Toepassing van Stopped-flow Kinetics Methoden om het werkingsmechanisme van een DNA Repair eiwit Onderzoek

Published 3/31/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

MSH2-MSH6 is verantwoordelijk voor het initiëren reparatie van replicatie fouten in DNA. Hier presenteren wij een voorbijgaande kinetiek benadering begrijpen hoe deze kritische eiwit werkt. Het rapport toont gestopt-flow experimenten voor het meten van de gekoppelde DNA-binding en ATPase kinetiek onderliggende MSH2-MSH6 werkingsmechanisme bij DNA-herstel.

Cite this Article

Copy Citation

Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. J. Vis. Exp. (37), e1874, doi:10.3791/1874 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transient kinetische analyse is onmisbaar voor het begrijpen van de werking van biologische macromoleculen, omdat deze aanpak levert mechanistische informatie met inbegrip van actieve website concentraties en de intrinsieke groeisnelheid constanten die macromoleculaire functie regeren. In het geval van enzymen, bijvoorbeeld, voorbijgaande of pre-steady-state metingen identificeren en karakteriseren van afzonderlijke gebeurtenissen in de reactie weg, terwijl de steady state metingen alleen yield algemene katalytische efficiëntie en specificiteit. Individuele gebeurtenissen zoals eiwit-eiwit of eiwit-ligand interacties en snelheidsbeperkende conformationele veranderingen komen vaak voor in de milliseconde tijdschaal, en kunnen direct worden gemeten door gestopt-flow en chemische-lessen stroom methoden. Gegeven een optisch signaal, zoals fluorescentie, stopte-flow dient als een krachtig en toegankelijk instrument voor het toezicht op de voortgang reactie van substraat binding aan productversie en katalytische omzet van 1,2.

Hier melden wij de toepassing van stopten-flow kinetiek naar het werkingsmechanisme van MSH2-MSH6, een eukaryotische DNA-reparatie-eiwit dat base-paar mismatches en insertie / deletie loops in DNA en signalen mismatch repair (MMR) 3-5 herkent sonde. Daarbij, MSH2-MSH6 verhoogt de nauwkeurigheid van DNA-replicatie door drie ordes van grootte (fout frequentie af van ~ 10 -6 tot 10 -9 bases), en dus helpt bij het ​​beschermen genomische integriteit. Niet verrassend, is gebrekkige menselijke MSH2-MSH6 functie in verband met erfelijke niet-polypose colonkanker en andere vormen van kanker sporadische 6-8. Om het werkingsmechanisme van deze cruciale DNA metabole eiwitten te begrijpen, zijn we het sonderen van de dynamiek van MSH2-MSH6 interactie met de verkeerde DNA evenals de ATPase activiteit die brandstoffen zijn acties in BMR. DNA-binding wordt gemeten door snel mengen MSH2-MSH6 met DNA met een 2-aminopurine (2-Ap) fluorofoor grenzend aan een G: T mismatch en bewaken van de daaruit voortvloeiende toename van 2-aminopurine fluorescentie in real time. DNA dissociatie wordt gemeten door het mengen van voorgevormde MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) mismatch complex met niet-gemerkte DNA-trap en monitoring afname in fluorescentie na verloop van tijd 9. Pre-steady state ATPase kinetiek worden gemeten door de verandering in de fluorescentie van 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) ethyl) amino) carbonyl) coumarine)-gelabeld fosfaat bindend eiwit (MDCC-PBP) op de binding fosfaat ( pi) uitgebracht door MSH2-MSH6 volgende ATP hydrolyse 9,10.

Uit de gegevens blijkt een snelle binding van MSH2-MSH6 naar een G: T mismatch en de vorming van een langlevende MSH2-MSH6 G: T complex, wat op zijn beurt resulteert in onderdrukking van ATP hydrolyse en stabilisatie van het eiwit in een ATP-gebonden vorm . De reactie kinetiek duidelijke ondersteuning voor de hypothese dat ATP-gebonden MSH2-MSH6 signalen DNA-herstel op een verkeerde binding basepaar in de dubbele helix.

F. Noah Biro en Jie Zhai bijgedragen aan dit document ook.

Protocol

A. Meting van MSH2-MSH6 DNA bindingskinetiek

1. Monstervoorbereiding voor het MSH2-MSH6 DNA bindingskinetiek experiment

De voorbereiding van de reagentia voor een fluorescentie-based kinetic DNA-bindende experiment op een gestopte-flow is vergelijkbaar met dat voor een evenwicht experiment op een fluorometer. Inderdaad evenwicht binding analyse moeten eerst worden uitgevoerd om de dissociatie constante (K D) schatting voor de interactie met het oog op reactie-omstandigheden te optimaliseren voor kinetische analyse. Stopped-flow experimenten vereisen grotere hoeveelheden van biologische materialen vergeleken met het evenwicht of een steady-state experimenten, dus de aanpak is het meest haalbaar is bij geringe milligram hoeveelheden eiwit zijn beschikbaar 11,12 en vergelijkbare bedragen van liganden kan worden bereid of gekocht.

  1. We over-express S. cerevisiae MSH2-MSH6 in E. coli en zuiveren milligram hoeveelheden van het eiwit door middel van ionenwisselingschromatografie (fig. 1) 11.
  2. DNA-reagentia met of zonder de 2-aminopurine fluorofoor kunnen chemisch gesynthetiseerd worden. Wij kopen 37 nucleotide lengte enkelstrengs DNA's gemodificeerd met 2-aminopurine en gloeien twee complementaire strengen DNA duplex te bereiden met 2-aminopurine grenzend aan een G: T mismatch (afb. 2). DNA kan worden gezuiverd door de fabrikant of in het laboratorium door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese, de laatste over het algemeen geeft een hogere opbrengst.
  3. Voor DNA bindingskinetiek, voor te bereiden aparte G: T (2-Ap) DNA en MSH2-MSH6 eiwit samples in DNA binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl). MSH2-MSH6 en DNA-concentraties zijn 0,8 uM en 0,12 uM respectievelijk, waarvan 0,4 uM en 0,06 uM eindconcentraties levert in een enkel experiment met het mengen van 01:01 mengverhouding. Voor DNA dissociatie kinetiek, bereiden een monster met 0,8 uM MSH2-MSH6 en 0,12 uM G: T (2-Ap) DNA, en een ander monster met 8 uM ongelabelde G: T DNA als een val voor gratis MSH2-MSH6. Voor te bereiden en op te slaan de monsters op het ijs. In deze reacties, eiwitconcentratie is ruim boven de 10 nM K D voor MSH2-MSH6-DNA-interactie en DNA-concentratie is voldoende voor een robuuste fluorescentie-signaal (empirisch bepaald). Een volume van 400 ul per monster is voldoende om ongeveer 10 kinetische sporen (tabel 1) te verkrijgen.
  4. Gebruik van hoogwaardige chemische producten die vrij zijn van fluorescerende onzuiverheden in het eiwit, DNA, en buffer preparaten. Filter alle buffers door een 0,2 um membraan om te voorkomen dat verstoppingen de gestopte-stroom met deeltjes.
  5. Als de fluorofoor absorbeert zichtbaar licht, de voorbereiding en experiment moet worden uitgevoerd onder omstandigheden met weinig licht.

2. Instrument voorbereiding op het MSH2-MSH6 DNA-bindende kinetiek

Een stopte-flow instrument is vrij eenvoudig in principe. Het maakt gebruik van een aandrijfmotor om snel twee oplossingen in drive spuiten te duwen in een menginrichting, de gemengde oplossing stroomt vervolgens in een observatie cel voor het verzamelen van gegevens (afb. 3). We gebruiken de KinTek gestopt-flow, die lage monster volume vereist, maakt het mogelijk een of sequentiële mengen van reactanten, de detectie van een verscheidenheid van optische signalen, en is zeer makkelijk te gebruiken. Stopped-flow instrumenten zijn verkrijgbaar bij diverse andere fabrikanten ook.

  1. Met het oog op de gestopte-flow instrument voor te bereiden op experimenten, zorg ervoor dat de computer en controller zijn uitgeschakeld. Zet de circulerende ingesteld waterbad tot omgevingstemperatuur (25 °, C) om de lamp af te koelen. Ontsteek de lamp. Stel de monochromator op de gewenste golflengte (315 nm in het geval van 2-aminopurine). Draai de sleuf wiel om de gewenste spleet breedte (empirisch evenwicht te hoog fluorofoor excitatie met een lage fotobleken). Zet op de controller en de computer. Zet het circulerende water bad aan het water jas die de reactanten onderhoudt op een gewenste temperatuur tijdens het experiment (30 ° C in het geval van S. cerevisiae MSH2-MSH6) te vullen.
  2. Vervolgens voeren de gestopte-flow-programma. Schakel de detector van de keuze, die in dit geval is een fotomultiplicatorbuis (PMT) met een interferentie filter geschikt is voor de fluorofoor (350 nm cut-off filter in het geval van 2-aminopurine). Van toepassing spanning naar de PMT. Meet de donkere stroom om te corrigeren voor de achtergrond elektrische ruis.
  3. De gestopte-flow rijden spuiten en observatie cel moet vooraf te worden gereinigd laden van de monsters. Stel de Sample Loading Valve op de LOAD stand. Vul een 1ml spuit met gedemineraliseerd, gefilterd water, voeg het bij het laden-poort die zich onder het rijden spuit, en handmatig het water duwen tussen de twee spuiten een paar keer. Tweemaal herhalen het proces voor elke schijf spuit om te worden gebruikt in het experiment. Vervolgens vult u de drive spuiten met water tot de observatie cel wassen. Schakel de Sample Loading Valve op de FIRE positie. Gebruik de Aanpassen spuit Driveopdracht, waarmee de aandrijfmotor, en laat de aandrijving plaat om water te duwen door de observatie cel en naar de uitgang lijn controles. Zorg ervoor dat u de zuiger duwen tot het einde van de schijf spuit. Til de aandrijving plaat. Zet de klep op de LOAD stand. Handmatig wassen de spuiten met de reactie buffer en laat leeg. Het instrument is nu klaar voor gebruik.

3. MSH2-MSH6 DNA-binding te experimenteren en data-analyse

  1. Transfer elk monster uit de buis naar een vers 1 ml spuit. Bevestig elk monster spuit naar een laad-poort en druk op de oplossing in het station spuit. Zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen door het handmatig indrukken van de oplossing tussen de twee spuiten een paar keer met intermitterende pauzes. Laat de schijf plaat totdat deze contact maakt met de bovenkant van de schijf spuiten. Laat de reactanten tot omgevingstemperatuur equilibreren voor een paar minuten.
  2. Voor het verzamelen van gegevens, opent u de ingestelde tijd / Channels venster, selecteer het verzamelen van gegevens kanaal (PMT), wijze van data-analyse (Fluorescentie), en het aantal sporen (Shots) te verzamelen. Voer de gegevens verzamelen tijd waarin 1000 data punten worden verzameld. Een onbekende reactie moeten worden gecontroleerd gedurende een aantal seconden om een ​​langzame fase op te sporen. Empirisch schatten de tijd die nodig is om evenwicht of steady-state en stel het verzamelen van gegevens tijd om te ≥ 6 half leven te bereiken. In het geval van MSH2-MSH6 de optimale tijd is 2 seconden voor G: T mismatch bindingskinetiek en 60 seconden voor G: T dissociatie kinetiek. Stel nu de klep naar de FIRE positie en klik op de knop Gegevens verzamelen. Deze actie initieert vermenging van MSH2-MSH6 en DNA, toegang van de reactie in de observatie cel, excitatie van de 2-aminopurine fluorofoor en het verzamelen van de fluorescentie-signaal in de tijd. Verzamel minstens 5 kinetische sporen om hoogwaardige gegevens te verkrijgen en het bestand op te slaan.
  3. Wanneer het experiment voltooid is, draai van de lamp. Was de spuiten en observatie cel met water zoals eerder beschreven. Schakel dan de rest van de apparatuur, met uitzondering van het circulerende water bad. Het water circuleert om een ​​extra 15 minuten om de lamp af te koelen.
  4. Wiskundige bewerkingen en gegevens montage kan uitgevoerd worden met de KinTek software zelf, om een ​​gevoel van de reactiekinetiek krijgen tijdens het experiment. Verdere analyse kan ook worden uitgevoerd door het gemiddelde kinetische meerdere sporen en op te slaan en exporteren van de gemiddelde bestand naar andere data-analyse / grafische software.

4. Representatieve resultaten voor MSH2-MSH6 DNA bindingskinetiek

Kinetische gegevens voor MSH2-MSH6 interacties met G: T mismatch DNA, kunnen worden geschikt om een exponentiële functie en leveren een snelle bindend snelheidsconstante K op bijna 3 x 10 7 M-1 seconde-1 (Fig. 4A) en een langzame dissociatieconstante k OFF van 0.012 seconden -1 (fig. 4B), waaruit blijkt dat het MSH2-MSH6 een G bindt: T mismatch snel en vormt een zeer stabiel complex met een half leven bijna 60 seconden 13.

B. Meten van MSH2-MSH6 ATPase Kinetics

1. Monstervoorbereiding voor het MSH2-MSH6 ATPase kinetiek experiment

  1. Bereid MSH2-en MSH6 DNA reagentia zoals eerder beschreven, met behulp van niet-gemerkte DNA. Daarnaast zuiveren fosfaat bindend eiwit (PBP) van E. coli en het etiket met de MDCC fluorofoor (fig. 5) 14,15. MDCC-PBP bindt fosfaten vrij snel (k ON gelijk aan 1 x 10 8 M -1 seconde -1) en met hoge affiniteit (K D = 100 nM), wat resulteert in een dramatische toename in MDCC fluorescentie (Fig. 6). MDCC-PBP is daarom een robuuste verslaggever van de pre-steady state ATP hydrolyse en fosfaat vrijgavekinetiek 14,15. Merk op dat het essentieel is te minimaliseren achtergrond fosfaat niveaus voor deze test, daarom het gebruik van glas moet strikt worden vermeden in alle fasen van het reagens voorbereiding.
  2. Bereid een monster met 4 uM MSH2-MSH6-eiwit, met of zonder 6 uM G: T-DNA, waarvan 2 uM en 3 uM eindconcentraties levert in een enkel experiment met het mengen van 01:01 mengverhouding. Merk op dat pre-steady-state experimenten hoge concentraties enzym nodig, omdat het signaal van belang is van een enkele omzet of de eerste paar katalytische omzet. Bereid een ander monster met 1 mM vers opgelost ATP en 20 uM MDCC-PBP reporter. Voeg 0,10 eenheden / ml van purine nucleoside fosforylase en 200 uM 7-methylguanosine op de monsters, die dient om dweilen elke vervuilende fosfaat. Incubeer de monsters op ijs gedurende ten minste 20 minuten (tabel 2).

2. Instrument voorbereiding op het MSH2-MSH6 ATPase kinetiek

  1. Bereid de gestopte-flow instrument voor experimenten zoals eerder beschreven. Daarnaast ruimen fosfaat verontreiniging uit het station spuiten met 0,5 eenheden / ml purine nucleoside fosforylase en 200 uM 7-methylguanosine gedurende 20 minuten. Stel de excitatie golflengte 425 nm en gebruik een 450 nm cut-off filter met de PMT voor de detectie van MDCC-PBP fluorescentie.

3. MSH2-MSH6 ATPase experiment en data-analyse

  1. Laad de drive-injectiespuiten met de monsters zoals eerder beschreven. Klik op Gegevens verzamelen om MSH2-MSH6 mix met ATP en MDCC-PBP en monitoren fosfaat vrij te maken door MSH2-en MSH6 de gekoppelde toename van MDCC-PBP fluorescentie in de tijd. Verzamel minstens 5 kinetische sporen naar een hoge kwaliteit data set te verkrijgen en het bestand op te slaan. Gemiddelde kinetische meerdere sporen en de gegevens exporteren bestand voor analyse.
  2. Maak een ijklijn met de lineaire relatie tussen fosfaatconcentratie en MDCC-PBP fluorescentie te bepalen. Om dit te doen, mix MDCC-PBP met verschillende fosfaatconcentraties onder dezelfde experimentele omstandigheden in de gestopte-flow, en meet een maximale MDCC-PBP fluorescentie bij elke fosfaat concentratie.
  3. Plot de maximale MDCC-PBP fluorescentie ten opzichte van elkaar fosfaatconcentratie voor de kalibratie-curve (Fig. 7) en gebruik de helling naar fosfaatconcentratie te krijgen in de MSH2-MSH6 reacties. Plot fosfaatconcentratie tegen de tijd en plaats de gegevens naar een exponentiële en lineaire functie. Deze functie beschrijft een uitbarsting van pre-steady state ATP hydrolyse en fosfaat los, gevolgd door de lineaire steady state fase van de reactie.

4. Representatieve resultaten voor MSH2-MSH6 ATPase kinetiek

De kinetische gegevens tonen aan dat MSH2-MSH6 hydrolyseert ATP en releases fosfaat snel op 1,4 seconden -1 in de eerste katalytische omzet. Deze fase wordt gevolgd door een langzame stap in de reactie dat latere omzet beperkt tot een 7-voudig langzamer steady state k kat van 0,2 seconden -1 (Fig. 8A). Evenwel, bij het MSH2-MSH6 gebonden is aan verkeerde DNA, de uitbarsting van ATP hydrolyse en fosfaat los onderdrukt, en MSH2-MSH6 blijft in een ATP-gebonden toestand voor een langere tijd.

Figuur 1
Figuur 1. Zuivering van S. cerevisiae MSH2-MSH6 van E. coli. MSH2 en MSH6 genen werden gekloneerd in pET11a vector en over-expressie gebracht in E. coli BL21 (DE3) cellen. Het eiwit complex werd gezuiverd door kolomchromatografie over SP-Sepharose, heparine, en Q-sepharose harsen. SDS-PAGE-analyse hier getoond bevat proteïne fracties uit een Q-sepharose kolom.

Figuur 2
. Figuur 2 Aanvullende enkelstrengs DNA worden verhit tot een duplex met G-vorm: T mismatch met een aangrenzende Adenosine (voor ATPase experimenten) of 2-aminopurine fluorescerende basis analoog van adenosine (bij de DNA binding experimenten).

Figuur 3
Figuur 3. Flow van reactanten in de KinTek gestopt-flow tijdens een experiment mengen.

Figuur 4a
Figuur 4a Kinetiek van MSH2-MSH6 interactie met een G:. T mismatch. Het mengen van duplex DNA (0,12 uM) met een G: T naast de 2-aminopurine met MSH2-MSH6 (0,8 uM) leidt tot toename van de fluorescentie in de tijd, en levert een bimoleculaire snelheidsconstante k OP = 2,4 10 7 M -1 s -1 voor de interactie.

Figuur 4b
Figuur 4b Kinetiek van MSH2-MSH6 interactie met een G:. T mismatch. Het mengen van voorgevormde MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complex met een overschot ongelabelde G: T-DNA (8 uM) dat de vallen een vrije MSH2-MSH6 leidt tot in fluorescentie na verloop van tijd, en levert een langzame dissociatie snelheidsconstante, k OFF = 0,012 s-1, wat wijst op een stabiel complex met een lange halfwaardetijd van ~ 60 seconden. Uiteindelijke concentraties: 0,4 uM MSH2-MSH6, 0,06 uM gelabeld DNA, 4 uM ongelabelde G: T DNA val.

Figuur 5
Figuur 5. MDCC-PBP voorbereiding. SDS-PAGE analyse van E. coli fosfaat bindend eiwit (PBP), gezuiverd en voorzien van de MDCC fluorofoor.

Figuur 6
Figuur 6. MDCC-PBP reactie op fosfaat. Titratie van MDCC-PBP met fosfaat (Pi) resulteert in een toenemende MDCC fluorescentie.

Figuur 7a
Figuur 7a. Voorbereiding van de fosfaat (Pi) standaardcurve. MDCC-PBP (20 pM) wordt gemengd met verschillende hoeveelheden van Pi (0 - 8 uM) eend fluorescentie gemeten over de tijd totdat evenwicht is bereikt. Uiteindelijke concentraties: 10 uM MDCC-PBP, 0 - 4 micrometer Pi.

Figuur 7b
Figuur 7b. Voorbereiding van de fosfaat (Pi) standaardcurve. Maximum MDCC-PBP fluorescentie is uitgezet tegen [Pi] om een standaard curve rendement. De helling van de lijn (0.383 uM -1 in dit geval) wordt gebruikt om MDCC-PBP fluorescentie te zetten in Pi concentratie.

Figuur 8a
Figuur 8a. MSH2-MSH6 ATPase kinetiek. MSH2-MSH6 (4 pM), bij het ontbreken G: T-DNA, snel vermengd met ATP (1 mm) en MDCC-PBP (20 pM) vertoont een uitbarsting van ATP hydrolyse en Pi release. Data-analyse geeft de snelheid (k hydrolyse = 1,4 s -1) en amplitude (2 micrometer, een site per MSH2-MSH6) van de uitbarsting fase, die wordt gevolgd door een lineaire, steady state fase bij een snelheid van 0,4 uM s - een (k cat = 0,2 s -1).

Figuur 8b
Figuur 8b. MSH2-MSH6 ATPase kinetiek. Toevoeging van G: T-DNA naar de reactie (6 uM) onderdrukt de uitbarsting van ATP hydrolyse, het stabiliseren van het complex in een ATP-gebonden toestand. Uiteindelijke concentraties: 2 uM MSH2-MSH6, 500 uM ATP, 3 uM DNA, 10 uM MDCC-PBP. Burst kinetiek geschikt zijn door de volgende vergelijking: [Pi] = A 0 e-k + t Vt, waarbij [Pi] is fosfaatconcentratie, A 0 is de burst amplitude, k is de waargenomen burst rate constant en V is de snelheid van de lineaire fase (k cat = V / [MSH2-MSH6]).

Monster Eiwit DNA
Reagens Voorraad Werkzaam Vol, pi Voorraad Werkzaam Vol, pi
MSH2-MSH6 5 uM 0,8 uM 64 - - -
2ApG: T - - - 10 uM 0,12 uM 4.8
buffer 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 296 - - 355
Totaal 400 400

Tabel 1 DNA-binding reactie

Monster Eiwit Eiwit-DNA ATP
Reagens Voorraad Werkzaam Vol, pi Voorraad Werkzaam Vol, pi Voorraad Werkzaam Vol, pi
MSH2-MSH6 20 uM 4 uM 80 20 uM 4 uM 80 - - -
G: T - - - 100 6 24 - - -
ATP - - - - - - 50 mM 1 mM 8
7-MEG 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6 250x 1x 1.6
PNPase 100x 1x 4 100x 1x 4 100x 1x 4
PBP-MDCC 150 uM 20 uM 53,3 150 uM 20 uM 53,3 - - -
Buffer 10x 1x 40 10x 1x 40 10x 1x 40
DDH 2 O - - 221 - - 197 - - 346
Totaal 400 400 400

Tabel 2 ATPase reactie

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het voorbeeld van een DNA mismatch bindend eiwit hier beschreven illustreert de kracht en het nut van voorbijgaande kinetische methoden voor het bestuderen van de mechanismen van biologische moleculen. Stopped-flow metingen op de single omzet tijdschaal voorzien ondubbelzinnig bewijs voor een snelle en specifieke binding van MSH2-MSH6-eiwit aan een verkeerde basenparen en de vorming van een lange levensduur eiwit X DNA-complex in de reactie 9. Bovendien stopte-flow (en lessen-flow) analyse van de ATPase activiteit die direct bewijs voor MSH2-MSH6 te schakelen op een ATP-gebonden conformatie na binding verkeerde DNA 11,16. Deze schakelaar wordt verondersteld om DNA te repareren 17,18 signaal. Zulke hoge-resolutie kinetische gegevens, samen met complementaire hoge-resolutie structurele gegevens zijn essentieel voor het begrip van macromoleculaire functie te bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een NSF Career Award (MMH), een Barry Goldwater M. beurs (FNB) en een ASBMB Undergraduate Research Award (CWD). De kloon voor de over-expressie van PBP werd vriendelijk verschaft door Dr Martin Webb (MRC, Verenigd Koninkrijk).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 G DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap) DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 T DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9, (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407, (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407, (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26, (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129, (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366, (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5, (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42, (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319, (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37, (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43, (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91, (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22, (1), 39-49 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats