زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

* These authors contributed equally
Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

في هذا الفيديو ، وصفنا توصيف المجمعات multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) من الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN - PAGE). في البعد الأول ، يتم فصل lysates الخلوية مدال بواسطة PAGE - BN لتحديد البلدان المتوسطية الشريكة الفردية. في البعد الثاني SDS - PAGE ، وتنقسم البلدان المتوسطية الشريكة من الاهتمام لتحليل من قبل ناخبيهم immunoblotting.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مجمعات Multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) تلعب دورا حاسما في إشارة الخلية ، حيث يمكن العثور على معظم البروتينات في مجمعات وظيفية أو تنظيمية مع غيرها من البروتينات (سالي ، Glaeser وآخرون 2003). وهكذا ، ودراسة شبكات التفاعل البروتين البروتين يتطلب توصيف مفصل للبلدان المتوسطية الشريكة للحصول على فهم متكامل وظيفة البروتين والتنظيم. لتحديد وتحليل ، لا بد من فصل البلدان المتوسطية الشريكة في ظل الظروف المحلية. في هذا الفيديو ، وصفنا تحليل البلدان المتوسطية الشريكة التي كتبها زرقاء الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN - PAGE). BN - PAGE هو الاسلوب الذي يسمح بالفصل بين البلدان المتوسطية الشريكة في التشكل الأصلية مع دقة أعلى من التي تقدمها الترشيح جل أو السكروز تنبيذ فائق الكثافة ، وبالتالي فهو مفيد لتحديد حجم MPC ، وتكوينها ، والوفرة النسبية (وSchägger فون Jagow 1991) ؛ (Schägger ، كريمر وآخرون 1994). بهذه الطريقة ، يتم فصل البروتينات وفقا لحجمها وشكلها الهيدروديناميكية في مصفوفة بولي أكريلاميد. هنا ، علينا أن نظهر للتحليل البلدان المتوسطية الشريكة من مجموع lysates الخلوية ، مشيرا إلى أن غسيل الكلى lysate هو خطوة حاسمة لجعل BN ​​- PAGE تنطبق على هذه العينات البيولوجية. باستخدام مزيج من أول BN البعد والبعد الثاني SDS - PAGE ، وتبين لنا أنه يمكن البلدان المتوسطية الشريكة مفصولة PAGE - BN تقسيمها إلى مزيد من ناخبيهم الفردية SDS - PAGE. يتم تنفيذ التصور من مكونات السياسة النقدية عند انتهاء الجل بواسطة immunoblotting القياسية. كمثال للتحليل بواسطة PAGE MPC - BN ، اخترنا 19S جيدا اتسم حقيقية النواة ، 20S ، وproteasomes 26S.

Protocol

** يعتمد هذا البروتوكول على نشر الفيديو المرتبطة 1 : الأزرق هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) لتحديد وتحليل المجمعات Multiprotein. ماهيما سوامي ، M. غبريال Siegers ، سوزانا Minguet ، بيرند Wollscheid ، وولفغانغ Schamel WA. STKE العلم في 2006 (345) : PL2 25 يوليو ، 2006 ، [DOI : 10.1126/stke.3892006pl4]. الرجاء النقر هنا لرؤية هذا المنشور .

1. إعداد lysate الخلية مدال

  1. حصاد 10x10 6 خلايا وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 350g لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية.
  2. غسل الخلية بيليه ثلاث مرات مع 1 مل من الجليد الباردة PBS (صفة 1) ، وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.1.
  3. Resuspend بيليه في 250 ميليلتر من الجليد الباردة الاحتياطي BN - تحلل (وصفة 2) ، واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  4. ز الطرد المركزي في 13000 لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  5. تذوب ثقب في الغطاء من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام ساخنة جانب كبير من الإطارات ماصة باستور ، ثم ضع الأنبوب على الجليد ليبرد إلى درجة مئوية 4
  6. نقل طاف من الخطوة 1.4 في أنبوب المبردة مع ثقب في الغطاء.
  7. مكان غشاء الديال (الوزن الجزيئي قطع من 10 دينار كويتي) مع ملقط على رأس أنبوب فتح ، إغلاق الغطاء ، وقطع الزائدة غشاء الديال أن العصي خارج.
  8. ختم غطاء على الجانب بعناية مع Parafilm.
  9. عكس الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي رأسا على عقب بأقل ما يمكن من السرعة في أنابيب مخروطية 50 مل في خلية ثقافة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 4 درجات مئوية. إزالة أنبوب مقلوب من أجهزة الطرد المركزي باستخدام الملقط لتجنب تحول الجانب الأيمن الصمام.
  10. إعداد كوب 100 مل مع الاحتياطي BN - غسيل الكلى الباردة (وصفة 3) وصفيحة اثارة. استخدام ما لا يقل عن 10 مل من BN - الاحتياطي غسيل الكلى في عينة من 100 ميكرولتر.
  11. يلصق الأنبوب بشريط رأسا على عقب داخل الدورق وإزالة فقاعات الهواء من ثقب تحت سقف باستخدام باستور عازمة ماصة.
  12. دورق مكان على رأس النمام المغناطيس ، والتبديل على النمام وتترك لمدة 6 ساعات أو طوال الليل في غرفة باردة. أحيانا الاختيار لضمان عدم اثارة خلق فقاعات الهواء في الغشاء لغسيل الكلى.
  13. جمع lysate مدال الخلية في أنبوب microcentrifuge مبردة جديدة.

2. صب BN - الهلام

  1. ويتم صب جل الانحدار في درجة حرارة الغرفة مع خلاط التدرج. يجب ارتداء القفازات بسبب بولي أكريلاميد هو أعصاب للغاية. تجنب أي اتصال مع الحزب الديمقراطي الصربي.
  2. مكان خلاط التدرج على طبق من اثارة وإرفاقه قطعة من أنابيب مرنة. إغلاق قناة باستخدام صمام وإغلاق الأنبوب مع المشبك. مكان مغناطيسي 15 ٪ في الاسطوانة "عالية" متصلا الأنابيب.
  3. الصفحات أنابيب مرنة الى ضخ peristalitic ونعلق إبرة حقنة حتى نهايتها. ثم ، ومكان الإبرة بين لوحات من الزجاج اثنين من جهاز هلام.
  4. إعداد 4 ٪ (وصفة 5) و 15 ٪ (وصفة 6) فصل الحلول هلام ، مضيفا كالة الأنباء الجزائرية وTEMED مباشرة قبل الاستعمال. وينبغي الجمع بين وحدات التخزين يكون مساويا لحجم هلام فصل.
  5. صب جل هذه الحلول في اسطوانات المقابلة من الانحدار خلاط (4 ٪ في "منخفض" و 15 ٪ في الاسطوانة "عالية").
  6. فتح صمام وقوة من فقاعة الهواء داخل القناة التي تربط الخزانات هلام اثنين بضغط على اسطوانة اليسار مع الإبهام.
  7. التبديل على النمام المغناطيسي ، وإزالة المشبك ، والتبديل على مضخة peristalitic إلى 5 مل في الدقيقة الواحدة. السماح لتدفق جل ببطء بين لوحات زجاجية. تأكد من أن الإبرة دائما فوق السائل.
  8. السماح لجميع السائل لدخول جهاز هلام ، وتراكب ثم بلطف مع الأيزوبروبانول. السماح للهلام لتتبلمر على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. تنظيف جهاز تتدفق على الفور مع DH 2 O (لا تستخدم المنظفات).
  10. إزالة الأيزوبروبانول ، ويغسل مع DH 2 O ، وإزالة درهم 2 O مع ورقة Whatman.
  11. إعداد جيل 3.2 ٪ التراص (وصفة 7) ، واضاف وكالة الأنباء الجزائرية TEMED مباشرة قبل الاستعمال.
  12. صب جل التراص على رأس هلام فصل وإدخال المشط بين لوحات من الزجاج ، وتجنب الفقاعات. بعد الجل والتراص بلمرة بارد والجل وصولا الى 4 درجات مئوية.
  13. على الفور قبل تحميل عينة ، إزالة المشط ببطء ، وإخراجه بزاوية إلى الطائرة من هلام. هذا يسمح للهواء للدخول في جيوب بسرعة ، مما يحسن نوعية الآبار.

3. فصل lysate مدال الخلية التي PAGE - BN

  1. تحميل 1-40 ميكرولتر من lysate مدال و10-20 ميكرولتر من مزيج ماركر (وصفة 10) في الآبار الجافة في 4 درجات مئوية. تراكب العينات في كل بئر مع الاحتياطي الكاثود البارد (وصفة 8).
  2. ملء الغرفة الداخلية مع القط الباردhode مخزن وغرفة الخارجي / مع انخفاض الاحتياطي الأنود الباردة (وصفة 9).
  3. تنطبق على 100 فولت أو 150V minigel إلى هلام كبيرة ، حتى دخلت عينات هلام فصل. تشغيل هلام في 4 درجات مئوية.
  4. زيادة الجهد إلى 180 V (minigel) أو 400 V (هلام كبيرة) ويستمر حتى الجبهة صبغ تصل إلى نهاية الجل. على المدى يأخذ 3 إلى 4 ساعات عن مصغرة ، و 18 إلى 24 ساعة لهلام كبيرة.

4. البعد الثاني SDS - PAGE

  1. يعد المعيار 10 ٪ SDS - هلام (وصفات 12-15) مع ممر واحد كبير للالمسار الأول BN - PAGE البعد ، مسار واحد العادية للعلامة الوزن الجزيئي ، ومسار واحد العادية لقسامة من lysate مدال الذي كانت مختلطة مع العازلة عينة SDS (وصفة 11) ، ومغلي لمدة 5 دقائق الى 95 درجة مئوية. استخدام الفواصل التي كانت سماكة بنسبة طبقتين من الشريط سكوتش لتبسيط التحميل من شريحة هلام BN - PAGE على جل SDS.
  2. إزالة الجل BN - PAGE في لوحات من الجهاز الكهربائي ونقب بلطف واحد لوحة.
  3. إزالة الجل التراص وقطع الممر من هلام BN - الصفحة التي تحتوي على البروتينات المثيرة للاهتمام.
  4. ضع شريحة هلام BN - PAGE في مخزن 2X نموذج SDS واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غلي شريحة هلام BN - PAGE لفترة وجيزة (وليس أكثر من 20 ثانية) في الميكروويف.
  6. احتضان شريحة هلام BN - PAGE في الاحتياطي الساخنة SDS نموذج لآخر 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. تحميل شريحة هلام BN - PAGE كبيرة في ما يزيد على الجل التراص من فقاعات جل SDS - PAGE تجنب الهواء ، وتراكب مع شريحة الاحتياطي نموذج SDS. تحميل lysate علامة والسيطرة.
  8. أداء الكهربائي وفقا لبروتوكولات القياسية.

5. الكشف عن لجنة السياسة النقدية من قبل مفارز immunoblotting

  1. لنقل ، وإعداد ست ورقات Whatman وغشاء PVDF المناسب لحجم SDS - هلام.
  2. احتضان الغشاء PVDF في الميثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 30 ق ، ونقع في ورقات Whatman العازلة نقل (وصفة 16).
  3. مكان Whatman ثلاث ورقات ، والغشاء PVDF ، وSDS - هلام (جل إزالة التراص) ، ومرة ​​أخرى ثلاث ورقات Whatman في بنية شطيرة تشبه في خلية نقل semidry.
  4. تطبيق 20 V لمدة 25 دقيقة.
  5. الكشف عن البروتينات وفقا لمعيار بروتوكولات immunoblotting.

6. ممثل النتائج

نقدم تحليلا ل19S حقيقية النواة ، 20S ، 26S proteasomes وكمثال لتوصيف MPC بواسطة BN 2D / SDS - PAGE (الشكل 1A). وlysed HEK293 الخلايا مع العازلة التي تحتوي على 0.1 ٪ تريتون X - 100 والمنظفات لعرقلة الأغشية وsolubilize مجمعات البروتين الغشاء. وكانت هذه مدال lysates ضد BN - العازلة غسيل الكلى لإزالة الأملاح والأيضات الصغيرة. ثم تم فصلها من قبل البلدان المتوسطية الشريكة 4-15 ٪ PAGE - BN التدرج يليه البعد الثاني SDS - PAGE. والبروتينات التي تصور immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد مفارز β2 وMcp21 من 20S proteasome.

الشكل 1
الشكل 1. نهج BN-PAGE/SDS-PAGE ثنائي الأبعاد باستخدام lysates الخلوية. (A) رسما تخطيطيا لنهج BN-PAGE/SDS-PAGE 2D من lysates الخلوية. (ب) نظام تخطيطي لBN-PAGE/SDS-PAGE 2D. يتم فصل البروتينات والبلدان المتوسطية الشريكة في ظل ظروف الأصلية بواسطة PAGE - BN في البعد الأول. عن البعد الثاني ، والبروتينات و / أو البلدان المتوسطية الشريكة والتشويه والتحريف من قبل الحزب الديمقراطي الصربي في قطاع غزة بعد الانفصال من قبل جل PAGE - BN وتعرض لاحقا إلى SDS - PAGE. وسوف تهاجر البروتينات موحودي بسبب قطري القطعي للهلام التدرج في السنة الأولى و جل الخطي في البعد الثاني. سيتم العثور على عناصر ملموسة MPC احدة منهما يقع تحت قطري ، وتقع على خط عمودي.

وقد تبين أنه بحلول مزيج من أول BN البعد والبعد الثاني SDS - PAGE ، والبروتينات داخل موحودي ترحيل قطري القطعي بسبب الجل التدرج في الأول وهلام الخطية في البعد الثاني ((كاماتشو - كارفاخال ، وآخرون Wollscheid بن 2004) ؛. 1B الشكل). توجد عناصر هذه البلدان المتوسطية الشريكة أدناه قطري. ويمكن الاطلاع على البروتينات التي تمثل مفارز من لجنة السياسة النقدية نفسها في سطر واحد عمودي في البعد الثاني ، في حين أن العديد من المواقع من البروتين نفسه في خط أفقي تشير إلى وجود البروتين في البلدان المتوسطية الشريكة متميزة عديدة. كشف يبين الشكل 2 أنه في تجربتنا immunoblotting ضد β2 وMcp21 وجود بروتين معين المجمعات التي تحتوي على هذه المفارز proteasomal. وكانت كل من البروتينات يمكن كشفها كبقع الفردية ترتيبها في خط أفقي ، مشيرا إلى أن وβ2 Mcp21 تمثل مقومات متميزة عدة بلدان المتوسطية الشريكة. يمكن أن تكون هذه البلدان المتوسطية الشريكة التي تم تحديدها بوضوح كما proteasome 26S (20S 19S زائد قبعة) ، و20S proteasome مع الوحيدات التنظيمية PA28 ، و20S proteasomes وحده ، على أساس حجمها وتكوينها. أخذت معا ، وهذه دورة الفتشوبLTS تثبت أنه يمكن التعرف على البلدان المتوسطية الشريكة المحلية ، وتميزت بنهج BN-PAGE/SDS-PAGE ثنائي الأبعاد باستخدام lysate الخلوية. هذا الأسلوب هو تطبيق لتحديد تكوين وحجم والوفرة النسبية للبلدان المتوسطية الشريكة.

الشكل 2
الشكل 2. الكشف عن أشكال مختلفة من proteasome حقيقية النواة التي immunoblotting بعد ثنائية الأبعاد BN-PAGE/SDS-PAGE. لتحديد وتحليل proteasomes حقيقية النواة ، وlysed HEK293 الخلايا مع تريتون 0.1 ٪ X - 100. وlysates الخلوية مدال وتعرض لاحقا إلى PAGE - BN (4-15 ٪) إلى الدول المتوسطية الشريكة منفصلة. بعد ذلك ، تم تشغيل البعد الثاني SDS - PAGE (10 ٪) للفصل حجم المكونات الفرعية الفردية. تم تنفيذ Immunoblotting مع الاجسام المضادة المحددة الاعتراف Mcp21 وβ2 الوحيدات في مجمع 20S الأساسية ، والوحيدات التنظيمية PA28.

أولا جدول الكواشف محددة (حسب الترتيب الأبجدي) :

الكاشف شركة تعليقات
6 aminohexanoic حمض
(ε أمينوكابرويك حامض)
سيغما الدريخ ، Taufkirchen ، ألمانيا هذه المادة الكيميائية هي مصدر إزعاج ويجب التعامل مع القفازات.
الأكريلاميد - bisacrylamide حل (40 ٪) ، ميكس 32:1 Applichem ، دارمشتات ، ألمانيا هذا الحل هو أعصاب ، وينبغي التعامل مع القفازات.
مكرر تريس روث ، كارلسروه ، جرمة ، NY
بريج 96 سيغما الدريخ ، Taufkirchen ، ألمانيا
Coomassie الزرقاء G250 Serva ، هايدلبرغ ، وألمانيا ، لا بديل من أنواع أخرى مثل صبغ Coomassie Coomassie الزرقاء R250 أو الغروية البلوز إهدل - ماسي.
ديجيتونين سيغما الدريخ ، Taufkirchen ، ألمانيا ديجيتونين غير سامة. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع المخازن أو العينات التي تحتوي على هذه ردع - جنت.
Dodecylmaltoside Applichem ، دارمشتات ، ألمانيا
تريتون X - 100 روث ، كارلسروه ، جرمة ، NY تريتون X - 100 غير سامة. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع المخازن أو العينات التي تحتوي على هذه المنظفات.

II. جدول محددة من المواد والمعدات :

معدات شركة
أغشية الديلزة (الوزن الجزيئي قطع 10-50 دينار كويتي) روث ، كارلسروه ، ألمانيا
هلام النظام الكهربائي على سبيل المثال من بيو راد ، ميونيخ ، ألمانيا
التدرج خلاط عصامي أو متوفرة تجاريا من بيو راد ، ميونيخ ، ألمانيا
مضخة تمعجية أمرشام فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية ، فرايبورغ ، ألمانيا
difluoride البولي فينيل (PVDF) الغشاء Immobilon - P ، ميليبور ، اشبورن ، ألمانيا
وشبه الجافة نقل المعدات على سبيل المثال من بيو راد ، ميونيخ ، ألمانيا
أنابيب السيليكون (3 إلى 5 مم ، 1 م طول) NeoLab ، هايدلبرغ ، ألمانيا

III. الجدول من وصفات :

رقم مخازن والحلول محتوى تعليقات
1 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) غ 2 4 هبو 8.1 mMKH 2
PO 4 1.5 ملم
كلوريد الصوديوم 138 ملي
بوكل 2.7 ملي
وينبغي أن يكون الحل الرقم الهيدروجيني 7،4 إذا ما قبل انخفاضها بشكل صحيح.
2 BN - تحلل العازلة قاعدة العازلة
مكرر تريس 20 ملي
ε أمينوكابرويك حامض 500 ملم
كلوريد الصوديوم 20 ملي
EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 2 مم
الجلسرين 10 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك. المحل في 4 درجات مئوية.

منظف
ديجيتونين 0،5-1،0 ٪
أو بريج 96 0،1-0،5 ٪
تريتون أو X - 100 0،1-0،5 ٪
أو Dodecylmaltoside 0،1-0،5 ٪

مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز
أبروتينين 10 ميكروغرام / مل
Leupeptin 10 ميكروغرام / مل
PMSF 1 ملم
فلوريد الصوديوم 0.5 مم
orthovanadate الصوديوم 0.5 مم
يجب تحديد المنظفات المناسبة تجريبيا ، وينبغي أن يكون هو نفسه الذي استعمل في وصفات تحلل العازلة الأخرى.

يجب أن يضاف ديجيتونين قبل استخدام محلول المخزون من 2 ٪ في DH 2 O (مخزن في 5 ميلي aliquots في -20 درجة مئوية).

وينبغي أن يضاف البروتيني وphophatase تمنع - ORS مباشرة قبل الاستعمال.

عند إضافة الصوديوم orthova - nadate ، سوف تصبح عازلة مصفرة اللون.
3 BN - غسيل الكلى العازلة قاعدة العازلة
مكرر تريس 20 ملي
ε أمينوكابرويك حامض 500 ملم
كلوريد الصوديوم 20 ملي
EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 2 مم
الجلسرين 10 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك. المحل في 4 درجات مئوية.

منظف
ديجيتونين 0.3 إلى 0.5 ٪
تريتون أو X - 100 0.1 ٪
بريج 96 أو 0.1 ٪
Dodecylmaltoside أو 0.1 ٪

مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز
PMSF 1 ملم
orthovanadate الصوديوم 0.5 مم
يجب تحديد المنظفات المناسبة تجريبيا ، وينبغي أن تكون هي نفسها التي استخدمت في مخازن تحلل الأخرى ، ولكن في أقل أشارت التراكيز.

يجب أن يضاف إلى ما قبل المنظفات تنفيس التجميع في الخطوة التراص من هلام إستشراد.

وينبغي أن يضاف البروتيني وphophatase تمنع - ORS مباشرة قبل الاستعمال.
4 BN - 3X جل العازلة مكرر تريس 150 مم
ε أمينوكابرويك حامض 200 ملي

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك. المحل في 4 درجات مئوية.
5 4 ٪ فصل جل BN - 3X جل العازلة (وصفة 4) 5.00 مل
الأكريلاميد / 1.50 مل Bisacrylamide
DH 2 O 8.50 مل
وكالة الأنباء الجزائرية ، و 10 ٪ في 2 درهم ميكرولتر 54 O
TEMED 5.4 ميكرولتر
إضافة وكالة الأنباء الجزائرية TEMED immedia - tely قبل صب جل ، وتشجيع هذه الكواشف البلمرة.

هذه الوصفة كافية ليلقي هلام 30 مل. ضبط كميات لعدد وحجم المواد الهلامية التي تدفقت.
6 15 ٪ فصل جل BN - 3X جل العازلة (وصفة 4) 5.00 مل
الأكريلاميد / 5.63 مل Bisacrylamide
الجلسرين 70 ٪ 4.38 مل
وكالة الأنباء الجزائرية ، و 10 ٪ في 2 درهم ميكرولتر 42 O
TEMED 4.2 ميكرولتر
إضافة وكالة الأنباء الجزائرية TEMED immedia - tely قبل صب جل ، وتشجيع هذه الكواشف البلمرة.

هذه الوصفة كافية ليلقي هلام 30 مل. ضبط كميات لعدد وحجم المواد الهلامية التي تدفقت.

ويمكن أيضا تركيز bisacrylamide - الأكريلاميد تكون متنوعة حسب الضرورة 10-18 ٪.
7 3.2 ٪ التراص جل BN - 3X هلام العازلة (وصفة 4) 3.00 مل
الأكريلاميد / 0.72 مل Bisacrylamide
DH 2 O 5.28 مل
وكالة الأنباء الجزائرية ، و 10 ٪ في 2 درهم ميكرولتر 120 O
TEMED 12 ميكرولتر
إضافة وكالة الأنباء الجزائرية TEMED immedia - tely قبل صب جل ، وتشجيع هذه الكواشف البلمرة.

هذه الوصفة كافية ليلقي هلام 30 مل. ضبط كميات لعدد وحجم المواد الهلامية التي تدفقت.
8 الكاثود العازلة مكرر تريس 15 ملم
Tricine 50 ملي
Coomassie الزرقاء G250 0.02 ٪

تحضير 1 لتر باعتباره المخزون 10X ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
01:10 تمييع مع DH 2 O قبل الاستخدام.
لا بديل من أنواع أخرى مثل صبغ Coomassie Coomassie الزرقاء R250 أو الغروية Coomassie البلوز.
9 الأنود العازلة مكرر تريس 50 ملي

تحضير 1 لتر باعتباره المخزون 10X ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
01:10 تمييع مع DH 2 O قبل الاستخدام.
10 علامة ميكس ألدولاز (158 دينار) 10 ملغ / مل
الكاتلاز (232 دينار) 10 ملغ / مل
فيريتين (440 و 880 دينار كويتي) 10 ملغ / مل
ثايروجلوبولين (670 دينار) 10 ملغ / مل
BSA (66 و 132 دينار كويتي) 10 ملغ / مل
مكرر تريس 20 ملي
كلوريد الصوديوم 20 ملي
الجلسرين 10 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك. المحل في 4 درجات مئوية.
علامات الوزن الجزيئي وتتوفر أيضا تجاريا من عدة مصادر ، بما في ذلك جنرال Invitro أو فارماسيا.
11 SDS نموذج العازلة تريس 12.5 ملم
SDS 4 ٪
الجلسرين 20 ٪
زرقة البروموفينول 0.02 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. للحد من ثاني كبريتيد السندات ، إضافة 9 مل β - المركابتويثانول.
SDS على شكل مسحوق وβ مير captoethanol سامة. ولذلك ، استخدم قفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة.
12 4X أقل العازلة تريس 1.5 M
SDS 0.4 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.8.
SDS على شكل مسحوق غير سامة. ولذلك ، استخدم قفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة.
13 العلوي العازلة 4X تريس 0.5 M
SDS 0.4 ٪

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8.
SDS على شكل مسحوق غير سامة. ولذلك ، استخدم قفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة.
14 10 ٪ فصل جل الأكريلاميد (30 ٪) 2.0 مل
انخفاض 4X العازلة 1.5 مل
DH 2 O 2.454 مل
وكالة الأنباء الجزائرية ، و 10 ٪ في 2 درهم ميكرولتر 40 O
TEMED 6 ميكرولتر
إضافة وكالة الأنباء الجزائرية TEMED immedia - tely قبل صب جل ، وتشجيع هذه الكواشف البلمرة.

هذه الوصفة كافية ليلقي هلام 30 مل. ضبط كميات لعدد وحجم المواد الهلامية التي تدفقت.
15 4.8 ٪ التراص جل Acylamide (30 ٪) 320 ميكرولتر
4X العلوي العازلة 500 ميكرولتر
DH 2 O 1.16 مل
وكالة الأنباء الجزائرية ، و 10 ٪ في DH 2 O 20 ميكرولتر
TEMED 2 ميكرولتر
إضافة وكالة الأنباء الجزائرية TEMED immedia - tely قبل صب جل ، وتشجيع هذه الكواشف البلمرة.

هذه الوصفة كافية ليلقي هلام 30 مل. ضبط كميات لعدد وحجم المواد الهلامية التي تدفقت.
16 Semidry نقل مؤقت تريس 48 ملم
جليكاين 39 مم
الميثانول بنسبة 20 ٪
SDS 0.1 ٪

ضبط مستوى الصوت إلى 1 ليتر مع DH 2 O. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
SDS على شكل مسحوق والميثانول السامة. ولذلك ، استخدم قفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة.

Discussion

في هذه الدراسة ، ونحن تصف تحليل البلدان المتوسطية الشريكة التي PAGE - BN. ويستخدم نهج 2D إلى البلدان المتوسطية الشريكة الأولى في ظل ظروف منفصلة الأصلي ، ومن ثم إلى مزيد من تقسيم منهم الى مكوناتها الفردية من جانب البعد الثاني SDS - PAGE.

مستعدون lysates عينات من الخلايا. لكثير من البلدان المتوسطية الشريكة من solubilization ، هناك حاجة إلى المنظفات المناسبة ، مما يحافظ على بنية مجمعات البروتين. هنا ، فإننا نستخدم تريتون 0.1 ٪ X - 100. ومع ذلك ، فإن المنظفات الأمثل وتركيزه مناسبة ويتم تحديدها تجريبيا لكل لجنة السياسة النقدية. في حالة تريتون X - 100 ، على سبيل المثال ، فقد أفيد أن تركيزات منخفضة المنظفات تسمح بتحديد نموذج مثنوي من 1 واو واو 0 - أتباز المعقدة (أرنولد ، فايفر وآخرون 1998). أعلى تريتون X - 100 تركيزات ، ومع ذلك ، تؤدي إلى تفكك للثنائيات ، وإلى زيادة مماثلة في موحودي F 1 0 - F أتباز المعقدة. وهذا ينسجم مع إحدى دراساتنا السابقة ، وتبين لنا أن يتم الاحتفاظ متعددي الكفاءات المعقدة مستقبلات خلايا T (TCR) عندما انتزعت مع تركيزات منخفضة من بريج 96 ، في حين أن استخدام تركيز أعلى أو المنظفات آخر يطلق عليه النتائج في ديجيتونين استخراج TCR موحودي (Schamel ، خيمينيز وآخرون 2005). يشيع استخدام المنظفات التي يمكن اختبارها وتشمل ديجيتونين (0.5 إلى 1 ٪) ، تريتون X - 100 (0.1 إلى 0.5 ٪) ، بريج 96 (0.1 إلى 0.5 ٪) ، أو dodecylmaltoside (0.1 إلى 0.5 ٪). هذه الكواشف والمنظفات nonionic ، والتي تميل الى ان تكون الأفضل لاستقرار السياسة النقدية. أن تدرك أنه ينبغي تجنب الاتصال مع الحزب الديمقراطي الصربي والمنظفات القوية الأخرى (كاماتشو - كارفاخال ، Wollscheid آخرون 2004).

مطلوب غسيل الكلى للجنة السياسة النقدية لتحقيق lysates فصل في هلام BN (كاماتشو - كارفاخال ، Wollscheid آخرون 2004) ؛ (Heiss ، Junkes وآخرون 2005). يبدو أن تعديل تركيز الملح أو إزالة الشوائب منخفضة الوزن الجزيئي أمر حاسم لدقة عالية. من الجدير بالذكر أيضا أن التحضيرات الغشاء والبلدان المتوسطية الشريكة ، والتي تم في وقت لاحق وimmunopurified eluted من الأضداد ، هي مناسبة لPAGE - BN (سوامي ، Siegers وآخرون 2006). في كلتا الحالتين ، فإن عينات لا يجب أن تكون لمدال BN - PAGE الانفصال ، وإذا نفذ تحلل الغشاء أو شطف في BN - تحلل العازلة.

لفصل البروتين PAGE - BN ، هناك حاجة لCoomassie الصبغة الزرقاء ، والتي تربط unspecifically للبروتينات ، ويغطي عليها مع الشحنات السالبة. وبالتالي ، Coomassie الزرقاء تمكن التنقل الكهربي للبروتينات نحو الكاثود عند pH محايدة (وSchägger فون Jagow 1991) ، (Schägger ، كريمر وآخرون 1994). علاوة على ذلك ، Coomassie الزرقاء يمنع التجميع البروتين في هلام التراص خلال الكهربائي. لPAGE - BN ، Coomassie G250 يجب أن يكون استخدامها بدلا من الزرقاء Coomassie R250 أو الغروية Coomassie البلوز.

قبل تشغيل BN - هلام ، فمن الضروري التأكد من أن النسبة المئوية للهلام يتلاءم مع الحجم المتوقع من لجنة السياسة النقدية في المصالح. BN - الجاهزة المواد الهلامية مع تدرجات مختلفة والمخازن المناسبة متوفرة تجاريا من Invitrogen (NativePAGE Novex النظام جل مكرر تريس). ولكن يمكن أيضا أن تكون المواد الهلامية BN - المعدة باستخدام خلاط التدرج مع مضخة persistaltic. لضمان وجود التدرج سليمة ، يجب أن تدفق السائل باستمرار خلال صب ويجب تجنب الفقاعات. نوصي تحميل التخفيفات عينة مختلفة على الجل بسبب الحمولة الزائدة يمكن ان يؤدي الى هطول الأمطار البروتين أثناء عملية الكهربائي. وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشغيل المواد الهلامية في BN - 4 درجات مئوية لمنع تدهور البروتين والبلدان المتوسطية الشريكة للحفاظ على حالها.

ويمكن أن يتحقق بعد BN - PAGE ، والتصور من البلدان المتوسطية الشريكة من خلال تلطيخ Coomassie الزرقاء الرائعة ، وتلطيخ الفضة أو immunoblotting. تصور العصابات البروتين تلطيخ Coomassie أو الفضة هي مناسبة لمزيد من التحليل عن طريق مطياف الكتلة (كاماتشو - كارفاخال ، Wollscheid وآخرون 2004). في حالة immunoblotting ، والظروف المثلى لنقل البلدان المتوسطية الشريكة من الفائدة يجب أن تكون مصممة تجريبيا. أن يدرك أيضا أن يتم نقل Coomassie زرقاء أثناء النشاف من هلام - BN. ولذلك ، سوف يكون عديم اللون الجل بعد نقل ناجحة ، في حين أن غشاء سيبذل اللون الأزرق. كذلك ، فإنه من المهم أن نذكر أن ليس كل الأجسام المضادة الأولية ، والتي تعمل للكشف عن بعد SDS - PAGE ، ينطبق على immunoblotting على PAGE - BN. يمكن أن يحدث أن الأجسام المضادة لا تعترف لجنة السياسة النقدية في المصالح لان مخفيا حاتمة بهم في التشكل الأصلية من البروتينات. للتغلب على هذه المشكلة ، فمن الممكن أن تفسد البروتينات داخل الجل - BN قبل نقل بالغلي الجل قريبا في المخزن 1X عينة SDS.

في مثالنا ، نحن لم تخضع للBN جل مباشرة إلى الكشف عن عصابات من البروتين. بدلا من ذلك ، ونحن كذلك تنقسم إلى BN - PAGE فصل lysate بواسطة dimensi secondعلى SDS - PAGE. في البعد الثاني جل SDS ، والبروتينات داخل موحودي ترحيل قطري القطعي بسبب الجل التدرج في الأول وهلام الخطية في البعد الثاني (كاماتشو - كارفاخال ، Wollscheid وآخرون 2004). هذا يسمح للبلدان المتوسطية الشريكة من السهل تحديد ، لأن مترجم انهم تحت هذا قطري القطعي. يتم فصل المكونات الفرعية للجنة السياسة النقدية المتميزة واحد في خط عمودي في البعد الثاني SDS - PAGE. يمكن التعرف على المكونات التي يتم المكونة من البلدان المتوسطية الشريكة dinstinct عدة على خط أفقي وفقا لحجم لجنة السياسة النقدية. ومع ذلك ، فإنه ينبغي النظر إلى أن العديد من البقع التي تظهر البروتين في سطر واحد عمودي يمكن أيضا أن تكون جزءا من مجمعات منفصلة التي تهاجر في نفس الموضع في PAGE - BN. يمكن الحصول على الدليل الأخير على أن وجودهم في لجنة السياسة النقدية من قبل نفس مقايسة الأضداد هلام تحول مقرا لها. في هذا الاختبار ، يتم تحضين الخلوية lysate مع جسم مضاد ضد بروتين ممثلة واحدة من النقاط التي تم تحديدها قبل PAGE - BN. هذه النتائج في التحول من جميع البلدان المتوسطية الشريكة التي تحتوي على هذا البروتين نحو كتلة الجزيئية أعلى في البعد الأول. والبروتينات الأخرى التي هي أيضا جزء من هذه البلدان المتوسطية الشريكة الخضوع لهذا التحول معقدة محددة ، وبالتالي من السهل تحديد في البعد الثاني SDS - هلام.

لا يمكن إلا أن يكون تحليل تركيبة البلدان المتوسطية الشريكة التي PAGE - BN ، بل أيضا في تحديد رياضيات الكيمياء من الممكن (وريث Schamel 2000) ؛ (Schamel 2001) ، (سوامي ، Minguet وآخرون 2007). لهذا الغرض ، يمكن إجراء فحص NAMOS (اللغة الأم المستندة إلى الضد التنقل التحول مقايسة). كما هو الحال في جل مقايسة الأضداد القائم على التحول ، ويتم تحضين lysates الخليوي مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة الوحيدات. هذا يؤدي إلى تحريض immunoshifts الكهربي في المواد الهلامية BN ، التي تسمح للاستدلال عن مدى التحول في البلدان المتوسطية الشريكة للرياضيات الكيمياء

في conlusion ، BN - PAGE مناسبة للتعرف على البلدان المتوسطية الشريكة ، وتحديد تكوينها ، والحجم ، فضلا عن وفرة نسبية. كما أجريت مقايسة NAMOS ، فإنه يوفر أيضا إمكانية لتحديد السياسة النقدية للرياضيات الكيمياء معينة. نظرا تطبيقه عام ، هذه التقنية هي أداة مفيدة جدا لتحديد خصائص البلدان المتوسطية الشريكة (ديكر ، مولر وآخرون 1996) ؛ (Wittig وSchagger 2008) ، (واغنر ، Rehling وآخرون 2009) ؛ (Wittig وSchägger 2009) .

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نشكر مايكل ريث ، Schägger هيرمان ، ومارغريتا كاماتشو - كارفاخال للحصول على الدعم العلمي. وقد تم تمويل هذا العمل من FORSYS fuer Bildung Bundesministerium والإضافية اطلعوا (BMBF) ، عن طريق BIOSS من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) ، ومعتمدة في جزء من مبادرة التميز للحكومات الاتحادية والدولة الألمانية (GSC - 4 ، Spemann كلية الدراسات العليا ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics