Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

Biology
 

Summary

El destino de la replisoma después de un choque con la cabeza-en la RNA polimerasa (RNAP) es desconocida. Nos encontramos con que los puestos replisoma en colisión con un RNAP de frente, pero se reanuda después de desplazar el alargamiento de la RNAP a partir del ADN. Mfd promueve reinicie la replicación, facilitando el desplazamiento de la RNAP después de la colisión.

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Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase. J. Vis. Exp. (38), e1919, doi:10.3791/1919 (2010).

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Abstract

Los estudios in vivo sugieren que las horquillas de replicación se detiene debido a los encuentros con la cabeza-en los complejos de transcripción. Sin embargo, el destino de los replisoma y la RNA polimerasa (RNAP), tras una colisión frontal se desconoce. Aquí, nos encontramos con que la E. coli puestos replisoma en colisión con la cabeza-en complejo de transcripción, pero en lugar de colapsarse, el tenedor de replicación sigue siendo muy estable y, finalmente, se reanuda la elongación después de desplazar la RNAP a partir del ADN. También encontramos que el factor de acoplamiento de transcripción de reparación, MFD, promueve reiniciar directo del tenedor después de la colisión, al facilitar el desplazamiento de la RNAP. Estos resultados demuestran la estabilidad intrínseca del aparato de reproducción y un nuevo papel para la vía de reparación transcripción de acoplamiento en la promoción de la replicación pasado un bloque de RNAP.

Protocol

Este método se utilizó en la investigación publicada en Pomerantz y O'Donnell, Ciencia 327, 590 a 592 (2010) .

1. Montaje de un complejo RNAP elongación detenido se llevó a cabo de la siguiente manera:

500 nM concentración final de E. RNAP coli σ 70 SE se mezcló con la concentración de 5 nM final de una plantilla de ADN biotinilado 3,6 kb que contenía el promotor T7A1 en 100 l de tampón A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% de glicerol) por 10 min a 37 ° C. 100 mM de APU y 40 mM de cada uno de GTP, ATP, CTP y se añadieron durante 10 min a 37 ° C.

2. Inmovilización del complejo RNAP elongación detenido en perlas de estreptavidina se realizó de la siguiente manera:

200 l de bolas recubiertas de estreptavidina magnética (Invitrogen) se añadieron a la reacción anterior por 10 min a temperatura ambiente.

3. Purificación del inmovilizado complejo detuvo elongación RNAP se realizó de la siguiente manera:

Las perlas (desde arriba) se lavaron 5 veces con 0,9 ml de un buffer que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg / ml de heparina, y 20 mg / ml ssDNA (Se retiró el sobrenadante después de cada paso de lavado por separación magnética.) A continuación, el bolas se lavaron dos veces con 0,9 ml de tampón A.

4. Formación de un tenedor de replicación aguas abajo con respecto a la cabeza de RNAP se realizó de la siguiente manera:

Las perlas (desde arriba) se resuspendieron en 100 l de New England Biolabs buffer 4 y 10 unidades de Sap I (New England Biolabs) se añadió durante 10 min a 37 ° C. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A y se resuspendió en 50 l de tampón T4 rápida reacción de ligación (New England Biolabs). 2 l de ligasa rápida T4 (New England Biolabs) se añadió junto con la concentración nM 6 final de la pre-templado de ADN horquilla (RP10, RP22, RP25) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A.

5. Asamblea de la replisoma y la iniciación de la síntesis del filamento principal en el tenedor de replicación se llevó a cabo de la siguiente manera:

448 pmol de DnaB (como hexamer) se incubó con las perlas de 150 l de tampón A (20 mM Tris-glicerol Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) durante 30 s en 23 ° C. 4,9 pmol de Pol III * (Pol III HE menos β), 15 pmol de β, 2 mM de ATP, y 60 M cada uno de dGTP y dATP se han añadido a un volumen de 200 l y se incubaron en un 5 minutos a 37 ° C. La replicación se inició en la adición de 10 mg SSB y 24 mM de cada uno de dATP y dTTP, junto con [α-32P] dTTP y [α-32P] dCTP (actividad específica, 3,000-5,000 cpm / pmol) hasta un volumen final de 250 l. Reacciones se terminaron después de 10 minutos después de añadir 12 l de 500 mM EDTA.

6. Purificación y concentración de la radio-etiquetados de ADN se realizó de la siguiente manera:

Las perlas (desde arriba) se hierve después de la reacción se terminó con el fin de eliminar el ADN de las cuentas. Cualquier ADN residual que queda unido a las cuentas fue eliminado por el tratamiento de las cuentas con proteinasa K en un volumen de 10 ul por 30 min a 50 ° C. Las cuentas fueron hervidos y luego se retiró el sobrenadante por separación magnética. El sobrenadante combinado que contiene el ADN fue purificado utilizando el kit Qiagen PCR de limpieza. Purificada de radio-etiquetados de ADN fueron analizadas en un gel de agarosa alcalinas.

* Replicación en la ausencia de una cabeza de RNAP detuvo complejo de elongación se realizó el anterior, sin embargo, σ 70 fue omitido.

Los resultados representativos:

Colisión de la replisoma con una cabeza de RNAP usualmente resulta en dos productos de 2,5 kb y 3,6 kb de longitud. El producto de 2,5 kb representa la longitud del ADN a partir de el tenedor a la RNAP se detuvo y los resultados de replisoma estancamiento en colisión con la RNAP. El producto representa 3,6 kb de longitud completa de ADN y los resultados de cualquiera de ocupación incompleta del promotor por RNAP o parcial replisoma la lectura a través de la RNAP de frente. Un buen resultado o precisa demuestra que aproximadamente el 50% de larga duración en el ADN que se produce. Sin embargo, en algunos casos menos de ocupación del promotor por RNAP se produce y un mayor porcentaje de larga duración en el ADN se observa desde una población mayor de replisomes no encuentro un RNAP de frente. Replicación en la ausencia de un resultado RNAP se detuvo en un solo cuerpo entero de ADN (3,6 kb).

Figura 1
Figura. 1 El replisoma se ve impedida por un RNAP de frente.
(A) de un montaje experimental. A E. columnai RNAP complejo de elongación detenido fue montado en un ADN biotinilado que contiene el promotor T7A1 como se describió previamente (9). En pocas palabras, un complejo de elongación detenido se formó 20 bps abajo del promotor mediante la incubación de holoenzima RNAP con el ADN biotinilado durante 10 minutos seguido por la adición de Apu, GTP, ATP, CTP y por un período de 10 min. Cuentas de estreptavidina se añadieron durante 10 minutos después, las perlas se lavaron cinco veces cada uno con 0,9 ml de solución tampón que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg de heparina / ml, y 100 nm de una sola hebra de ADN para eliminar inestable ADN RNAP complejos y el exceso de PNT . El ADN fue digerido con Sapi, se lavan, y se liga a una horquilla de ADN antes de recocido. Las bolas se lavaron una vez más antes de la asamblea de los replisoma. El promotor se encuentra a 2,5 kb del tenedor y se orienta a la transcripción directa hacia el tenedor. (B) DnaB se añade entonces la replisoma fue ensamblado y replicación se inició ya sea en presencia (carril 2) o ausencia (carril 1) de un de frente RNAP.

Disclosures

Lavar el complejo de elongación detenido vinculado a las perlas con elevado de sal es fundamental a fin de eliminar cualquier inestable o no específicamente obligado moléculas RNAP. RNAP tiene una afinidad muy alta para las estructuras de plantilla-primer tipo de ADN. Por lo tanto, es necesario eliminar este tipo no específico de ADN RNAP complejos con el fin de realizar la replicación de la cartilla de plantilla. La concentración de la radio-etiquetados de ADN utilizando el kit Qiagen de purificación de PCR también es fundamental a fin de obtener una alta relación señal que la radiactividad que se puede observar en el gel.

Acknowledgements

Estamos especialmente agradecidos a Seth Darst para proporcionar proteínas RNAP y MFD y vectores de expresión. También estamos gracias Sergei Borukhov para proporcionar Greb y Zhang Dan de apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (MOD) y por Marie-Josee Kravis y Henry Fellowship de la Universidad Rockefeller (RTP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads M-270 Invitrogen 653.05
SapI New England Biolabs R0569S
T4 Quick Ligase New England Biolabs M2200S
PCR Purification Kit Qiagen 28104

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References

  1. Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
  2. Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
  3. Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
  4. McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
  5. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
  6. Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
  7. Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
  8. Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
  9. Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
  10. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
  11. Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
  12. Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
  13. Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
  14. Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
  16. Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
  17. Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
  18. Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
  19. George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).

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