Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Este vídeo ilustra a técnica para a extração de DNA das espécies de micróbios residentes no intestino posterior de cupins. A preparação de uma lâmina de montagem molhada, o que é útil para visualizar a comunidade microbiana do intestino também é ilustrado, e um tour pela espécie ambiente rico intestino é dado.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cupins estão entre os poucos animais conhecidos por terem a capacidade de subsistir unicamente por madeira de consumo. O trato intestinal de cupins contém uma população microbiana densa e ricos em espécies que auxilia na degradação da lignocelulose predominantemente em acetato, o nutriente chave alimentando o metabolismo de cupins (Odelson & Breznak, 1983). Dentro destas populações microbianas são bactérias, archaea metanogênicas e, em alguns cupins ("menor"), eucarióticas protozoários. Assim, os cupins são sujeitos de pesquisa excelente para estudar as interações entre espécies microbianas ea inúmeras funções bioquímicas que desempenham em benefício de seus hospedeiros. A composição de espécies das populações microbianas nos intestinos de cupins, bem como os principais genes envolvidos em vários processos bioquímicos tem sido explorado através de técnicas moleculares (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Essas técnicas dependem da extração e purificação de alta qualidade ácidos nucléicos a partir do ambiente do intestino de cupins. A técnica de extração descrita neste vídeo é uma compilação modificada de protocolos desenvolvidos para a extração e purificação de ácidos nucléicos a partir de amostras ambientais (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e que produz DNA a partir de material de cupim intestino posterior adequado para uso como modelo para a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Protocol

Síntese do procedimento para extração de DNA de cupins de todo o intestino:

  1. Cupins frio no gelo, retire gut usando uma pinça estéril e estabilizar amostras intestino em buffer.
  2. Homogeneizar amostras em PVPP / SDS / buffer fenol.
  3. Extrair e purificar o DNA de lisado bruto usando colunas Dneasy Qiagen.

Protocolo:

  1. No gelo, retire a coragem de cupins trabalhador casta usando uma pinça estéril.
  2. Transferir imediatamente a coragem e conteúdo a uma estéril, livre de nuclease tubo contendo 50 mL gelada 1x biologia molecular grau tampão TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelar as amostras a -20 ° C, ou proceder diretamente com homogeneização.
  3. Transferir as amostras de intestino e buffer para um estéril, livre de nuclease tubo parafuso 2 ml tampados pré-carregado com 500 mg de estéril de zircônia / sílica esferas (0,1 mm) e 700 mL de tampão TE contendo 1x 1% w / v polivinilpolipirrolidona (PVPP ).
  4. Adicionar 50 ul de sulfato de sódio dodecil 20% (SDS) e 500 mL de fenol, para as amostras.
  5. Homogeneizar (beat bead) na configuração mais alta utilizando três ciclos de 30 seg homogeneização e 30 seg de refrigeração em gelo.
  6. Sedimentos material insolúvel por 1 min a 8.000 x g.
  7. Purificar de 300 mL alíquotas da camada (superior) aquosa com colunas Qiagen Dneasy usando o método descrito para a purificação de lisado bruto.
  8. Quantificar o conteúdo de ácido nucléico e amostras congeladas a -20 ° C para uso posterior.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Em nossa experiência, o DNA extraído das comunidades microbianas de espécies de madeira alimentando-cupim como nevadensis Zootermopis é suficientemente puro para o modelo de PCR, após uma rodada de extração e purificação. No entanto, alguns cupins, tais como lixo-alimentação e no solo alimentando-espécie pode ter uma maior concentração de ácidos húmicos em seu conteúdo intestinal e pode exigir a purificação adicional de DNA microbiano intestinal. O rendimento de DNA total das entranhas de 5 trabalhadores nevadensis Z. está na faixa de 10-30 mg. Para as espécies de cupins significativamente menor ou maior que esta espécie, os espécimes mais ou menos pode ser necessário para obter a mesma quantidade de DNA.

Este método pode ser facilmente adaptado para permitir a extração de RNA. Para a extração de RNA, substituto 1x RNAprotect reagente Bactérias da Qiagen (catlog não. 76506) para o tampão TE gelada descrito na etapa 2 do protocolo. Reagentes Qiagen RNeasy e colunas (catlog não. 74104) deve ser usado no lugar do processo de purificação Dneasy descrito acima. Como o DNA pode ser purificado a partir RNAprotect estabilizado amostras e apenas a 300 mL de aprox. 700 mL da camada aquosa recuperados no passo 7 é necessário para a purificação de ácido nucléico, este método pode ser usado para recuperar tanto DNA e RNA em paralelo a partir de uma única amostra.

Essas técnicas dependem da extração e purificação de alta qualidade ácidos nucléicos a partir do ambiente do intestino de cupins. A técnica de extração descrita neste vídeo é uma compilação modificada de protocolos desenvolvidos para a extração e purificação de ácidos nucléicos a partir de amostras ambientais (Moré et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e que produz DNA a partir de material de cupim intestino posterior adequado para uso como modelo para a reação em cadeia da polimerase (PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics