 평균 여러 운동 흔적 및 분석을위한 데이터 파일을 내보낼 수 있습니다.
  2. 인산염 농도 및 MDCC - PBP 형광 사이의 선형 관계를 확인하기 위해 교정 곡선을 준비합니다. 이렇게하기 위해서는, 다른 정지 흐름에서 동일한 실험 조건 하에서 인산 농도, 각각의 인산 농도에서 측정 최대 MDCC - PBP 형광과 MDCC - PBP를 섞는다.
  3. 교정 곡선 (그림 7) 각 인산염 농도 대비 최대 MDCC - PBP 형광을 계획하고 Msh2 - Msh6 반응에서 인산 농도를 얻을 수있는 슬로프를 사용합니다. 플롯 인산염 시간 대비 집중 지수 및 선형 함수에 데이터를 맞습니다. 이 함수는 반응의 선형 안정 상태 위상 다음에 미리 일정한 상태 ATP의 가수 분해 및 인산 릴리스의 버스트에 대해 설명합니다.

4. Msh2 - Msh6 ATPase 속도론에 대한 대표적인 결과를

운동 데이터가 표시되는 Msh2 - Msh6 hydrolyzes ATP 빠르게 최초의 촉매 매출에 1.4 초 -1에서 자료 인산. 이 단계는 0.2 초 -1 (그림 8A)의 7 배 느린 정상 상태 K 고양이에 후속 turnovers 제한 반응의 느린 걸음 뒤에있다. 그러나, Msh2 - Msh6이 일치하지 않는 DNA, ATP의 가수 분해 및 인산 릴리스의 버스트에 바인딩된 경우는 억압하고, Msh2 - Msh6은 긴 시간에 대한 ATP - 바운드 상태로 유지됩니다.

그림 1
그림 1. S.의 정화 E.에서 cerevisiae Msh2 - Msh6 대장균. Msh2과 Msh6 유전자는 pET11a 벡터로 복제 및 E. 언덕에 표현했다 대장균 BL21 (DE3) 세포. 단백질 복합은 SP - 세파 로스, 헤파린 및 Q - 세파 로스 수지 이상의 칼럼 크로마 토그래피에 의해 정화되었다. 여기에 표시된 SDS - PAGE 분석 Q - 세파 로스 칼럼에서 단백질 분수가 포함되어 있습니다.

그림 2
. 인접 아데노신 (ATPase 실험) 또는 2 Aminopurine 아데노신의 형광 기본 아날로그 (DNA 바인딩 실험)과 T 불일치 : 그림 2 보완 단일 좌초 DNAs은 G를 포함하는 양면을 형성 annealed 있습니다.

그림 3
그림 3. KinTek에 reactants의 흐름은 단일 혼합 실험 도중 흐름을 중단되었습니다.

그림 4A
그림 4A G와 Msh2 - Msh6 상호 작용 속도론 :. T 일치하지 않습니다. G를 포함하는 이중 DNA (0.12 μm의)의 혼합 : Msh2 - Msh6 (0.8 μm의)와 2 Aminopurine에 인접한 T 것은 시간이 지남에 따라 형광의 증가로 연결하고, = 2.4 ON bimolecular 속도 상수 K 10 7 M -1 s를 산출 상호 작용을위한 -1.

그림 4B
그림 4B G와 Msh2 - Msh6 상호 작용 속도론 :. T 일치하지 않습니다. 혼합 미리 형성 Msh2 - Msh6 G : T (2 - AP = 연합 뉴스) 초과 레이블이 지정되지 않은 G 복잡한 : T DNA (8 μm의)는 함정는 무료 Msh2 - Msh6 리드 시간이 지남에 따라 형광 감소하고, 느린 분리 속도 상수 수율, ~ 60 초 긴 반 생활 안정 복잡한을 나타내는 = 0.012 S -1 OFF K. 최종 농도 : 0.4 μm의 Msh2 - Msh6, 라벨 DNA 0.06 μm의, G를 레이블이 지정되지 않은 4 μm의 : T의 DNA 트랩.

그림 5
그림 5. MDCC - PBP 준비. E.의 SDS - PAGE 분석 콜리 인산염 결합 단백질 (PBP)은 정화와 MDCC 형광단으로 표시.

그림 6
그림 6. 인산염을 MDCC - PBP 응답. 증가 MDCC의 형광에 인산 (PI) 결과 MDCC - PBP의 적정.

그림 7A
그림 7A. 인산염의 작성 (PI) 표준 곡선. - MDCC - PBP (20 μm의)는 파이의 다양한 양의 (8 μm의 0)과 혼합됩니다평형에 도달할 때까지 D 형광은 시간이 지남에 따라 측정. 최종 농도 : 10 μm의 MDCC - PBP, 0-4 μm의의 파이.

그림 7B
그림 7B. 인산염의 작성 (PI) 표준 곡선. 최대 MDCC - PBP 형광을 꾸몄다는 [파이] 표준 곡선을 얻을 수 있습니다. 라인 (이 경우에는 0.383 μm의 -1)의 슬로프는 파이 농도에 MDCC - PBP 형광 변환하는 데 사용됩니다.

그림 8A
그림 8A. Msh2 - Msh6 ATPase의 속도론. 부재 G에 Msh2 - Msh6 (4 μm의) : ATP (1 ㎜)과 MDCC - PBP (20 μm의)와 빠르게 혼합 T의 DNA는 ATP 가수 분해와 파이 릴리스의 폭발을 전시하고 있습니다. 데이터 분석 속도 (K 가수 분해 = 1.4 S -1)와 진폭 (2 μm의, Msh2 - Msh6 당 1 사이트) 수율 0.4 μm의의 s의 속도로 직선, 안정된 상태 단계 뒤에있는 버스트 단계의 서비스 - 1 (K 고양이 = 0.2 S -1).

그림 8B
그림 8B. Msh2 - Msh6 ATPase 속도론. G의 추가 : 반응하는 T의 DNA (6 μm의)는 ATP - 바운드 상태에서 복잡한 안정화, ATP 가수 분해의 버스트를 표시하지 않습니다. 최종 농도 : 2 μm의 Msh2 - Msh6, 500 μm의 ATP, 3 μm의의 DNA, 10 μm의 MDCC - PBP. 버스트 속도론은 다음 방정식에 의해 맞는 : [파이] = A 0 e - K T + VT, 어디에 [파이] 인산 농도는, 0, K는 관찰 버스트 속도 상수 버스트 진폭이다와 V는의 속도입니다 선형 위상 (K 고양이 = V / [Msh2 - Msh6]).

견본 단백질 DNA
시약 재고 일하는 μL 권, 재고 일하는 μL 권,
Msh2 - Msh6 5 μm의 0.8 μm의 64 - - -
2ApG : T - - - 10 μm의 0.12 μm의 4.8
버퍼 10X 1X 40 10X 1X 40
ddH 2 O - - 296 - - 355
합계 400 400

표 1 DNA 결합 반응

견본 단백질 단백질 DNA ATP
시약 재고 일하는 μL 권, 재고 일하는 μL 권, 재고 일하는 μL 권,
Msh2 - Msh6 20 μm의 4 μm의 80 20 μm의 4 μm의 80 - - -
G : T - - - 100 6 24 - - -
ATP - - - - - - 50 MM 1 ㎜ 8
7 - MEG 250x 1X 1.6 250x 1X 1.6 250x 1X 1.6
PNPase 100x 1X 4 100x 1X 4 100x 1X 4
PBP - MDCC 150 μm의 20 μm의 53.3 150 μm의 20 μm의 53.3 - - -
버퍼 10X 1X 40 10X 1X 40 10X 1X 40
ddH 2 O - - 221 - - 197 - - 346
합계 400 400 400

표 2 ATPase 반응

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Discussion

여기에 설명된 DNA 불일치 바인딩 단백질의 예제는 생물 학적 분자의 메커니즘을 연구에 대한 과도 운동 방법의 성능과 유틸리티를 보여줍니다. 단일 매출 시간 규모에서 중지 흐름 측정 일치하지 않는 기본 쌍과 반응 9 긴 단백질 X의 DNA 복합 형성에 Msh2 - Msh6 단백질의 신속하고 구체적인 구속력을 위해 모호하지 않은 증거를 제공했습니다. 또한, ATPase 활동 중단 흐름 (그리고 잃게 흐름) 분석은 구속력이 일치하지 않는 DNA 11,16 후 ATP - 바운드 형태로 Msh2 - Msh6 전환에 대한 직접적인 증거를 제공했습니다. 이 스위치는 DNA 복구 17,18 신호를 가상입니다. 보완 고해상도 구조 데이터와 함께 이러한 고해상도 운동 데이터는 macromolecular 기능의 이해를 발전하기 위해 필수적입니다.

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Acknowledgements

이 작품은 NSF 경력 수상 (MMH), 배리 M. 골드 워터 장학금 (FNB)과 ASBMB 학부 연구 수상 (CWD)에 의해 지원되었다. PBP 이상의 표현에 대한 복제가 친절하게 박사가 마틴 웨브 (MRC, 영국)에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

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References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

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