Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

* These authors contributed equally
Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multiprotein complexen (MPL) spelen een cruciale rol in cell signaling, omdat de meeste eiwitten zijn te vinden in functionele of regelgeving complexen met andere eiwitten (Sali, Glaeser et al.. 2003). Zo is de studie van eiwit-eiwit interacties netwerken vereist de gedetailleerde karakterisering van de mediterrane partnerlanden te krijgen een integratieve begrip van eiwit-functie en regulatie. Voor identificatie en analyse, moet mediterrane partnerlanden worden gescheiden onder natieve omstandigheden. In deze video, beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door de blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). BN-PAGE is een techniek dat de scheiding van de Mediterrane partnerlanden staat in een natieve conformatie met een hogere resolutie dan die door gel-filtratie of sucrose dichtheid ultracentrifugatie, en is daarom nuttig om te bepalen MPC omvang, samenstelling, en relatieve rijkdom (Schägger en von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al. 1994.). Door deze methode worden de eiwitten gescheiden op basis van hun hydrodynamische grootte en de vorm in een polyacrylamide matrix. Hier tonen we de analyse van de mediterrane partnerlanden van het totale cellulaire lysaten, erop te wijzen dat lysaat dialyse is de cruciale stap om BN-PAGE te maken van toepassing zijn op deze biologische monsters. Met behulp van een combinatie van de eerste dimensie BN-en de tweede dimensie SDS-PAGE, laten we zien dat mediterrane partnerlanden gescheiden door BN-PAGE kan verder onderverdeeld worden in hun afzonderlijke bestanddelen door middel van SDS-PAGE. Visualisatie van de MPC componenten op gel scheiding wordt uitgevoerd door standaard immunoblotting. Als een voorbeeld voor MPC analyse door BN-PAGE, hebben we gekozen voor de goed gekarakteriseerde eukaryotische 19S, 20S en 26S proteasomen.

Protocol

** Deze video protocol is gebaseerd op een bijbehorende publicatie 1: Blue Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de identificatie en analyse van multiprotein complexen. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, en Wolfgang WA Schamel. Wetenschap STKE 2006 (345): pl2, 25 juli 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Klik hier om deze publicatie te zien .

1. De voorbereiding van gedialyseerd cellysaat

  1. Oogst 10x10 6 cellen en pellet door centrifugeren bij 350g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  2. Was de celpellet drie keer met 1 ml ijskoud PBS (recept 1), centrifuge als in stap 1.1.
  3. Resuspendeer pellet in 250 ui van de ijskoude BN-Lysis Buffer (recept 2) en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
  4. Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C om onoplosbaar materiaal te verwijderen.
  5. Smelt een gat in de dop van een 1.5-mL microcentrifugebuis het gebruik van de verwarmde grote diameter kant van een Pasteur pipet, en plaats de buis op ijs afkoelen tot 4 ° C.
  6. Transfer supernatans van stap 1.4 in de gekoelde buis met het gat in de dop.
  7. Plaats een dialysemembraan (moleculair gewicht cut-off van 10 kD) met een pincet op de top van de geopende tube, sluit de dop, en snijd het overtollige dialyse membraan dat uitsteekt.
  8. Verzegeling van de dop op de zijkant voorzichtig met Parafilm.
  9. Omkeren van de buizen en centrifuge zijn kop tegen de laagst mogelijke snelheid in een 50-mL conische buizen in een celkweek centrifuge voor 10 sec bij 4 ° C. Verwijder de omgekeerde buis uit de centrifuge met een pincet om te voorkomen dat het draaien van de buis goede kant naar boven.
  10. Bereid een bekerglas van 100 ml met koud BN-dialysebuffer (recept 3) en een roer plaat. Gebruik minimaal 10 ml van de BN-dialysebuffer per 100-pi monster.
  11. Het aanbrengen van de buis met tape op zijn kop in de beker, en verwijder de luchtbellen uit het gat onder de kap met behulp van een gebogen Pasteur pipet.
  12. Plaats beker op de top van een magneet roerder, zet de roerder en laat het gedurende 6 uur of een nacht in de koude kamer. Controleer af en toe roeren ervoor te zorgen dat niet is luchtbellen te creëren bij de dialyse membraan.
  13. Verzamel de gedialyseerd cellysaat in een nieuwe gekoelde microcentrifugebuis.

2. Storten van BN-gels

  1. Gradiënt gel gieten gebeurt bij kamertemperatuur met een gradiënt mixer. Handschoenen moeten worden gedragen, omdat polyacrylamide is zeer neurotoxisch. Vermijd elk contact met de SDS.
  2. Plaats de gradiënt mixer op een roer plaat en bevestig deze aan een stuk flexibele slang. Sluit het kanaal met de klep en sluit de slang met een klem. Plaats een magneetroerder 15% in de "high" cilinder aangesloten op de slang.
  3. Schroef de flexibele slang in een peristalitic pomp en bevestig een injectienaald tot het einde. Plaats vervolgens de naald tussen de twee glasplaten van de gel apparaat.
  4. Bereid 4% (recept 5) en 15% (recept 6) het scheiden van gel-oplossingen, het toevoegen van APS en TEMED onmiddellijk voor gebruik. De gecombineerde volumes moet gelijk zijn aan het volume van de scheidende gel.
  5. Giet deze gel-oplossingen in de overeenkomstige cilinders van het verloop mixer (4% in de "low" en 15% in de "hoge" cilinder).
  6. Open de afsluiter en de kracht uit de luchtbel in het kanaal tussen de twee reservoirs gel door te drukken op de linker cilinder met uw duim.
  7. Schakelaar op de magneetroerder, verwijder de klem en zet de peristalitic pomp tot 5 ml per minuut. Laat de gel langzaam stromen tussen de glasplaten. Zorg ervoor dat de naald altijd boven de vloeistof.
  8. Laat alle vloeistof om de gel apparaat in te voeren, en dan zachtjes overlay met isopropanol. Laat de gel polymeriseren voor ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Reinig het apparaat gieten direct met dH 2 O (geen wasmiddel).
  10. Verwijder de isopropanol, wassen met dH 2 O, en verwijder de dH 2 O met een Whatman papier.
  11. Bereid een 3,2% stacking gel (recept 7), het toevoegen van APS en TEMED onmiddellijk voor gebruik.
  12. Giet het stapelen gel op de top van de scheidende gel en de invoering van de kam tussen de glazen platen, het vermijden van bubbels. Nadat de stacking gel heeft gepolymeriseerd Koel de gel tot 4 ° C.
  13. Onmiddellijk voorafgaand aan het laden monster, verwijder dan eerst langzaam de kam, te trekken uit op een hoek met het vlak van de gel. Hierdoor kan de lucht om in de zakken snel, waardoor de kwaliteit van de putten verbetert.

3. Scheiding van gedialyseerd cellysaat door BN-PAGE

  1. Laad 1 tot 40 ul van gedialyseerd lysaat en 10 tot 20 pl van Marker Mix (recept 10) in de droge putten bij 4 ° C. Overlay van de monsters in elk putje met koude kathode Buffer (recept 8).
  2. Vul de binnenste kamer met koud CatHode Buffer en de buitenste / Tweede Kamer met koud Anode Buffer (recept 9).
  3. Breng 100 V om een ​​MiniGel of 150V op een grote gel, totdat de monsters zijn binnengekomen de scheidende gel. Laat de gel bij 4 ° C.
  4. Verhoog de spanning tot 180 V (MiniGel) of 400 V (grote gel) en lopen tot de kleurstof front bereikt het einde van de gel. De aanloop duurt 3 tot 4 uur voor een mini-, en 18 tot 24 uur voor een grote gel.

4. Tweede dimensie SDS-PAGE

  1. Bereid een standaard 10% SDS-gel (recepten 12-15) met een grote baan voor de eerste dimensie BN-PAGE baan, een vaste baan voor het molecuulgewicht marker, en een vaste baan voor een hoeveelheid van de gedialyseerd lysaat dat heeft gemengd met SDS sample buffer (recept 11) en gekookt gedurende 5 minuten op 95 ° C. Gebruik afstandhouders waarvan de dikte werd verhoogd met twee lagen plakband het laden van de BN-PAGE gel slice op de SDS-gel te vereenvoudigen.
  2. Verwijder de BN-PAGE-gel in de platen van de elektroforese apparatuur en voorzichtig los te wrikken van een plaat.
  3. Verwijder de stacking gel en knip de baan van de BN-PAGE-gel met de eiwitten van belang.
  4. Plaats de BN-PAGE gel slice in 2x SDS Sample Buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Kook de BN-PAGE gel slice kort (niet meer dan 20 sec) in een magnetron.
  6. Incubeer de BN-PAGE gel slice in de hete SDS sample buffer voor nog 15 min bij kamertemperatuur.
  7. Laad de BN-PAGE gel slice in de grote meer dan het stapelen gel van de SDS-PAGE gel te vermijden luchtbellen, en overlay het segment met SDS sample buffer. Belasting marker en lysaat controle.
  8. Voer de elektroforese volgens standaard protocollen.

5. Detectie van MPC subeenheden door immunoblotting

  1. Voor de overdracht voor te bereiden zes Whatman papier en een PVDF-membraan past bij de grootte van de SDS-gel.
  2. Incubeer de PVDF-membraan in 100% methanol gedurende 30 s en geniet van de Whatman papieren in transfer buffer (recept 16).
  3. Plaats drie Whatman papier, het PVDF membraan, de SDS-gel (te verwijderen stapelen gel), en weer drie Whatman papieren in een sandwich-achtige structuur in een halfdroge overdracht cel.
  4. Solliciteer 20 V voor 25 minuten.
  5. Detect eiwitten volgens standaard immunoblotting protocollen.

6. Representatieve resultaten

Presenteren we de analyse van de eukaryote 19S, 20S en 26S proteasomen als een voorbeeld voor MPC karakterisering door 2D BN / SDS-PAGE (figuur 1A). HEK293 cellen werden gelyseerd met een buffer die 0,1% Triton X-100 als een reinigingsmiddel voor de membranen verstoren en solubiliseren membraaneiwit complexen. Deze lysaten werden gedialyseerd tegen BN-Dialyse buffer om de zouten en kleine metabolieten te verwijderen. Daarna werden mediterrane partnerlanden van elkaar gescheiden door 4-15% gradiënt BN-PAGE, gevolgd door een tweede dimensie SDS-PAGE. Eiwitten werden gevisualiseerd door immunoblotting met antilichamen tegen de subeenheden β2 en Mcp21 van het 20S proteasoom.

Figuur 1
Figuur 1. Een twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE benadering met behulp van cellulaire lysaten. (A) Stroomdiagram van een 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE aanpak van mobiele lysaten. (B) Schematische schema van een 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE. Eiwitten en mediterrane partnerlanden worden van elkaar gescheiden onder natieve omstandigheden door BN-PAGE in een eerste dimensie. Voor de tweede dimensie, eiwitten en / of de mediterrane partnerlanden worden gedenatureerd door middel van SDS in de gel strip na de scheiding door BN-PAGE en vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE. Monomere proteïnen zal migreren in een hyperbolische diagonale als gevolg van de gradiënt gel in de eerste en een lineaire gel in de tweede dimensie. Componenten van een concrete MPC zal worden gevonden onder de diagonaal, gelegen op een verticale lijn.

Het is aangetoond dat door een combinatie van eerste dimensie BN-en de tweede dimensie SDS-PAGE, monomere proteïnen binnen een hyperbolische diagonaal door de gradiënt gel migreren in de eerste en de lineaire gel in de tweede dimensie ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. figuur 1B). Componenten van mediterrane partnerlanden bevinden zich onder deze diagonaal. Eiwitten die subeenheden van dezelfde MPC vertegenwoordigen kan worden gevonden in een verticale lijn in de tweede dimensie, terwijl verschillende plekken van hetzelfde eiwit in een horizontale lijn wijzen op de aanwezigheid van het eiwit in een aantal verschillende Mediterrane partnerlanden. Figuur 2 laat zien dat in ons experiment immunoblotting tegen β2 en Mcp21 bleek de aanwezigheid van specifieke eiwit-complexen die deze proteasomale subeenheden. Beide eiwitten werden gedetecteerd als afzonderlijke plekken gerangschikt in een horizontale lijn, wat aangeeft dat β2 en Mcp21 bestanddelen van verscheidene afzonderlijke mediterrane partnerlanden te vertegenwoordigen. Deze mediterrane partnerlanden kon duidelijk worden geïdentificeerd als de 26S-proteasoom (20S 19S plus kap), de 20S proteasoom, samen met de regelgevende subeenheid PA28, en de 20S proteasomen alleen, op basis van hun omvang en samenstelling. Tezamen bieden deze automaLTS aan te tonen dat endogene mediterrane partnerlanden kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door een twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE benadering met behulp van cellulaire lysaat. Deze methode is toepasbaar voor de bepaling van de omvang, samenstelling, en relatieve rijkdom van de mediterrane partnerlanden.

Figuur 2
Figuur 2. Opsporen van verschillende vormen van de eukaryote proteasoom door immunoblotting na twee-dimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE. Voor identificatie en analyse van eukaryotische proteasomen, werden HEK293 cellen gelyseerd met 0,1% Triton X-100. Cellulaire lysaten werden gedialyseerd en vervolgens onderworpen aan BN-PAGE (4-15%) te scheiden Mediterrane partnerlanden. Daarna werd een tweede dimensie SDS-PAGE (10%) lopen voor grootte scheiding van individuele subcomponenten. Immunoblotting werd uitgevoerd met specifieke antilichamen herkennen de Mcp21 en β2 subunit van de 20S kern complex, en de regelgevende subeenheid PA28.

I. Tabel van specifieke reagentia (alfabetische volgorde):

Reagens Vennootschap Reacties
6-aminohexanoic zuur
(Ε-aminocapronzuur)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland Deze chemische stof is een irriterend en moeten worden behandeld met handschoenen.
Acrylamide-bisacrylamide-oplossing (40%), Mix 32:1 Applichem, Darmstadt, Duitsland Deze oplossing is neurotoxisch en moeten worden behandeld met handschoenen.
Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny
Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland
Coomassie blauw G250 Serva, Heidelberg, Duitsland-veel- Niet vervangen door andere vormen van Coomassie kleurstof, zoals Coomassie blauw R250 of colloïdale Coo-Massie blues.
Digitonine Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland Digitonine is giftig. Handschoenen worden gedragen bij het werken met buffers of monsters die deze zeep.
Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, Duitsland
Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 is giftig. Handschoenen worden gedragen bij het werken met buffers of monsters die deze wasmiddel.

II. Tabel van specifieke materiaal en apparatuur:

Uitrusting Vennootschap
Dialysemembranen (moleculair gewicht cut-off 10 tot 50 kD) Roth, Karlsruhe, Duitsland
Gelelektroforese systeem Bijvoorbeeld van Bio-Rad, München, Duitsland
Gradient mixer Self-made of commercieel verkrijgbaar bij Bio-Rad, München, Duitsland
Slangenpomp Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Duitsland
Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Duitsland
Semi-droge overdracht apparatuur Bijvoorbeeld van Bio-Rad, München, Duitsland
Silicium buis (3 tot 5 mm diameter, 1 m lengte) NeoLab, Heidelberg, Duitsland

III. Tabel van de recepten:

Nee. Buffers en oplossingen Inhoud Reacties
1 Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) Na 2 HPO 4 8.1 mMKH 2
PO 4 1.5 mM
NaCl 138 mM
KCl 2,7 mM
Oplossing moet pH 7,4 zijn, als goed voorbereid.
2 BN-Lysis Buffer Base buffer
Bis-tris 20 mM
ε-aminocapronzuur 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8.0 2 mM
Glycerol 10%

Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C.

Wasmiddel
Digitonine 0,5 tot 1,0%
of Brij 96 0,1 tot 0,5%
of Triton X-100 0,1 tot 0,5%
of Dodecylmaltoside 0,1 tot 0,5%

Protease en fosfatase-remmers
Aprotinine 10 ug / mL
Leupeptin 10 ug / mL
PMSF 1 mM
Natriumfluoride 0,5 mM
Natrium orthovanadate 0,5 mM
De juiste reinigingsmiddel dient empirisch te worden vastgesteld en moet hetzelfde zijn als die in de andere lysisbuffer recepten.

Digitonine moet worden toegevoegd vlak voor het gebruik van een 2%-oplossing in voorraad dH 2 O (op te slaan in 5-ml fracties bij -20 ° C).

Protease en fosfatase remmen-ORS moeten worden toegevoegd onmiddellijk voor gebruik.

Na toevoeging van natrium orthova-nadate, zal de buffer wordt geelachtig van kleur.
3 BN-dialysebuffer Base buffer
Bis-tris 20 mM
ε-aminocapronzuur 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8.0 2 mM
Glycerol 10%

Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C.

Wasmiddel
Digitonine 0,3 tot 0,5%
of Triton X-100 0.1%
of Brij 96 0,1%
of Dodecylmaltoside 0,1%

Protease en fosfatase-remmers
PMSF 1 mM
Natrium orthovanadate 0,5 mM
De juiste reinigingsmiddel dient empirisch te worden vastgesteld en moet hetzelfde zijn als die in de andere lysis buffers, maar op de aangegeven lagere concentraties.

Reinigingsmiddel moet worden toegevoegd aan pre-vent aggregatie bij het stapelen stap van gelelektroforese.

Protease en fosfatase remmen-ORS moeten worden toegevoegd onmiddellijk voor gebruik.
4 3x BN-Gel Buffer Bis-tris 150 mM
ε-aminocapronzuur 200 mM

Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C.
5 4% scheiden Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml
Acrylamide / Bisacrylamide 1,50 mL
dH 2 O 8,50 mL
APS, 10% in dH 2 O 54 uL
TEMED 5,4 pi
Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie.

Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten.
6 15% Scheiden Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml
Acrylamide / Bisacrylamide 5,63 mL
Glycerol 70% 4,38 mL
APS, 10% in dH 2 O 42 uL
TEMED 4,2 pi
Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie.

Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten.

De concentratie van acrylamide-bisacrylamide kan ook worden gevarieerd als nodig van 10 à 18%.
7 3,2% Stapelen Gel 3x BN-gel Buffer (recept 4) 3,00 ml
Acrylamide / Bisacrylamide 0,72 mL
dH 2 O 5,28 mL
APS, 10% in dH 2 O 120 uL
TEMED 12 pi
Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie.

Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten.
8 Kathode Buffer Bis-tris 15 mM
Tricine 50 mM
Coomassie blue G250 0,02%

Bereid 1 liter als een 10x voorraad, breng de pH op 7,0 met HCl, en bewaar bij 4 ° C.
Verdunnen 1:10 met dH 2 O voor gebruik.
Niet vervangen door andere vormen van Coomassie kleurstof, zoals Coomassie blauw R250 of colloïdale Coomassie blues.
9 Anode Buffer Bis-tris 50 mM

Bereid 1 liter als een 10x voorraad, breng de pH op 7,0 met HCl, en bewaar bij 4 ° C.
Verdunnen 1:10 met dH 2 O voor gebruik.
10 Marker Mix Aldolase (158 kD) 10 mg / ml
Catalase (232 kD) 10 mg / ml
Ferritine (440 en 880 kD) 10 mg / ml
Thyreoglobuline (670 kD) 10 mg / ml
BSA (66 en 132 kD) 10 mg / ml
Bis-tris 20 mM
NaCl 20 mM
Glycerol 10%

Breng de pH op 7,0 met HCl. Bewaren bij 4 ° C.
Moleculair gewicht markers zijn ook commercieel verkrijgbaar uit verschillende bronnen, waaronder vitro-gen of Pharmacia.
11 SDS sample buffer Tris 12,5 mM
SDS 4%
Glycerol 20%
Broomfenolblauw 0,02%

Pas de pH op 6,8. Ter beperking van disulfidebindingen, voeg 9 ml β-mercapto-ethanol.
SDS als een poeder en β-mer-captoethanol zijn giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap.
12 4x lagere buffer Tris 1,5 M
SDS 0,4%

Pas de pH op 8,8.
SDS als een poeder is giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap.
13 4x bovenste buffer Tris 0,5 M
SDS 0,4%

Pas de pH op 6,8.
SDS als een poeder is giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap.
14 10% Scheiden Gel Acrylamide (30%) 2,0 ml
4x lagere buffer 1,5 ml
dH 2 O 2,454 mL
APS, 10% in dH 2 O 40 uL
TEMED 6 pi
Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie.

Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten.
15 4,8% Stapelen Gel Acylamide (30%) 320 pi
4x bovenste buffer 500 pL
dH 2 O 1,16 mL
APS, 10% in dH 2 O 20 uL
TEMED 2 pl
Voeg APS en TEMED onmid-tely voor het storten gel, omdat deze reagentia te bevorderen polymerisatie.

Dit recept is voldoende om een ​​30-ml gel gegoten. Pas volumes voor het aantal en de grootte van de gels wordt gegoten.
16 Halfdroge Transfer Buffer Tris 48 mM
Glycine 39 mM
Methanol 20%
SDS 0,1%

Stel het volume op 1 liter met dH 2 O. Bewaren bij kamertemperatuur.
SDS als een poeder en methanol zijn giftig. Gebruik daarom handschoenen en werken onder een kap.

Discussion

In deze studie beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door BN-PAGE. Een 2D-aanpak wordt gebruikt om eerst aparte mediterrane partnerlanden onder natieve omstandigheden, en vervolgens om verder te verdelen in hun afzonderlijke componenten door een tweede dimensie SDS-PAGE.

Monsters worden bereid uit cellysaten. Voor de oplosbaarheid van een groot aantal mediterrane partnerlanden, is een geschikt reinigingsmiddel nodig, die behoudt de structuur van het eiwit complexen. Hier maken we gebruik van 0,1% Triton X-100. Echter, de optimale wasmiddel en de geschikte concentratie moeten empirisch worden bepaald voor elke MPC. In het geval van Triton X-100, bijvoorbeeld, heeft gemeld dat lage concentraties detergent de identificatie van een dimeer vorm van de F 1 staat F 0-ATPase complex (Arnold, Pfeiffer et al.. 1998). Hogere Triton X-100-concentraties, echter leiden tot de dissociatie van het dimeer en een corresponderende toename van de monomere F 1 F 0-ATPase complex. Dit is in lijn met een van onze vroegere studies werden we zien dat de multivalente T-cel-receptor complex (TCR) is behouden wanneer geëxtraheerd met lage concentraties van Brij 96, terwijl het gebruik van hogere concentratie of van een ander schoonmaakmiddel digitonine resultaten genoemd in de winning van monomere TCR (Schamel, Arechaga et al.. 2005). Veelgebruikte detergenten die getest kunnen worden zijn onder digitonine (0,5 tot 1%), Triton X-100 (0,1 tot 0,5%), Brij 96 (0,1 tot 0,5%), of dodecylmaltoside (0,1 tot 0,5%). Deze reagentia zijn niet-ionische detergenten, die meestal het beste voor MPC stabiliteit. Wees ervan bewust dat contact met de SDS en andere sterke reinigingsmiddelen moet worden vermeden (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004).

Dialyse van de lysaten nodig is om MPC scheiding in een BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Bereiken; (Heiss, Junkes et al. 2005.). Het lijkt erop dat de aanpassing van de zoutconcentratie of de verwijdering van een laag moleculair gewicht onzuiverheden is van cruciaal belang voor een hoge resolutie. Het is opmerkelijk dat ook de membraan de voorbereidingen en de mediterrane partnerlanden, die zijn immunopurified en later geëlueerd van het antilichaam, zijn geschikt voor BN-PAGE (Swamy, Siegers et al.. 2006). In beide gevallen hebben de monsters niet te worden gedialyseerd voor BN-pagina scheiding, als membraan lysis of elutie wordt uitgevoerd in BN-lysis buffer.

Voor eiwit scheiding door BN-PAGE, is de kleurstof Coomassie blauwe nodig, die unspecifically bindt aan eiwitten en dekt ze met negatieve ladingen. Daarbij Coomassie blauw maakt de elektroforetische mobiliteit van eiwitten naar de kathode bij een neutrale pH (Schägger en von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994.). Bovendien, Coomassie blauw voorkomt eiwitaggregatie in het stapelen gel tijdens de elektroforese. Voor de BN-PAGE, Coomassie G250 moet worden gebruikt in plaats van Coomassie blauw R250 of colloïdale Coomassie blues.

Voordat u een BN-gel, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het percentage van de gel past op de verwachte grootte van de MPC van belang. Prefab BN-gels met verschillende hellingen en geschikte buffers zijn verkrijgbaar bij Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Maar BN-gels kunnen ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer, samen met een persistaltic pomp. Het garanderen van een intact gradiënt, moet de vloeistof continu stroom tijdens het storten en bellen moet worden vermeden. Wij raden het laden van de verschillende verdunningen monster op de gel, omdat overbelasting kan leiden tot eiwit neerslag tijdens het elektroforese proces. Daarnaast moet BN-gels worden uitgevoerd bij 4 ° C om eiwitafbraak te voorkomen en te houden van de mediterrane partnerlanden intact.

Na de BN-PAGE, visualisatie van de mediterrane partnerlanden kan worden bereikt door Coomassie brilliant blue kleuring, zilverkleuring of immunoblotting. Eiwitbanden gevisualiseerd door Coomassie of zilverkleuring zijn geschikt voor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). In het geval van immunoblotting, de optimale overdracht van voorwaarden voor de mediterrane partnerlanden van belang te hebben empirisch worden bepaald. Wees ervan bewust dat Coomassie blauw ook wordt overgedragen tijdens blotting van een BN-gel. Daarom zal de gel kleurloos zijn na de succesvolle overdracht, terwijl het membraan zal een blauwe kleur uit te oefenen. Verder is het belangrijk om te vermelden dat niet elke primaire antilichaam, die werkt voor de detectie na SDS-PAGE, is van toepassing op immunoblotting bij de BN-PAGE. Het kan gebeuren dat niet antilichamen doen MPC van belang te herkennen omdat hun epitoop is verborgen in de natieve conformatie van de eiwitten. Om dit probleem te verhelpen, is het mogelijk om de eiwitten te denatureren binnen de BN-gel voorafgaand aan de overdracht door koken van de gel binnenkort in 1x SDS sample buffer.

In ons voorbeeld hebben we niet direct onder de BN-gel om detectie van eiwit bands. In plaats daarvan hebben we verder onderverdeeld de BN-PAGE gescheiden lysaat door een tweede dimensiop SDS-PAGE. In de tweede dimensie SDS-gel, monomere proteïnen migreren binnen een hyperbolische diagonaal als gevolg van de gradiënt gel in de eerste en de lineaire gel in de tweede dimensie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). Hierdoor kan de eenvoudige identificatie van de mediterrane partnerlanden, omdat ze zijn gelokaliseerd onder deze hyperbolische diagonaal. Subcomponenten van een welomschreven MPC worden gescheiden in een verticale lijn in de tweede dimensie SDS-PAGE. Componenten die bestanddelen van meerdere dinstinct mediterrane partnerlanden kunnen worden geïdentificeerd op een horizontale lijn op basis van de grootte van het MPC. Echter, het dient te worden beschouwd dat verschillende eiwitten plekken verschijnen in een verticale lijn ook kan deel uitmaken van afzonderlijke complexen die migreren op dezelfde positie in de BN-PAGE. Het definitieve bewijs dat ze aanwezig zijn in dezelfde MPC kan worden verkregen door een antilichaam-gebaseerde gel shift assay. In deze test, is cellulaire lysaat geïncubeerd met een antilichaam tegen een eiwit vertegenwoordigd door een van de geïdentificeerde plekken voorafgaand aan de BN-PAGE. Dit resulteert in een verschuiving van alle mediterrane partnerlanden die dit eiwit bevatten naar een hogere moleculaire massa in de eerste dimensie. Andere eiwitten die ook een deel van deze mediterrane partnerlanden zal ondergaan deze complexe specifieke shift en zijn dus gemakkelijk te herkennen in de tweede dimensie SDS-gel.

Niet alleen de samenstelling van de mediterrane partnerlanden kunnen worden geanalyseerd door BN-PAGE, maar ook de bepaling van hun stoichiometrie is mogelijk (Schamel en Reth 2000), (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al. 2007.). Voor dit doel kan een NAMOS assay (native antilichaam-gebaseerde mobiliteit-shift assay) worden uitgevoerd. Net als in de antilichaam-gebaseerde gel shift assay, zijn de cellulaire lysaten geïncubeerd met monoklonaal subunit-specifieke antilichamen. Dit leidt tot de inductie van elektroforetische immunoshifts in de BN-gels, die de gevolgtrekking toestaan ​​van de omvang van de verschuiving op de stoichiometrie van de mediterrane partnerlanden

In conlusion, BN-PAGE is geschikt voor de identificatie van mediterrane partnerlanden en de bepaling van hun omvang, samenstelling, evenals de relatieve overvloed. Uitgevoerd als een NAMOS test, maar biedt ook de mogelijkheid om de stoichiometrie van een bepaalde MPC te bepalen. Gezien de algemene toepasbaarheid, deze techniek is een zeer nuttig hulpmiddel voor de karakterisering van de mediterrane partnerlanden (Dekker, Müller et al. 1996.), (Wittig en Schagger 2008), (Wagner, Rehling et al. 2009.), (Wittig en Schägger 2009) .

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Michael Reth, Hermann Schägger, en Margarita Camacho-Carvajal voor de wetenschappelijke ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door FORSYS van het Bundesministerium für Bildung en Forschung (BMBF), door BIOSen van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), en mede ondersteund door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen (SGR-4, Spemann Graduate School ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics