Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Xenopus эмбрионального эпителия являются идеальной системой модель для изучения ячейки поведения, таких как развитие полярности и изменением формы во время эпителиальных морфогенеза. Традиционные гистологии основных образцов все чаще дополняется жить-клеточной конфокальной микроскопии. Здесь мы показываем, методы, чтобы изолировать лягушки тканей и визуализировать жить эпителиальных клеток и их цитоскелета с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Joshi, S. D., Davidson, L. A. Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1949, doi:10.3791/1949 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эмбриональные клетки эпителия служить идеальной моделью для изучения морфогенеза, где многоклеточной ткани претерпевают изменения в их геометрии, например, изменения в клеточной поверхности и высоту ячейки, и где клетки подвергаются митоза и миграции. Кроме того, эпителиальные клетки могут также регулируют морфогенетические движения в прилегающих тканях

Protocol

Прежде чем вы начнете

  1. Обобщить ограничен мРНК из линеаризованных шаблон ДНК, кодирующей флуоресцентно меткой белка и мРНК очищают стандартными методами (AmpliCap Транскрипция комплект; Эпицентр биотехнологии, Madison WI). мРНК должны быть аликвоты для одноразового использования времени в 0,2 мл пробирок центрифуге и хранить при температуре -80 ° C.
  2. Стандартные методы для получения яиц, искусственное оплодотворение, и удаление яйца пальто были описаны ранее 2. Процедура получения яйца Xenopus laevis самка лягушки было показано ранее 3. Удобряйте яйца в пробирке сразу же после их получения от самки лягушек использованием яички ранее изолированными от мужчин лягушку. Де-желе яйца 20 минут после оплодотворения и ввести мРНК, белки, ДНК, или декстран немедленно обеспечить достаточное распространение microinjected реагентов. Инъекции более 1 часа после оплодотворения часто не диффундируют из места инъекции.
  3. Ооцитов микроинъекции было продемонстрировано ранее 4 с помощью давления клапан управляемый инжектор (PLI-100, Гарвардский аппарат). Следуйте подобный метод для потребителей инъекционных мРНК в животных полушарие лягушки эмбрионов на 1 - до 4-клеточной стадии. Передача оплодотворенных эмбрионов до 3% Ficoll (Sigma, Сент-Луис MO) в 1x МБС (МБС-Ficoll) и microinject с желаемым объемом (от 2 до 4 п) ограничен из GFP кодирования мРНК, ориентированные на мембране (MEM-GFP) или F -актина (МО-GFP). Для получения равномерного распределения вводят мРНК в 4 равноотстоящих сайтов в животных полюса. Эмбрионы могут оставаться в MBS-Ficoll в течение нескольких часов, но должны быть переданы до 1 / 3 х MBS до гаструляции начинается.

Необходимые материалы (пункты, отмеченные *, показаны на рис 1.):

  1. Препарирование стереомикроскопа с волоконно-оптической подсветкой. Охлаждением этапе вскрытия рекомендуется, но необязательно.
  2. Волосы инструменты (нож волос и петлей) *.
  3. Пинцет (Дюмон # 5 нержавеющей стали; изобразительных инструментов науки, Foster City, CA) *.
  4. Измененный Барта Saline эмбриона питательных сред (МБС, 88 мМ NaCl, 2,4 мМ NaHCO 3, 1 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,41 мМ (КАНО 3) 2, 0,82 мМ MgSO 4, 10 мМ HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, Сент-Луис MO)).
  5. Данильчик для Эми эксплантов питательных сред (DFA, 53 мМ NaCl, 2, 5 мМ Na 2 CO 3, 4,5 ммоль калия глюконат, 32 ммоль натрия глюконат, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4). Включите 0,1% бычьего сывороточного альбумина с DFA (БСА; A7906, Sigma-Aldrich). DFA должно быть стерильно фильтруют, но может быть аликвоты в 50 мл конические пробирки и хранили при температуре -20 ° C. Антибиотики и противогрибковые (0,8% в средствах массовой информации; A5955, Sigma-Aldrich) должны быть добавлены к свежей талой DFA для подавления бактериальной или грибковой роста.
  6. 60 или 100 мм чашках Петри *.
  7. Большая стеклянная крышка, 45 на 50 мм (12-544-F, # 1,5; Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Хэмпшир) *.
  8. Малый стеклянной крышкой, 24 на 40 мм (12-544C, # 1,5; Fisher Scientific).
  9. Силиконовая смазка (высокий вакуум, Dow Chemical), загружаемые в шприц "уплотнения-пушечный" *.
  10. Custom акриловых камер или нейлона шайбы (мелкие детали, Инк; Мирамар, штат Флорида) *. Custom камеры могут быть измельчают в механической мастерской с 25 на 50 на 5 мм акриловая блок обеспечить внутреннюю камеру, что составляет 1,2 см на 2,8 см. Эта камера имеет рабочий объем 1,68 мл. Дополнительные шайбы нейлон может быть выбран в различных размерах, мы предпочитаем размеры совместимы с диаметром 18 мм покровные круговой стекла.
  11. Алмазный карандаш *.

Часть 1: Удаление эксплантов животных крышкой

  1. Культура эмбрионы желаемого стадии 5 в 1 / 3 MBS х. Темпы развития можно управлять с помощью культуры температур от 15 до 21 ° С, так что эксперименты можно сделать в любое удобное время суток. Номер температуры могут быть использованы, но эмбрионы будут развиваться быстрее.
  2. Трансфер эмбрионов DFA.
  3. Удалить желточной оболочки при использовании щипцов.
  4. Под рассекает стереомикроскопа, акцизов эксплантов животных шапка волос использованием ножей и волос петли 6. Используйте волос петля для поддержки или удерживать эмбрион на должность и волосы-нож, чтобы сделать небольшой надрез в животном полюс эмбрионов. Использование повторяющихся "Флик-разрезы" с волосами-нож, чтобы сделать разрез 360 ° до удаления эктодермы животных колпачок с эмбрионом. С практикой, можно сделать гладкую сокращений, которые приводят к минимальным ущербом для эксплантов или лизированных клеток на поле (рис. 2).
  5. Повторите шаг 4 для акцизных от 3 до 4 эксплантов животных крышкой и перейдите к части 2. Нужно быть быстрым, сокращая эксплантов, так как они имеют тенденцию мяч быстро. Охлаждением этапе вскрытия может замедлить процесс или же вы можете сделать меньше эксплантов.

Часть 2: Подготовка камеры, нагрузка эксплантов, и печатью камера для длительного культуры

  1. Использованиесиликоновая смазка для клея или печать акриловые камеры большой стеклянной крышкой.
  2. Для снижения адгезии эксплантатов к стеклу слой стекла в камере с не-клей подложки путем инкубации камеры от 2 до 4 часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С с 1% BSA в 1 / 3 х MBS (BSA -MBS).
  3. Подготовка небольшие фрагменты покровное (около 2 до 8 мм) с использованием карандаша алмаза. Предварительно шерсть фрагментов с BSA-MBS.
  4. Промыть BSA-MBS из камеры и заменить сред с DFA.
  5. Акцизный животных шапка эксплантов (ы) (часть 1;. Рис 2А) и трансфер в камере. Позиция каждого эксплантов использованием волос цикла (с эпителиального слоя направлен к нижней части камеры) и аккуратно исправить эксплантов в месте с фрагментом стекло покровное состоялась малыми мазки высокой жира вакуумом (рис. 2б). Будьте очень осторожны при нажатии покровное поскольку чрезмерное давление может легко разбить эксплантов. Несколько эксплантов может быть загружен в каждой камере в зависимости от размера от небольших фрагментов покровного используется для хранения эксплантов на месте. С практикой до 20 эксплантатов могут быть загружены в акриловой камеры описано здесь. Заполните камеры с DFA до вечера с открытием в верхней части. Использование силиконовой смазки для герметизации верхней части камеры с 24 на 40 мм стеклянной крышкой. Добавить или удалить DFA уменьшить пузырьков воздуха в герметичной камере и промокните переполнения из камеры.
  6. Это герметичная камера позволит долгосрочных культуры и жить-изображений эксплантов животных шапка через большие, нижнее стекло поверхности камеры. Очень важно сохранить нижнее стекло поверхности камеры от грязи, жира, или средств массовой информации для последующей обработки изображений. Мы рекомендуем подготовки бумаги полотенце дном чашки Петри для хранения камер, они готовы для работы с изображениями.

Часть 3: Высокое разрешение изображения живых конфокальной микроскопии

Протокол в этом разделе был разработан для использования конфокальной микроскопии доступными для нашей лаборатории (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL). Различные конфокальные микроскопы могут потребовать небольшой модификацией, и мы рекомендуем пользователям следить за их соответствующие инструкции по эксплуатации.

  1. Power-процесс создания образа системы, инициализировать столик микроскопа и включите лазеры подходят для флуорофоров, т.е. Аргон лазер для флуоресцеина или EGFP и 543 гелий-неоновый лазер для родамина или ППП.
  2. Место камеры жилья эксплантов на столик микроскопа. До позиционирования камеры двигаться соответствующие цели на свои места. Мы рекомендуем использовать высокую числовую апертуру 20x воздуха цель (0,7 па) для первоначального изображения, мы рекомендуем using1.4 Н. А. 40x или 63x масло для целей высоким разрешением и отслеживания большую клетку-полей. (Обратите внимание: как только нефть погружения применяется к цели осторожностью использовать при использовании воздушной цели, чтобы вы случайно не провал цели в масле.) Используйте небольшой вес держать камеру на месте.
  3. Используйте ярко-поле или флуоресценцию освещение и настроить фокус, пока не увидите апикальных концах поверхностные клетки. Будьте осторожны, чтобы не "крах" Цель в камеру базы. Избегайте в том числе и производство воздушных пузырей при использовании масла цели погружения. Как только образцы расположены использовании "грубой" режим позиционирования, изменение "тонкой" режим позиционирования.
  4. Рекомендации по настройке конфокальной для живого изображения:
    1. Мощность лазера должна быть как можно ниже: 1) чтобы предотвратить обесцвечивание, 2) для предотвращения фототоксических эффекты, и 3) для предотвращения случайного срабатывания ячейки изменения формы 7. Лазерная потребляемая мощность варьируется в зависимости от уровня экспрессии и тип молекулярных журналистам выразил в эмбрионы.
    2. Использование сканирования формата 1024 х 1024 пикселей для живого изображения, поскольку он обеспечивает хорошее разрешение изображения. Если вам нужно очень высокой частотой кадров (минимум 1.3s для нашей системы), затем с помощью сканирования формата 512 на 512 пикселей. Это позволит уменьшить разрешение изображения, но все еще может быть достаточно, чтобы извлекать разумное количество информации.
    3. Отрегулируйте спектральном диапазоне излучения, дихроичных, и возбуждения фильтров по мере необходимости.
    4. Отрегулируйте конфокальной отверстие в диапазоне от 1 до 1,5 Эйри единиц.
    5. ФЭУ получить должны находиться на минимальном уровне, чтобы снизить уровень шума при этом обеспечивает достаточную сигнал для выявления клеточных структур и белков локализации.
    6. Отрегулируйте уровень черного смещение регулировать фон для улучшения качества изображений.
    7. Шаги (1) по (6), многократно применяется для получения наилучшего качества изображения возможно. Качество изображения должны разрешить структуру или локализованные белки с интенсивности пикселов в широком динамическом диапазоне. Если количественный анализы цели не должно быть минимальным числом нулевой интенсивности или насыщенных пикселей.
    8. Шаги (1), (3), (5), и (6) должны быть повторены для каждой дополнительной флуоресценции канал для получения наилучшего качества изображения возможно.
    9. Когда изображение двух или флуоресцентных зондов, важно гарантировать, что есть минимальный спектральный проступание из одного белка спектры излучения второго белка. Проступание может быть проверена путем снижения мощности лазерного возбуждения первого белка и наблюдения сигнала производится в длинах волн используется вторая белка. Спектральный проступание может быть уменьшена более жесткими выбор фильтров или за счет снижения мощности лазера для возбуждения и повышения коэффициента усиления используется для обнаружения первого белка.
  5. С конфокальной настроены при помощи этих руководящих принципов должна быть возможность для захвата отдельных изображений в одной глубины очага в режиме XY (рис. 3А).
  6. Если кто-то заинтересован в сборе покадровой фильмов динамически происходящих процессов, таких как изменение формы в процессе клеточного сокращение 7, нужно выбрать один из следующих альтернативных конфокальной режимах:
    1. XYT: Этот режим позволяет собирать серии изображений с течением времени, без изменения Z-плоскости. Мы используем этот режим, чтобы наблюдать эндогенных колебаний в эпителиальных клетках. Как правило, мы приобретаем одного кадра каждые 5 секунд в течение 20 минут наблюдать эндогенного изменения или формы изменения, вызванные внешней стимуляции эпителиальных клеток. Выбор частоты кадров полностью зависит от того, что есть заинтересованность в наблюдении и как динамический процесс.
    2. XYZ: Используя этот режим, мы можем собрать одну Z-серии стеком через эпителиальные клетки. Наши настройки по умолчанию для сбора Z-серии 0,1 мкм шаги в диапазоне от 5 мкм. Мы используем этот режим, чтобы определить цитоскелета изменения происходят только на определенные должности, например, на уровне adherens переходы, или везде в клетках коры головного мозга.
    3. XZT (рис. 3А): Этот режим используется в основном для наблюдения быстрых изменений в апикальной-базальной организации клеток в эпителии. Этот режим пользуется популярностью за его полезность, подтверждающие, что в режиме XYT является надежным корреспондент изменения в апикальной области клетки и что конфокальной захвата изображений не дрейфует вдоль Z-оси.
    4. XYZT: Это объединяет XYZ и XYT режимах. Этот режим может дать богатую информацию о полной апикально-базальной динамика эпителия, но не спешит приобретать полный стек изображений и может привести к серьезному снижению жизнеспособности клеток из-за фотообесцвечивания и фототоксических эффектов.
  7. Качество изображения может быть улучшена в ограниченной степени, используя один или комбинацию из четырех следующих подходов: 1) линия среднем, 2) линия накопления, 3) рамка усреднения, и 4) кадра накопления. Эти режимы усреднения для получения изображения можно улучшить качество изображения, но снизит жизнеспособность клеток и требуют больше времени для сбора изображений.
  8. Со всеми настройками тщательно скорректированы, собирать и сохранять изображения, Z-серии, и временных рядов данных на внешний жесткий диск, USB-карты памяти, или подключаемых к сети сервера.
  9. После того как вы завершили свой эксперимент, нижняя цель по безопасности, чистые масла из объективных и столик микроскопа с объективом бумаги и выключения конфокальной системы.

Часть 4: Live-изображений F-актина микрофиламентов

Как было показано в Части 3, мембраны локализации белка чле-GFP может быть использован для флуоресцентно этикетке клеточных мембран. Live-визуализацию субклеточных компонентов достигается за счет использования других белков. Белка, такие как moesin-GFP, который содержит F-актин-связывающим доменом может быть использовано для обозначения F-актина в живых клетках. Аналогичные стратегии для живого-клеточной визуализации и сбора покадровой последовательности следовать процедурам, изложенным в части 3. Live-изображений F-актин включает в себя больше навыков, чем микроскопии изображений чле-GFP так как структуры все более и более сильно локализованы, чем мембраны. Например, любые мелкие пузырьки в иммерсионного масла может привести к аберрации артефакты, такие как размытие или переменной яркости снимка. Кроме того, любой небольшой дрейф в фокальной или Z-плоскости может вызвать moesin-GFP помечены корковых F-актин, чтобы переместить вне фокуса. Таким образом, следует вновь удвоить усилия по стабилизации этапе эксплантов, и камеру при визуализации корковых F-актин и других суб-клеточных белков. XY и XZT изображения, показывающие moesin-GFP помечены F-актина приведены в качестве примеров (рис. 3Б, Б ').

Часть 5: анализ изображений

Изображения и покадровой последовательностей, полученных от живых-клеточной конфокальной сессии могут быть проанализированы с целью проверки гипотезы относительно изменения формы или структуры белка локализации. Невооруженным глазом зачастую является наилучшим инструментом для качественного анализа, но могут быть дополнены или автоматизированные методы анализа изображений для извлечения количественных данных. Данные изображения от Leica системы конфокальной могут быть сохранены в открытом формате, такие как. TIF файлы в формате изображения или частной собственностью. LIF формат, который сохраняет подробную информацию о микроскопом состояние во время приобретения. Оба. TIF и. LIF файлы можно сразу же ввозимые в свободном доступе программы анализа изображений Изображение J (Rasband, WS, ImageJ, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) использование био-форматы плагинов (Кевин Eliceiri, локусов, Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин). В следующем разделе мы предлагаем два примера, чтобы проиллюстрировать, каким образом пользователи могут начать количественный анализ конфокальной данные изображения.

  1. Откройте любой. TIF или. LIF файл (рис. 4, а ') с помощью File> Open
  2. Пример 1: Измерение ячейки области эпителиальные клетки (рис. 4B к B''').
    1. Выбрать Регион в ANALYZE> ИЗМЕРЕНИЯ SET.
    2. Выберите многоугольник выбора инструмента из панели инструментов J Изображение и контуры клетки.
    3. Откройте диспетчер ROI от ANALYZE> Инструменты> ROI MANAGER и добавить схему, чтобы его, нажав [Control-т], что ярлык для добавления каких-либо новых "области интереса" или ROI для менеджера ROI. Важно, чтобы добавить этот выбор и сохранить рентабельность набора, так как вы можете вернуться в более позднее время и делать какие-либо другие измерения параметра. Наборы сохранены трансформирования (нажмите кнопку "Сохранить") может быть перезагружен позже для дальнейшего анализа.
    4. Можно повторить шаг (с) с любым количеством ячеек в образ и добавить трансформирования в рентабельность инвестиций Manager. Как только один имеет достаточный трансформирования записан, нажмите кнопку "МЕРА" в ROI Manager. В окне результатов, можно теперь видеть ОБЛАСТИ против ROI. Размеры изображения имеют соответствующие значения в измерении параметров.
  3. Пример 2: Измерьте интенсивность клеточной мембраны (рис. 4С С''').
    1. Выберите "Прямая линия" инструмент из панели инструментов J изображения и нарисуйте линии на изображении, перпендикулярной к клеточной мембране интерес и пересекает мембрану. Эта прямая линия выбора другого типа ROI и может добавить к ROI менеджер как указано выше.
    2. Участок относительные интенсивности в произвольных единицах по ANALYZE ПРОФИЛЬ УЧАСТОК>. Сохраните его как образ и как список значений, нажав кнопку Сохранить и СПИСОК> Файл> Сохранить как соответственно на участке окна.
  4. Различные количественные измерения могут быть сделаны с помощью изображения J в зависимости от исследователей интересы и какие гипотезы проходят испытания. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Сиэтл, Вашингтон) или Сигма Участок (Systat Software Inc, Сан-Хосе, Калифорния) могут быть использованы для построения данных в графическом виде. Дополнительные примеры анализа изображений были представлены ранее 7.

Рисунок 1
Рисунок 1. Необходимые материалы. ) Необходимые инструменты для микрохирургии и монтаж культуры камеры. Чашка Петри (), большой скольжения крышки (б), волосы инструменты (с), алмазный карандаш (г), щипцы (е), силиконовая смазка "пистолет" (е), нейлоновые шайбы (г) и пользовательский язык и акриловые камеры (ч). Б) Крупный план волосы ножом, и C) волосы цикла.

Рисунок 2
Рисунок 2. Иссечение эксплантов животных шапки. ) Схема микрохирургических манипуляций используется для удаления эксплантов животных колпачок (г со спины, V, вентральных; ах, животное полушарии, VH, вегетативного полушария). B) Схема эксплантов (е) расположенных под покровное фрагмент удерживается на месте силиконовой смазки (ы) с апикальной поверхности соединенный с BSA стекла с покрытием (г). Эксплантов расположен так, эпителиального пласта находится ближе всего к объектива микроскопа (м). С) Животный шапка эксплантов (красная стрелка) культивируют в DFA и размещены в акриловой камеры (синяя стрелка) в крупном покровного стекла (черная стрелка) и удерживается на месте стекла фрагмента покровное и силиконовая смазка.

Рисунок 3
Рисунок 3. Эпителиальные клетки, наблюдаемые с помощью конфокальной микроскопии. А) вид XY и XZ (') ввиду мембраны локализации GFP (MEM-GFP) под названием эпителиальных листа. Б) XY просмотра и XZ зрения (В ') из moesin-GFP помечены F-актин апикальной коры клетки.

Рисунок 4
Рисунок 4. Анализ изображений с использованием изображения J.) Исходное изображение мембраны локализации GFP помечены ячейки листа. Высокое мнение разрешение (') из коробки вставке () показаны два "регионах интересов," или ROI. Желто-схема указывает границы одной ячейки выбираются с помощью Polygon Tool (см. группа В) и зеленая линия указывает путь профиля интенсивности по межклеточной границы выбираются с помощью прямой линии инструмента (см. панель C). ) В », чтобы выбрать метод измерения параметров и выбрать" Площадь "(B''). После возврата инвестиций выбран он может храниться в диспетчере ROI (B'''). C ') метод выбрать, измерение вариантов профиля взял. C'') Как только прямой или сегментированные инструмент линии выбирается профиль интенсивности на пути могут быть построены с "Участок профиля" команды. Список intensИти значения также могут быть сохранены в таблице читаемом виде.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представили экспериментальные протоколы регулярно используются в нашей лаборатории, чтобы изображение динамично меняющейся цитоскелета в апикальной коры клетки и осциллирующие клеточные мембраны эпителиальных клеток в эмбрионы Xenopus. Надо использовать эти протоколы в качестве отправной точки для живого изображения эпителиальных формы клетки; оптимизации этого протокола является существенным и некоторые параметры будут меняться в зависимости от типа микроскопа надо и тип белков интересоваться изображениями . Вместе протокол шагов (эксплантов изоляции, работы с изображениями и визуализации клеточных и субклеточных компонентов, и количественная методология) обеспечивают всеобъемлющую процедуру исследования эпителиальных морфогенеза.

Важнейшие аспекты помнить

  1. Важно подготовить высококачественные мРНК для микро-инъекции в эмбрионы. мРНК трубы хранятся на лед, чтобы избежать деградации. После проверки, трубы хранятся в -80 ° С в меньшей порции, чтобы избежать нескольких циклов замораживания-оттаивания.
  2. Важно, чтобы ввести мРНК на несколько сайтов, чтобы обеспечить равномерное распределение мРНК на большом поле ячеек в эктодермы шапка животного.
  3. Добавление антибиотик / противогрибковым имеет важное значение для долгосрочного культуры, чтобы препятствовать бактериальных и грибковых роста.
  4. Необходимо соблюдать осторожность при нажатии эксплантов под покровное фрагменты, так как больше, чем требуемое давление может разбить эксплантов.
  5. Хотя изображения, оптимальные настройки необходимы для сбора данных с максимальной наилучшее качество изображения, что отражает эндогенные поведения клеток и динамики белков. Выбор оптимальных параметров приходит с практикой и опытом.
  6. Для анализа изображений, мы настоятельно рекомендуем ImageJ. ImageJ является отличным открытым исходным кодом, которые можно загрузить и модифицированные с добавлением специально написанный или загруженных макросов и плагинов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (R01-HD044750), КАРЬЕРА грант от Национального научного фонда, и поддержка со стороны Американской ассоциации сердца (начало Грант-в-помощь). Авторы выражают благодарность Дэвидсон Лаборатория Участники: HY Ким, М. фон Dassow и Дж. Чжоу (за помощь в повседневных заботах и ​​лаборатории), и Лин Жанг за ее помощь в области молекулярной биологии и синтеза мРНК. Мы признаем, экспериментальных усилий со стороны всех лягушка лабораторий (особенно Ray Келлера и Дуг DeSimone в), которые внесли свой вклад в какую-то часть этого протокола, путем разработки и тестирования различных методов за последние годы. Мы благодарим Ричард Харланд и Джон Уоллингфорд за их добрые дары чле-GFP и GFP-moesin плазмид соответственно.

References

  1. Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10, (1), 61-61 (2008).
  2. Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Academic Press. New York. (1991).
  3. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. (2008).
  4. Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (2009).
  5. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).
  6. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, (3), 163-163 (2002).
  7. Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res. 316, (1), 103-103 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics