दीमक की आंत रोगाणुओं (Zootermopsis Angusticollis) से डीएनए निकालने और आंत रोगाणुओं Visualizing

Biology

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Summary

इस वीडियो दीमक hindgut में निवासी रोगाणुओं की प्रजातियों से डीएनए निकालने के लिए तकनीक दिखाता है. एक गीला माउंट स्लाइड है, जो पेट माइक्रोबियल समुदाय visualizing के लिए उपयोगी है की तैयारी भी सचित्र है और प्रजातियों अमीर आंत पर्यावरण के माध्यम से एक दौरे दिया है.

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Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

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Abstract

दीमक कुछ लेने लकड़ी के द्वारा पूरी तरह निर्वाह करने की क्षमता के लिए जाना जाता पशुओं के बीच रहे हैं. दीमक पेट पथ एक घने और प्रजातियों अमीर माइक्रोबियल आबादी है कि एसीटेट में lignocellulose की गिरावट में मुख्य रूप से सहायता शामिल है, प्रमुख ईंधन भरने पोषक तत्व दीमक चयापचय (Odelson और Breznak, 1983). इन माइक्रोबियल आबादी के भीतर बैक्टीरिया, methanogenic जीव और, कुछ दीमक ("कम") में, यूकेरियोटिक प्रोटोजोआ हैं. इस प्रकार, दीमक माइक्रोबियल प्रजातियों और कई जैव रासायनिक कार्यों वे अपने मेजबान के लाभ के लिए प्रदर्शन के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए उत्कृष्ट अनुसंधान के विषय हैं. दीमक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हिम्मत कुंजी विभिन्न जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में शामिल जीनों में माइक्रोबियल आबादी की प्रजातियों संरचना को आणविक तकनीक का उपयोग (, Schmit - वैगनर एट अल, 2003; Salmassi और Leadbetter, 2003 Kudo एट अल, 1998) पता लगाया गया है. इन तकनीकों और दीमक आंत वातावरण से उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड की निकासी शुद्धि पर निर्भर करते हैं. Berthelet एट अल, 1996;. Purdy एट अल, 1996;. Salmassi और Leadbetter, निष्कर्षण इस वीडियो में वर्णित तकनीक निकासी और पर्यावरण नमूने (मोर एट अल, 1994 से nucleic एसिड की शुद्धि के लिए विकसित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संकलन 2003; Ottesen एट अल 2006) और यह दीमक hindgut पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त सामग्री से डीएनए पैदा करता है.

Protocol

दीमक पूरे पेट डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रक्रियात्मक सारांश:

  1. बर्फ पर शांत दीमक निकालने के लिए, बाँझ चिमटी का उपयोग कर पेट और बफर में पेट के नमूनों को स्थिर.
  2. PVPP / एसडीएस / phenol के बफर में नमूने homogenize.
  3. निकालें और कच्चे Qiagen DNeasy स्तंभों का उपयोग lysate से डीएनए शुद्ध.

प्रोटोकॉल:

  1. बर्फ पर, कार्यकर्ता जाति बाँझ संदंश का उपयोग दीमक से हिम्मत हटा दें.
  2. तुरंत एक बाँझ, nuclease मुक्त 50 μL ठंडा 1x आण्विक जीव विज्ञान ग्रेड ते बफर युक्त ट्यूब के लिए हिम्मत और सामग्री हस्तांतरण (1 Tris - एचसीएल मिमी 0.1 मिमी, EDTA, पीएच 8.0). -20 डिग्री सेल्सियस पर रुक नमूने, या सीधे homogenization के साथ आगे बढ़ना.
  3. एक बाँझ, nuclease मुक्त 2 मिलीलीटर पेंच छाया ट्यूब पेट नमूने और बफर स्थानांतरण पूर्व बाँझ zirconia / सिलिका (0.1 मिमी) माला और 1x ते बफर के 700 μl 1% w / ध् (polyvinylpolypyrrolidone PVPP युक्त के 500 मिलीग्राम के साथ लोड ).
  4. 20% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 50 μl और नमूने के phenol के 500 μl जोड़ें.
  5. उच्चतम सेटिंग का उपयोग 30 सेकंड homogenization के तीन चक्र और बर्फ पर द्रुतशीतन के 30 सेकंड पर homogenize (मनका हरा).
  6. तलछट 8000 x में 1 मिनट के लिए सामग्री अघुलनशील.
  7. Qiagen DNeasy कच्चे lysate शुद्धि के लिए वर्णित विधि का उपयोग कर स्तंभों के साथ जलीय परत (ऊपरवाला) के 300 μl aliquots शुद्ध.
  8. न्यूक्लिक एसिड सामग्री और बाद में उपयोग के लिए फ्रीज नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर यों.

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Discussion

हमारे अनुभव में, Zootermopis nevadensis की तरह लकड़ी खिला दीमक प्रजातियों का सूक्ष्म समुदायों से निकाले डीएनए निष्कर्षण और शुद्धीकरण के एक दौर के बाद पीसीआर टेम्पलेट के लिए पर्याप्त शुद्ध है. हालांकि, कूड़े - खिला और मिट्टी खिला प्रजातियों के रूप में कुछ दीमक उनके पेट की सामग्री में humic एसिड की एक उच्च एकाग्रता है और पेट माइक्रोबियल डीएनए के अतिरिक्त शुद्धि की आवश्यकता हो सकती है हो सकता है. 5 जेड nevadensis कार्यकर्ताओं की हिम्मत से कुल डीएनए उपज μg 10-30 की रेंज में है. दीमक प्रजातियों काफी छोटे होते हैं या इस प्रजाति की तुलना में बड़ा के लिए है, और अधिक या कम नमूनों के डीएनए के एक समान राशि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

इस विधि को आसानी से शाही सेना निकासी की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. शाही सेना निकासी के लिए, Qiagen (catlog 76506 नहीं.) से बर्फ ठंड ते प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित बफर के लिए 1x RNAprotect जीवाणु अभिकर्मक स्थानापन्न. Qiagen RNeasy अभिकर्मकों और स्तंभों (74,104 नहीं. Catlog) DNeasy शुद्धि प्रक्रिया ऊपर वर्णित की जगह में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. के रूप में डीएनए RNAprotect स्थिर नमूनों से शुद्ध किया जा सकता है और केवल लगभग 300 μL. 700 μL जलीय परत चरण 7 में प्राप्त की आवश्यकता होती है न्यूक्लिक एसिड शुद्धि के लिए, इस पद्धति के लिए एक एकल नमूने से समानांतर में दोनों डीएनए और आरएनए को पुनः प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इन तकनीकों और दीमक आंत वातावरण से उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड की निकासी शुद्धि पर निर्भर करते हैं. Berthelet एट अल, 1996;. Purdy एट अल, 1996;. Salmassi और Leadbetter, निष्कर्षण इस वीडियो में वर्णित तकनीक निकासी और पर्यावरण (अधिक एट अल, 1994 नमूनों से nucleic एसिड की शुद्धि के लिए विकसित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संकलन 2003; Ottesen एट अल 2006) और यह दीमक hindgut पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त सामग्री से डीएनए पैदा करता है.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

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References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

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