Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l'analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

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Summary

In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

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Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

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Abstract

Complessi multiproteici (PPM) svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare, poiché la maggior parte delle proteine ​​si trovano in complessi funzionali o di regolamentazione con altre proteine ​​(Sali, Glaeser et al. 2003). Così, lo studio della proteina-proteina reti di interazione richiede la caratterizzazione dettagliata dei PPM di acquisire una comprensione integrativa della funzione della proteina e della regolamentazione. Per l'identificazione e l'analisi, MPC deve essere separata in condizioni native. In questo video, si descrive l'analisi di PPM di blu elettroforesi nativa su gel di poliacrilamide (BN-PAGE). BN-PAGE è una tecnica che permette la separazione di PPM in una conformazione nativa con una risoluzione superiore a quella offerta da gel filtrazione o la densità ultracentrifugazione saccarosio, ed è quindi utile per determinare la dimensione del MPC, la composizione e l'abbondanza relativa (Schägger e von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Con questo metodo, le proteine ​​sono separate in base alle loro dimensioni e la forma idrodinamica in una matrice di poliacrilamide. Qui, dimostriamo l'analisi di PPM del totale lisati cellulari, sottolineando che la dialisi lisato è il passo fondamentale per rendere BN-PAGE applicabili a questi campioni biologici. Usando una combinazione di prima dimensione BN-e seconda dimensione SDS-PAGE, dimostriamo che PPM separati da BN-PAGE può essere ulteriormente suddivisa in loro singoli costituenti mediante SDS-PAGE. Visualizzazione dei componenti MPC su gel di separazione viene effettuata mediante immunoblotting standard. Come esempio di analisi da MPC BN-PAGE, abbiamo scelto la 19S ben caratterizzati eucariotiche, 20S, 26S e proteasomi.

Protocol

** Questo protocollo video si basa su una pubblicazione associata 1: blu nativi elettroforesi su gel poliacrilammide (BN-PAGE) per l'identificazione e l'analisi di complessi multiproteici. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, e Wolfgang WA Schamel. Scienza STKE 2006 (345): PL2, 25 luglio 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Clicca qui per vedere questa pubblicazione .

1. Preparazione del lisato cellulare dializzati

  1. Harvest 10x10 6 celle e pellet da centrifugazione a 350g per 5 minuti a 4 ° C.
  2. Lavare il pellet di cellule per tre volte con 1 ml di PBS ghiacciato (ricetta 1), centrifuga come al punto 1.1.
  3. Risospendere il pellet in 250 ml di ghiacciata BN-Lysis Buffer (ricetta 2) e incubare in ghiaccio per 15 minuti.
  4. Centrifugare a 13.000 g per 15 minuti a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile.
  5. Sciogliete un foro nel tappo di un 1,5 mL provetta utilizzando il lato riscaldato di grande diametro di una pipetta Pasteur, quindi inserire la provetta in ghiaccio per raffreddare a 4 ° C.
  6. Trasferire il surnatante dal passo 1,4 nel tubo raffreddato con il foro nel tappo.
  7. Inserire una membrana di dialisi (peso molecolare di cut-off di 10 kD) con una pinza sulla parte superiore del tubo aperto, chiudere il tappo, e tagliare l'eccesso di membrana di dialisi che sporge.
  8. Sigillare il tappo sul lato accuratamente con Parafilm.
  9. Invertire i tubi e centrifugare a testa in giù alla velocità più bassa possibile in una provette coniche da 50 ml in una centrifuga di coltura cellulare per 10 secondi a 4 ° C. Rimuovere il tubo invertito dalla centrifuga con una pinzetta per evitare di trasformare la parte destra del tubo alto.
  10. Preparare un becher da 100 ml con freddo BN-Dialisi Buffer (ricetta 3) e un piatto mescolate. Utilizzare almeno 10 ml di BN-dialisi-Buffer per 100 microlitri del campione.
  11. Fissare il tubo con del nastro adesivo a testa in giù dentro il bicchiere, e rimuovere le bolle d'aria dal foro sotto il tappo con una pipetta Pasteur piegato.
  12. Bicchiere posto sulla cima di un agitatore magnetico, accendere l'agitatore e lasciare per 6 ore o una notte in cella. Controllare di tanto in tanto per garantire che mescolando non è la creazione di bolle d'aria a livello della membrana di dialisi.
  13. Raccolgono il lisato cellulare dializzati in un tubo nuova microcentrifuga refrigerata.

2. Versamento di BN-gel

  1. Gel gradiente colata avviene a temperatura ambiente con un mixer gradiente. I guanti devono essere indossati perché poliacrilammide è un potente neurotossico. Evitare qualsiasi contatto con SDS.
  2. Posizionare il mixer gradiente su un piatto mescolare e allegarlo a un pezzo di tubo flessibile. Chiudere il canale utilizzando la valvola e chiudere il tubo con una fascetta. Posizionare un agitatore magnetico del 15% nel cilindro "alto" collegato al tubo.
  3. Infilare il tubo flessibile in una pompa peristalitic e inserire un ago siringa fino alla fine. Poi, posto l'ago tra le due lastre di vetro dell'apparato gel.
  4. Preparare 4% (ricetta 5) e 15% (ricetta 6) che separa le soluzioni gel, l'aggiunta di APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. I volumi combinati dovrebbe essere pari al volume del gel di separazione.
  5. Versare queste soluzioni gel nei cilindri corrispondente del mixer pendenza (4% nel "basso" e il 15% nel cilindro "alto").
  6. Aprire la valvola e la forza fuori la bolla d'aria all'interno del canale che collega i due serbatoi in gel premendo sul cilindro sinistro con il pollice.
  7. Accendere l'agitatore magnetico, rimuovere la pinza, e accendere la pompa peristalitic a 5 ml al minuto. Lasciare che il gel di fluire lentamente tra le lastre di vetro. Assicurarsi che l'ago sia sempre al di sopra del liquido.
  8. Lasciare tutto il liquido di inserire l'apparato gel, e poi sovrapporre delicatamente con isopropanolo. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
  9. Pulire l'apparato versando immediatamente con dH 2 O (non usare detergenti).
  10. Rimuovere l'isopropanolo, lavare con dH 2 O, e rimuovere il dH 2 O con una carta Whatman.
  11. Preparare un gel 3,2% accatastamento (ricetta 7), l'aggiunta di APS e TEMED immediatamente prima dell'uso.
  12. Versare il gel di impilamento sulla parte superiore del gel di separazione e di introdurre il pettine tra le lastre di vetro, evitando le bolle. Dopo che il gel di impilamento è polimerizzato, il gel fresco fino a 4 ° C.
  13. Immediatamente prima del caricamento del campione, rimuovere lentamente il pettine, tirando fuori un angolo rispetto al piano del gel. Questo permette all'aria di entrare rapidamente nelle tasche, che migliora la qualità dei pozzi.

3. Separazione di lisato cellulare dializzati da BN-PAGE

  1. Carico 1-40 ml di lisato dializzato e da 10 a 20 l di Mix Marker (ricetta 10) nei pozzi a secco a 4 ° C. Sovrapposizione dei campioni in ogni pozzetto con tampone di catodo freddo (ricetta 8).
  2. Riempire la camera interna con Cat freddonell'hode stabilizzatrice e la camera esterna / inferiore con Buffer anodo freddo (ricetta 9).
  3. Applicare 100 V ad un minigel o 150V per un gel di grandi dimensioni, fino a quando i campioni sono entrati nel gel di separazione. Attivare il gel a 4 ° C.
  4. Aumentare la tensione a 180 V (minigel) o 400 V (gel di grandi dimensioni) ed eseguire fino a quando il fronte del colorante raggiunge la fine del gel. La corsa dura da 3 a 4 ore per un mini-, e da 18 a 24 ore per un gel di grandi dimensioni.

4. Seconda dimensione SDS-PAGE

  1. Preparare uno standard di 10% SDS-gel (ricette 12-15) con una sola corsia di grandi dimensioni per la prima dimensione BN-PAGE corsia, una corsia regolare per il marcatore di peso molecolare, e una corsia regolare per un aliquota del lisato dializzati che ha stato mescolato con tampone campione SDS (ricetta 11) e bollite per 5 min a 95 ° C. Utilizzare distanziatori il cui spessore è stato aumentato da due strati di nastro adesivo per semplificare il caricamento della BN-PAGE fetta gel sul gel SDS.
  2. Rimuovere il BN-PAGE gel nei piatti dall'apparato elettroforesi e sollevare delicatamente alto di una lastra.
  3. Rimuovere il gel di impilamento e tagliare fuori la corsia del BN-PAGE gel contenenti le proteine ​​di interesse.
  4. Posizionare il BN-PAGE fetta gel nel tampone 2x SDS campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Far bollire il BN-PAGE brevemente fetta gel (non più di 20 sec) in un forno a microonde.
  6. Incubare la BN-PAGE fetta gel nel caldo Sample Buffer SDS per altri 15 min a temperatura ambiente.
  7. Caricare il BN-PAGE fetta gel nella grande ben oltre il gel di sovrapposizione del SDS-PAGE gel evitando bolle d'aria, e sovrapporre la fetta con Sample Buffer SDS. Carico marcatore e controllo lisato.
  8. Eseguire l'elettroforesi secondo protocolli standard.

5. Rilevazione di subunità MPC mediante immunoblotting

  1. Per il trasferimento, preparare sei documenti Whatman e una membrana PVDF adattamento alle dimensioni del SDS-gel.
  2. Incubare la membrana PVDF in 100% di metanolo per 30 s e godersi le carte Whatman nel buffer di trasferimento (ricetta 16).
  3. Inserire tre carte Whatman, la membrana PVDF, la SDS-gel (rimuovere stacking gel), e di nuovo tre carte Whatman in una struttura a sandwich in una cella trasferimento semisecco.
  4. Applicare 20 V per 25 min.
  5. Rilevare le proteine ​​secondo i protocolli standard di immunoblotting.

6. Rappresentante Risultati

Vi presentiamo l'analisi del 19S eucariotiche, 20S e 26S proteasomi come esempio per la caratterizzazione dei MPC da 2D BN / SDS-PAGE (Figura 1A). HEK293 cellule sono state lisate con un tampone contenente 0,1% Triton X-100 come un detersivo per distruggere le membrane e solubilizzare complessi di proteina di membrana. Queste lisati sono stati dializzati contro BN-dialisi buffer per eliminare i sali e metaboliti di piccole dimensioni. Poi, PPM erano separati da 4-15% gradiente BN-PAGE seguita da una seconda dimensione SDS-PAGE. Le proteine ​​sono state visualizzate mediante immunoblotting con anticorpi contro la subunità β2 e Mcp21 del proteasoma 20S.

Figura 1
Figura 1. Un approccio bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE utilizzando lisati cellulari. (A) diagramma di flusso di un approccio BN-PAGE/SDS-PAGE 2D da lisati cellulari. (B) schema schematica di un BN-PAGE/SDS-PAGE 2D. Proteine ​​e PPM sono separati in condizioni native da BN-PAGE in una prima dimensione. Per la seconda dimensione, le proteine ​​e / o PPM vengono denaturate dal SDS nella striscia di gel dopo la separazione da BN-PAGE e successivamente sottoposti a SDS-PAGE. Proteine ​​monomeriche migreranno in una causa iperbolico diagonale per il gel gradiente nel primo e un gel lineare nella seconda dimensione. Componenti di una concreta MPC sarà trovato sotto la diagonale, che si trova su una linea verticale.

E 'stato dimostrato che dalla combinazione di prima dimensione BN-e seconda dimensione SDS-PAGE, proteine ​​monomeriche migrare all'interno di un diagonale iperbolica a causa del gradiente di gel nel primo e il gel lineare nella seconda dimensione ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. Figura 1B). I componenti di PPM si trovano sotto questa diagonale. Proteine ​​che rappresentano subunità della stessa MPC può essere trovato in una linea verticale nella seconda dimensione, mentre diversi punti della stessa proteina in una linea orizzontale indicano la presenza della proteina in diversi PPM distinte. La Figura 2 mostra che nel nostro esperimento immunoblotting contro β2 e Mcp21 rivelato la presenza di complessi proteici specifici contenenti tali subunità del proteasoma. Entrambe le proteine ​​erano rilevabili come punti singoli disposti in linea orizzontale, ad indicare che β2 e Mcp21 rappresentano costituenti di diversi PPM distinte. Questi PPM potrebbe essere chiaramente identificato come il proteasoma 26S (20S 19S più tappo), il proteasoma 20S insieme alla subunità regolatrice PA28, e il 20S proteasomi da solo, sulla base della loro dimensione e composizione. Presi insieme, questi resuLTS dimostrare che MPC endogena può essere identificato e caratterizzato da un approccio bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE con lisato cellulare. Questo metodo è applicabile per la determinazione della dimensione, composizione e abbondanza relativa di PPM.

Figura 2
Figura 2. Dell'individuazione di forme diverse del proteasoma eucarioti mediante immunoblotting dopo bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE. Per l'identificazione e l'analisi dei proteasomi eucariotiche, HEK293 cellule sono state lisate con 0.1% Triton X-100. Lisati cellulari sono stati dializzati e successivamente sottoposti a BN-PAGE (4-15%) di PPM separati. In seguito, una seconda dimensione SDS-PAGE (10%) è stato eseguito per la separazione delle sottocomponenti dimensione individuale. Immunoblotting è stata effettuata con anticorpi specifici riconoscendo il Mcp21 e β2 subunità del complesso nucleo 20S, e per la subunità regolatrice PA28.

Tabella I. di reagenti specifici (ordine alfabetico):

Reagente Azienda Commenti
6-aminohexanoic acido
(Ε-aminocaproico acido)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania Questo prodotto chimico è un irritante e deve essere maneggiato con i guanti.
Acrilamide-bisacrylamide soluzione (40%), miscela 32:1 Applichem, Darmstadt, Germania Questa soluzione è neurotossico e deve essere maneggiato con i guanti.
Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny
Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania
Coomassie blu G250 Serva, Heidelberg, Ger-mania Non sostituire altri tipi di Coomassie colorante Coomassie blu come R250 o colloidale Coo-Massie blues.
Digitonina Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania Digitonina è tossico. Dovrebbero indossare guanti protettivi quando si maneggiano i buffer o campioni contenenti questo detersivo.
Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, Germania
Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 è tossico. Dovrebbero indossare guanti protettivi quando si maneggiano tamponi o campioni contenenti questo detergente.

II. Tabella di materiale e attrezzature specifiche:

Attrezzatura Azienda
Membrane di dialisi (peso molecolare di cut-off 10-50 kD) Roth, Karlsruhe, Germania
Gel elettroforesi sistema Per esempio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania
Gradiente mixer Self-made o disponibili in commercio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania
Pompa peristaltica Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Germania
Polivinilidene fluoruro (PVDF), membrana Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Germania
Semisecco trasferimento attrezzature Per esempio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania
Silicon tubing (3 a 5 mm di diametro, 1 m di lunghezza) NeoLab, Heidelberg, Germania

III. Tabella di ricette:

No. Tamponi e soluzioni Contenuto Commenti
1 Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) Na 2 HPO 4 8,1 mMKH 2
PO 4 1.5 mM
NaCl 138 mm
KCl 2,7 mm
Soluzione deve essere pH 7,4, se preparate correttamente.
2 BN-Lysis Buffer Base di buffer
Bis-Tris 20 mM
ε-aminocaproico acido 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8.0 2 mM
Glicerolo 10%

Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C.

Detergente
Digitonina 0,5-1,0%
o Brij 96 0,1 allo 0,5%
o Triton X-100 0,1 allo 0,5%
o Dodecylmaltoside 0,1 allo 0,5%

Inibitori della proteasi e fosfatasi
Aprotinina 10 mcg / mL
Leupeptina 10 mcg / mL
PMSF 1 mM
Fluoruro di sodio 0,5 mM
Sodio orthovanadate 0,5 mM
Il detersivo appropriato deve essere determinato in modo empirico dovrebbe essere lo stesso di quello usato nelle ricette altre tampone di lisi.

Digitonina devono essere aggiunti al momento dell'uso da una soluzione di riserva del 2% dH 2 O (negozio in 5 ml aliquote a -20 ° C).

Proteasi e fosfatasi inibire-ORS deve essere aggiunto immediatamente prima dell'uso.

Dopo l'aggiunta di sodio orthova-nadate, il buffer diventa di colore giallastro.
3 BN-dialisi Buffer Base di buffer
Bis-Tris 20 mM
ε-aminocaproico acido 500 mM
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8.0 2 mM
Glicerolo 10%

Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C.

Detergente
Digitonina 0,3-0,5%
o Triton X-100 0,1%
o Brij 96 0,1%
o Dodecylmaltoside 0,1%

Inibitori della proteasi e fosfatasi
PMSF 1 mM
Sodio orthovanadate 0,5 mM
Il detersivo appropriata deve essere determinata empiricamente e dovrebbe essere lo stesso di quello usato nel buffer di lisi, ma al più basso indicato concentrazioni di.

Detergente deve essere aggiunto al pre-sfogo di aggregazione nella fase di sovrapposizione dei elettroforesi su gel.

Proteasi e fosfatasi inibire-ORS deve essere aggiunto immediatamente prima dell'uso.
4 3x BN-Gel Buffer Bis-Tris 150 mM
ε-aminocaproico acido 200 mM

Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C.
5 4% gel separatore 3x BN-Gel Buffer (ricetta 4) 5,00 ml
Acrilamide / Bisacrylamide 1,50 ml
dH 2 O 8,50 ml
APS, il 10% in DH 2 O 54 microlitri
TEMED 5,4 microlitri
Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione.

Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato.
6 15% gel separatore 3x BN-Gel Buffer (ricetta 4) 5,00 ml
Acrilamide / Bisacrylamide 5,63 ml
Glicerolo 70% 4,38 ml
APS, il 10% in DH 2 O 42 microlitri
TEMED 4,2 microlitri
Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione.

Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato.

La concentrazione di acrilamide-bisacrylamide può anche essere variata, se necessario 10-18%.
7 3,2% Stacking Gel 3x BN-gel Buffer (ricetta 4) 3,00 ml
Acrilamide / Bisacrylamide 0,72 ml
dH 2 O 5,28 ml
APS, il 10% in DH 2 O 120 microlitri
TEMED 12 microlitri
Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione.

Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato.
8 Catodo Buffer Bis-Tris 15 mM
Tricine 50 mM
Coomassie blu G250 0,02%

Preparare 1 litro come uno stock 10x, aggiustare il pH a 7.0 con HCl, e conservare a 4 ° C.
Diluire 1:10 con dH 2 O prima dell'uso.
Non sostituire altri tipi di colorante Coomassie come Coomassie R250 blu o blu Coomassie colloidale.
9 Buffer anodo Bis-Tris 50 mM

Preparare 1 litro come uno stock 10x, aggiustare il pH a 7.0 con HCl, e conservare a 4 ° C.
Diluire 1:10 con dH 2 O prima dell'uso.
10 Marker Mix Aldolasi (158 kD) 10 mg / mL
Catalasi (232 kD) 10 mg / mL
Ferritina (440 e 880 kD) 10 mg / mL
Tireoglobulina (670 kD) 10 mg / mL
BSA (66 e 132 kD) 10 mg / mL
Bis-Tris 20 mM
NaCl 20 mM
Glicerolo 10%

Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C.
Marcatori peso molecolare sono anche disponibili in commercio da diverse fonti, tra cui Invitro generazione o Pharmacia.
11 SDS campione Tampone Tris 12,5 mm
SDS 4%
Glicerolo 20%
Blu di bromofenolo 0,02%

Regolare il pH a 6,8. Per ridurre i ponti disolfuro, aggiungere 9 ml β-mercaptoetanolo.
SDS come polvere e β-mer-captoethanol sono tossici. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa.
12 4x tampone inferiore Tris 1,5 M
SDS 0,4%

Regolare il pH a 8,8.
SDS come polvere è tossico. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa.
13 4x tampone superiore Tris 0,5 M
SDS 0,4%

Regolare il pH a 6,8.
SDS come polvere è tossico. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa.
14 10% gel separatore Acrilamide (30%) 2,0 ml
Inferiore tampone 4x 1,5 ml
dH 2 O 2,454 ml
APS, il 10% in DH 2 O 40 microlitri
TEMED 6 microlitri
Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione.

Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato.
15 4,8% Stacking Gel Acylamide (30%) 320 microlitri
4 volte superiore di buffer 500 microlitri
dH 2 O 1,16 ml
APS, il 10% in DH 2 O 20 l
TEMED 2 microlitri
Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione.

Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato.
16 Semisecco Transfer Buffer Tris 48 mm
Glycine 39 mm
Metanolo 20%
SDS 0,1%

Regolare il volume a 1 litro con dH 2 O. Conservare a temperatura ambiente.
SDS come polvere e metanolo sono tossici. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa.

Discussion

In questo studio, descriviamo l'analisi di PPM da BN-PAGE. Un approccio 2D viene utilizzato al primo PPM separare in condizioni native, e poi ulteriormente suddividere nelle loro componenti singoli da una seconda dimensione SDS-PAGE.

I campioni sono preparati con lisati cellulari. Per la solubilizzazione di PPM molti, un detergente appropriata è indispensabile, che conserva la struttura dei complessi proteici. Qui, usiamo 0,1% Triton X-100. Tuttavia, il detergente ottimale e la sua concentrazione adatta devono essere determinate empiricamente per ogni MPC. In caso di Triton X-100, per esempio, è stato riportato che le concentrazioni di detergenti a basso permettono l'identificazione di una forma dimerica della F 1 F 0-ATPasi complesso (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Superiore Triton X-100 concentrazioni, tuttavia, portano alla dissociazione del dimero e ad un corrispondente aumento del monomerico F 1 F 0-ATPasi complesso. Ciò è in linea con uno dei nostri studi precedenti, sono stati dimostriamo che il polivalente cellule T complesso recettore (TCR) viene conservato quando estratto con basse concentrazioni di Brij 96, mentre l'uso di una maggiore concentrazione o di un altro detergente chiamato digitonina risultati in l'estrazione di monomerico TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Detergenti comunemente usati che possono essere testati includono digitonina (da 0,5 a 1%), Triton X-100 (da 0,1 a 0,5%), Brij 96 (da 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 allo 0,5%). Questi reagenti sono detergenti non ionici, che tendono ad essere migliori per la stabilità MPC. Essere consapevoli del fatto che il contatto con SDS e altri detergenti aggressivi deve essere evitato (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004).

Dialisi del lisati è necessario per realizzare la separazione MPC in una BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.), (Heiss, Junkes et al 2005).. Sembra che la regolazione della concentrazione di sale o la rimozione delle impurità a basso peso molecolare è di fondamentale importanza per alta risoluzione. È interessante notare che anche le preparazioni di membrana e PPM, che sono stati immunopurified e poi eluito dalla anticorpi, sono adatti per BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). In entrambi i casi, i campioni non devono essere dializzati per BN-PAGE la separazione, se lisi membrana o eluizione viene effettuata in BN-lisi buffer.

Per la separazione delle proteine ​​da BN-PAGE, il colorante Coomassie blu è necessario, che si lega alle proteine ​​unspecifically e li copre con cariche negative. In tal modo, Coomassie blu consente la mobilità elettroforetica delle proteine ​​verso il catodo a pH neutro (Schägger e von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Inoltre, Coomassie blu impedisce l'aggregazione delle proteine ​​nel gel di impilamento durante l'elettroforesi. Per BN-PAGE, Coomassie G250 deve essere usato al posto di Coomassie R250 blu o blu Coomassie colloidale.

Prima di eseguire una BN-gel, è necessario garantire che la percentuale di gel si adatta alla dimensione prevista del MPC di interesse. Prefabbricati BN-gel con pendenze diverse e tamponi adatti sono disponibili in commercio da Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Ma BN-gel può anche essere preparata usando un gradiente mixer insieme con una pompa persistaltic. Per garantire un gradiente intatto, il liquido deve fluire costantemente durante il getto e le bolle dovrebbero essere evitati. Si consiglia il caricamento di diverse diluizioni del campione sul gel perché sovraccarico può portare alla precipitazione delle proteine ​​durante il processo di elettroforesi. Inoltre, BN-gel dovrebbe essere eseguito a 4 ° C per evitare la degradazione delle proteine ​​e di mantenere intatto il PPM.

Dopo BN-PAGE, la visualizzazione di MPC può essere raggiunto con la colorazione Coomassie blu brillante, colorazione argento o immunoblotting. Bande proteiche visualizzate mediante colorazione Coomassie o argento sono adatti per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). In caso di immunoblotting, le condizioni di trasferimento ottimale per i PPM di interesse devono essere determinati empiricamente. Essere consapevoli del fatto che Coomassie blu è anche trasferito durante assorbente di una BN-gel. Pertanto, il gel sarà incolore dopo il trasferimento di successo, mentre la membrana in grado di esercitare un colore blu. Inoltre, è importante ricordare che non tutti gli anticorpi primari, che lavora per il rilevamento dopo SDS-PAGE, è applicabile a immunoblotting su BN-PAGE. Può succedere che gli anticorpi non riconoscono il MPC di interesse perché la loro epitopo è nascosto nella conformazione nativa delle proteine. Per superare questo problema, è possibile denaturare le proteine ​​all'interno della BN-gel prima del trasferimento facendo bollire il gel a breve nella tampone 1x campione SDS.

Nel nostro esempio, noi non sottoporre il BN-gel direttamente al rilevamento di bande proteiche. Invece, abbiamo ulteriormente diviso il BN-PAGE-lisato separati da un secondo dimensisu SDS-PAGE. Nella seconda dimensione SDS-gel, proteine ​​monomeriche migrare all'interno di un diagonale iperbolica a causa del gradiente di gel nel primo e il gel lineare nella seconda dimensione (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Questo permette la facile identificazione dei PPM, dal momento che sono localizzati sotto questa diagonale iperbolica. Sottocomponenti di un distinto MPC sono separati in una linea verticale nella seconda dimensione SDS-PAGE. I componenti che rientrano nella composizione di PPM dinstinct diverse possono essere identificati su una linea orizzontale a seconda delle dimensioni del MPC. Tuttavia, è da considerare che gli spot di proteine ​​diverse che appare in una linea verticale potrebbe anche far parte di complessi separati che migrano nella stessa posizione in BN-PAGE. La prova finale che sono presenti nello stesso MPC può essere ottenuta con un anticorpo saggio basato su gel shift. In questo saggio, lisato cellulare viene incubato con un anticorpo contro una proteina rappresentata da uno dei luoghi individuati prima BN-PAGE. Ciò si traduce in uno spostamento di tutti i PPM che contengono questa proteina verso una massa molecolare maggiore nella prima dimensione. Altre proteine ​​che sono anche una parte di questi PPM subirà questo complesso specifico turno e sono quindi facili da identificare nella seconda dimensione SDS-gel.

Non solo la composizione del MPC può essere analizzato BN-PAGE, ma anche la determinazione della loro stechiometria è possibile (e Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. A tal fine, un test Namos (nativo a base di anticorpi mobilità-shift test) può essere eseguita. Come nel anticorpi saggio basato su gel di turno, il lisati cellulari vengono incubati con subunità monoclonali specifici anticorpi. Questo porta a l'induzione di immunoshifts elettroforetici nel BN-gel, che consentono l'inferenza dalla misura dello spostamento sulla stechiometria di PPM

In conlusion, BN-PAGE è adatto per l'identificazione di PPM e la determinazione della loro dimensione, composizione, così come l'abbondanza relativa. Eseguito come un test Namos, offre anche la possibilità di determinare la stechiometria di un certo MPC. Data la sua applicabilità generale, questa tecnica è uno strumento molto utile per la caratterizzazione di PPM (Dekker, Müller et al 1996.) (Wittig e Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.) (Wittig e Schägger 2009) .

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Ringraziamo Michael Reth, Hermann Schägger, e Margherita Camacho-Carvajal al sostegno scientifico. Questo lavoro è stato finanziato dalla FORSYS dal Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF), dal BIOS dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), e sostenuta in parte dal Iniziativa eccellenza dei governi tedesco e Stato (GSC-4, Spemann Graduate School ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

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