シロアリの腸内微生物(Zootermopsis Angusticollis)からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化

Biology

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Summary

このビデオでは、シロアリの後腸内に常駐微生物の種からDNAを抽出する手法を示しています。腸内の微生物群集を視覚化するのに便利ですウェットマウントスライドの準備も図示され、そして種が豊富な腸内環境を経由してツアーが与えられます。

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Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

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Abstract

シロアリは、単独で消費する木材によって内在する能力を持つことが知られているいくつかの動物の一つです。シロアリ腸管は主に酢酸にリグノセルロースの分解を補助する高密度と種が豊富な微生物群集が含まれている、シロアリの代謝を加速させる重要な栄養素(Odelson&Breznak、1983)。これらの微生物集団内細菌、メタン生成古細菌と、いくつか("低")シロアリで、原生動物真核生物です。このように、シロアリは微生物種と彼らはホストの利益のために行う数々の生化学的機能間の相互作用を研究するための優秀な研究テーマです。シロアリの腸だけでなく、様々な生化学的プロセスに関与する重要な遺伝子の微生物集団の種組成は、分子技術を(。シュミット - Wagnerら、2003;。Salmassi&レッドベター、2003工藤ら、1998)を使用して検討されている。これらの技術は、シロアリ腸内の環境から高品質の核酸の抽出と精製に依存する。 。Bertheletら、1996;。パーディら、1996;。Salmassi&レッドベター、このビデオで説明されている抽出技術は、環境試料(モルら、1994からの核酸の抽出と精製のために開発されたプロトコルの変更をまとめたものです2003;。オッテセンら、2006)、それはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして使用するのに適してシロアリの後腸の材料からDNAを生成します。

Protocol

シロアリ全腸のDNA抽出のための手続き型の要約:

  1. 氷上で冷やしてシロアリは、滅菌ピンセットを用いて消化管削除し、バッファ内の腸のサンプルを安定化させる。
  2. PVPP / SDS /フェノールバッファーでサンプルをホモジナイズする。
  3. キアゲンDNeasyカラムを用いて粗ライセートからDNAを抽出し精製する。

プロトコル:

  1. 氷の上に、滅菌ピンセットを使用してワーカーカーストのシロアリから内臓を取り除く。
  2. すぐに50μLの氷冷した1 ×分子生物学グレードのTE緩衝液(1 mMトリス- HCl、0.1mMのEDTA、pH8.0)を含有する滅菌、ヌクレアーゼフリーのチューブに内臓との内容を転送します。 -20℃でサンプルを凍結、または均質化と直接進みます。
  3. 無菌ジルコニア/シリカビーズ500mgの(0.1 mm)を、1%w / vのポリビニルポリピロリドン(PVPPを含む1 × TEバッファー700μlのが事前にロードされた滅菌、ヌクレアーゼフリーの2 mlのスクリューキャップチューブに腸サンプルとバッファーを転送する)。
  4. 20%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を50μlとサンプルへのフェノールの500μlを添加します。
  5. 30秒の均質化の3サイクルと氷で冷却の30秒を使用して、最高の設定で(ビーズ拍)ホモジナイズする。
  6. 8000 x gで1分間堆積物不溶性物質。
  7. 粗溶解物の精製のために説明した方法を使用してQiagen社DNeasy列を含む水溶液(最)層の300μlをして浄化する。
  8. 後で使用するまで-20℃で核酸含有量および凍結試料を定量化する。

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Discussion

我々の経験では、Zootermopisのnevadensisのような木製の餌のシロアリの種の微生物群集から抽出したDNAは、抽出と精製1ラウンド後のPCRテンプレート用に十分に純粋である。しかし、このようなゴミ給と土壌栄養の種など、一部のシロアリはその腸の内容フミン酸の高い濃度を有することができるし、腸内微生物のDNAの追加の精製が必要な場合があります。 5 Z.のnevadensis労働者の内臓からの全DNAの収量は10〜30μgの範囲にある。この種よりも有意に小さくしたり大きくシロアリの種の場合は、より多くのまたはより少ない標本はDNAの同じような量を得るために必要になる場合があります。

このメソッドは、簡単にRNAの抽出を可能にするために適応させることができます。 RNAの抽出には、プロトコールのステップ2で説明した氷冷TEバッファにキアゲン(catlogない。76506)から1 × RNAprotectの細菌の試薬を代用。キアゲンをRNeasy試薬とカラムが(ない。74104をcatlogない)上記のDNeasy精製手順の代わりに使用する必要があります。 DNAとしてRNAprotect安定化サンプルと約わずか300μLから精製することができる。手順7で取得した700μlの水層は、核酸精製のために、このメソッドは、単一のサンプルから並行してDNAとRNAの両方を取得するために使用することができますが必要です。

これらの技術は、シロアリ腸内の環境から高品質の核酸の抽出と精製に依存する。 。Bertheletら、1996;。パーディら、1996;。Salmassi&レッドベター、このビデオで説明されている抽出技術は、環境試料(もっとら、1994からの核酸の抽出と精製のために開発されたプロトコルの変更をまとめたものです2003;。オッテセンら、2006)、それはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして使用するのに適してシロアリの後腸の材料からDNAを生成します。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

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References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

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