蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN - PAGE)分析,从细胞裂解液多蛋白复合物

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Summary

在这个视频中,我们描述的多蛋白复合物(储值卡)蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN - PAGE)的表征。在第一个层面,透析细胞裂解液的BN - PAGE分离,以确定个人的多用途储值卡。在第二维SDS - PAGE电泳,利益的储值卡是进一步细分免疫印迹分析其成分。

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Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

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Abstract

多蛋白复合物(储值卡)起到至关重要的作用,在与其他蛋白质的功能或监管的复合物(贝,格兰泽等 ,2003)发现,因为大多数的蛋白质可以在细胞信号。因此,研究蛋白质相互作用网络需要细致刻画的多用途储值卡获得的蛋白质功能和调节的综合理解。对于识别和分析,储值卡必须分开天然条件下。在这个视频中,我们描述的多用途储值卡的蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN - PAGE)的分析。 BN - PAGE是一种技术,使具有较高的分辨率比凝胶过滤或蔗糖密度离心提供的天然构象的储值卡分离,因此可用来确定货币政策委员会的规模,组成和相对丰度(Schägger和冯Jagow 1991年) (Cramer Schägger,1994年)。通过这种方法,根据流体力学尺寸和形状在聚丙烯酰胺基质蛋白分开。在这里,我们展示的多用途储值卡的总细胞裂解液的分析,指出裂解液透析是关键的一步,使这些生物样本的BN - PAGE适用。使用第一个维度BN和第二维的SDS - PAGE的组合,我们的BN - PAGE分离储值卡可以进一步细分成各成分的经SDS - PAGE。凝胶分离后的MPC组件的可视化是执行标准的免疫印迹。作为货币政策委员会的BN - PAGE分析的例子,我们选择了良好的特点真核生物19S,20S和26S蛋白酶体。

Protocol

**本视频协议是基于相关出版物1:蓝色的原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN - PAGE)多蛋白复合物的鉴定和分析。 Mahima斯瓦米,加布里埃尔M. Siegers,苏珊娜Minguet,贝恩德Wollscheid,和沃尔夫冈西澳Schamel。 STKE 2006年“科学”(345):PL2,7月25日,2006年,[作者:10.1126/stke.3892006pl4] 请点击这里查看本出版物

1。透析细胞裂解液的制备

  1. 10 × 10 6细胞的收获和沉淀,离心350克5分钟,4 ° C 。
  2. 1 mL冰冷的PBS(配方1)液洗细胞沉淀三次,离心分离,在步骤1.1。
  3. 悬浮颗粒和250μL冰冷的BN -裂解液(配方2)在冰上孵育15分钟。
  4. 13,000克离心15分钟4 ° C,移除不溶物。
  5. 融化在第1.5 ml离心管使用巴斯德吸管加热大口径方孔,然后置于冰上管降温至4 ° C
  6. 步骤1.4转移到冷冻管与孔在第上清。
  7. 放置一个与开管的顶部,接近上限钳透析膜(分子量10 kD的切断),并切断多余的透析膜伸出。
  8. 一边仔细地用封口膜密封帽。
  9. 反转管和离心机上下颠倒,持续10秒的最低速度,在50 mL锥形管在细胞培养离心机可能在4 ° C。卸下离心机使用镊子,以避免转向管右侧的倒管。
  10. 准备一个100 mL烧杯中,用冷水BN透析液(配方3)和搅拌板。使用至少10毫升的BN透析每100μL样品缓冲。
  11. 贴上管倒在烧杯内的磁带,使用弯曲的巴斯德吸管帽下方气泡从孔中删除。
  12. 放在一块磁铁搅拌器顶部的烧杯中,开关上的搅拌器和放置6小时,或在寒冷的房间里过夜。偶尔检查,以确保搅拌创建气泡在透析膜。
  13. 收集在一个新的冷冻离心管透析的细胞裂解液。

2。浇注国民凝胶

  1. 梯度凝胶浇注是在室温下进行的梯度混合器。因为聚丙烯酰胺是高度的神经毒性,必须戴手套。避免接触任何与SDS。
  2. 广场上的轰动板梯度混合器,将它附加到了一块软管。使用的阀门关闭通道,并密切与管钳。到“高”缸油管相连,放置一个磁力搅拌器15%。
  3. 主题成peristalitic泵软管,并附加一个注射器针头结束。然后,将针凝胶仪器的两个玻璃板之间。
  4. 准备4%(配方5)和15%(配方6)分离胶解决方案,加入APS和TEMED前立即使用。合并后的卷应该是平等的分离胶量。
  5. 倒入梯度混合器相应的气瓶(4%到“低”到“高”缸和15%),这些凝胶的解决方案。
  6. 阀打开了通道连接在左缸用拇指按两个凝胶水库内的气泡和力量。
  7. 磁力搅拌器上的开关,取出钳,peristalitic泵切换到5毫升每分钟。允许凝胶玻璃板之间缓缓流。确保针以上的液体总是。
  8. 允许所有的液体进入凝胶的仪器,然后轻轻覆盖用异丙醇。允许凝胶聚合至少30分钟在室温。
  9. 清洁浇筑设备立即与卫生署2 O(不使用清洁剂)。
  10. 删除的异丙醇,洗净与卫生署2,删除用Whatman纸DH 2 O。
  11. 准备了3.2%浓缩胶(配方),加入APS和TEMED前立即使用。
  12. 倒入浓缩胶和分离胶上介绍玻璃板之间的梳子,避免气泡。浓缩胶聚合后,凝胶降温至4 ° C。
  13. 样品装载前,立即取出梳子慢慢地,拉出来凝胶平面的角度。这使得空气进入的口袋迅速,从而提高了井的质量。

3。 BN - PAGE分离细胞裂解液透析

  1. 1至40μL透析裂解液和10至20μL标记组合(配方10)负载在干井4 ° C。冷阴极的缓冲液(配方8),覆盖在每口井的样本。
  2. 内腔填充冷猫HODE缓冲区,并用冷阳极缓冲外/下腔(配方)。
  3. 应用100伏到minigel或150V一个大的凝胶,直到样品进入分离胶。运行凝胶在4 ° C。
  4. 增加电压至180 V(minigel)或400V(大胶)和运行,直到染料前沿到达凝胶年底。运行需要3至4小时,为迷你,和18至24小时为一个大的凝胶。

4。第二维的SDS - PAGE

  1. BN - PAGE的第一个维度里,一个定期为分子量标记线,并已透析裂解等分一个经常弄一个单一的大巷准备一个标准的10%SDS凝胶(食谱12-15) SDS样品缓冲液(配方11)混合,煮沸5分钟,在95 ° C使用垫片的厚度增加是由两层透明胶带,以简化的SDS凝胶上装载的BN - PAGE凝胶片。
  2. 删除的BN - PAGE凝胶电泳仪板,轻轻地撬起来一个板块。
  3. 取出浓缩胶和切出车道的BN - PAGE凝胶含有的蛋白质利益。
  4. 将2X SDS样品缓冲液孵育的BN - PAGE凝胶片在室温为10分钟。
  5. 煮的BN - PAGE凝胶片在微波炉中简要(不超过20秒)。
  6. 再在室温下15分钟热SDS样品缓冲液中孵育的BN - PAGE凝胶片。
  7. 负载的BN - PAGE凝胶片在大井,在浓缩胶的SDS - PAGE凝胶避免气泡,并覆盖SDS样品缓冲液中分得一杯羹。负载标记和裂解控制。
  8. 根据标准协议执行电泳。

5。 MPC的亚基免疫印迹检测

  1. 转让,准备六的Whatman论文和PVDF膜装修SDS凝胶的大小。
  2. 在30秒的100%甲醇孵育PVDF膜和转移的缓冲液(配方16)中浸泡的Whatman论文。
  3. 将三个文件的Whatman,聚偏氟乙烯膜,SDS凝胶(删除浓缩胶),并再而三的Whatman在成半干转移细胞的结构类似于三明治的论文。
  4. 适用于20 V 25分钟。
  5. 检测蛋白质按标准免疫协议。

6。代表性的成果

我们目前的货币政策委员会表征真核生物19S,20S和26S蛋白酶体作为一个例子分析2D BN / SDS - PAGE电泳(图1A)。 HEK293细胞裂解用缓冲液含0.1%的Triton X - 100的洗涤剂破坏的膜和溶解膜蛋白复合物。这些细胞裂解液对BN透析缓冲液透析去除盐和小代谢产物。然后由第二维的SDS - PAGE梯度4-15%的BN - PAGE分离,储值卡。蛋白与抗β2亚基和20S蛋白酶体Mcp21抗体免疫印迹可视化。

图1
图1。一个两维BN-PAGE/SDS-PAGE的方法,用细胞裂解液(一)从细胞裂解液的2D BN-PAGE/SDS-PAGE方法的流程图。 (二)一个二维BN-PAGE/SDS-PAGE结构的计划。天然条件下在第一维BN - PAGE分离蛋白质和储值卡。对于第二个层面,蛋白质和/或储值卡,经SDS变性凝胶地带的BN - PAGE分离后,随后的SDS - PAGE。单体的蛋白质会在双曲对角线由于在第一梯度凝胶电泳和第二维线性凝胶迁移。一个具体的货币政策委员会的组件将被发现的对角线,低于位于一条垂直线。

它已被证明,第一维BN和第二维的SDS - PAGE的组合,在双曲对角线由于梯度凝胶的单体蛋白质在第一和第二个维度(线性凝胶迁移(卡马乔瓦哈尔 Wollscheid等等2004);图1B)。多用途储值卡的组件都位于低于此对角线。代表相同的货币政策委员会亚基的蛋白质,可以发现一个在第二个维度垂直线,而相同的蛋白质在一个水平线上的几个点表明,在几个不同的储值卡中的蛋白质的存在。图2显示,在我们的实验β2和Mcp21免疫印迹显示特定的蛋白质复合物含有这些蛋白酶体亚基的存在。这两种蛋白质检测安排在一个水平线上的个别景点,这表明,β2和Mcp21代表选民的几个不同的储值卡。这些储值卡可以清楚确定的26S蛋白酶体(20S加19S第),20S蛋白酶体调节亚基PA28一起,20S蛋白酶体单独的规模和组成的基础上,。两者合计,这些热塑LTS表明,内源性的多用途储值卡可以由一个二维BN-PAGE/SDS-PAGE使用细胞裂解液的方法识别和特点。此方法适用于多用途储值卡的大小,组成和相对丰度的决心。

图2
图2。免疫后两维BN-PAGE/SDS-PAGE真核蛋白酶体识别和分析真核蛋白酶。不同形式的检测,0.1%的Triton X - 100的HEK293细胞裂解。细胞裂解液,透析,随后遭受的BN - PAGE(4-15%),单独的储值卡。第二维的SDS - PAGE(10%)之后,运行规模的个别子的分离。免疫是承认Mcp21和β2亚基20S核心复杂和调节亚基PA28的特异性抗体。

一表的特定试剂(按字母顺序排列):

试剂 公司 评论
6 - 氨基己酸
(ε-氨基己酸)
Sigma - Aldrich公司,德国Taufkirchen的, 这种化学物质是一种刺激性,应带手套处理。
丙烯酰胺,双丙烯酰胺溶液(40%),混合32:1 Applichem,德国达姆施塔特这个解决方案是神经毒性,应带手套处理。
双三罗斯,卡尔斯鲁厄,Germa - NY
Brij 96 Sigma - Aldrich公司,德国Taufkirchen的,
考马斯亮蓝G250 赛瓦,海德堡,德国不要代替其他类型的考马斯如考马斯亮蓝R250或胶体COO - Massie的蓝色染料。
毛地黄皂苷 Sigma - Aldrich公司,德国Taufkirchen的, 毛地黄皂苷是有毒的。处理缓冲区或样品含有这种威慑的绅士时,必须戴上手套。
Dodecylmaltoside Applichem,德国达姆施塔特
TRITON X - 100 罗斯,卡尔斯鲁厄,Germa - NY TRITON X - 100是有毒的。处理缓冲区或样品含有这种洗涤剂时,必须戴上手套。

二。具体的材料和设备表:

设备 公司
透析膜(截止10日至50 kD的分子量) 罗斯,卡尔斯鲁厄,德国
凝胶电泳系统例如,来自Bio - Rad,德国慕尼黑
梯度混合器自制或商用Bio - Rad公司,德国慕尼黑
蠕动泵 Amersham公司Pharmacia公司生物技术,德国弗赖堡
聚偏氟乙烯(PVDF)膜 Millipore公司,位于Eschborn,德国的Immobilon - P
半干转移设备例如,来自Bio - Rad,德国慕尼黑
硅管(直径3至5毫米,长1米) NeoLab,德国海德堡

三。配方的表:

缓冲器和解决方案 内容 评论
1 磷酸盐缓冲液(PBS) NA 2 HPO 4 8.1 mMKH 2
PO 4 1.5毫米
氯化钠138毫米
氯化钾2.7毫米
如果前比较正确的解决方案应该是pH值7.4。
2 BN -裂解液 相应的缓冲区
二 - 三20毫米
ε-氨基己酸500毫米
氯化钠20毫米
EDTA,pH值8.0 2毫米
甘油10%

用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。

洗涤剂
毛地黄皂苷0.5至1.0%
或Brij 96 0.1至0.5%
或Triton X - 100 0.1〜0.5%
或Dodecylmaltoside 0.1%至0.5%

蛋白酶和磷酸酶抑制剂
抑肽酶10微克/毫升
亮肽素10微克/毫升
PMSF 1毫米
氟化钠0.5毫米
钒酸钠0.5毫米
适当的清洁剂,必须凭经验确定,并应在其他裂解液配方中使用的相同。

毛地黄皂苷必须加上之前从DH 2 O(存储在5毫升分装在-20 ° C)的2%原液使用。

使用前应加入蛋白酶和phophatase抑制,口服补液盐。

当钠orthova nadate此外,该缓冲区会变得颜色偏黄。
3 BN透析缓冲器 相应的缓冲区
二 - 三20毫米
ε-氨基己酸500毫米
氯化钠20毫米
EDTA,pH值8.0 2毫米
甘油10%

用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。

洗涤剂
毛地黄皂苷0.3%至0.5%
或Triton X - 100 0.1%
或Brij 96 0.1%
或Dodecylmaltoside 0.1%

蛋白酶和磷酸酶抑制剂
PMSF 1毫米
钒酸钠0.5毫米
适当的清洁剂,必须凭经验确定,并应在其他裂解缓冲液中使用的相同,但表示在低浓度的。

洗涤剂必须添加到预泄聚集在凝胶电泳的堆叠步骤。

使用前应加入蛋白酶和phophatase抑制,口服补液盐。
4 3倍的BN -胶缓冲液双 - 三150毫米
ε-氨基己酸200毫米

用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。
5 4%,分离胶 3倍的BN -胶缓冲液(配方4)5.00毫升
丙烯酰胺/双丙烯酰胺1.50毫升
生署2 O 8.50毫升
黄芪多糖,在卫生署2 O 54μL的10%
TEMED 5.4微升
加入APS和TEMED immedia - tely浇筑前凝胶,这些试剂促进聚合。

这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。
6 15%的分离胶 3倍的BN -胶缓冲液(配方4)5.00毫升
丙烯酰胺/双丙烯酰胺5.63毫升
甘油70%,4.38毫升
黄芪多糖,在卫生署2 O 42μL的10%
TEMED 4.2微升
加入APS和TEMED immedia - tely浇筑前凝胶,这些试剂促进聚合。

这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。

丙烯酰胺,双丙烯酰胺的浓度也可以多种多样,从10%至18%的必要。
7 3.2%的浓缩胶 3倍的BN -胶缓冲液(配方4)3.00毫升
丙烯酰胺/双丙烯酰胺0.72毫升
生署2 O 5.28毫升
黄芪多糖,在卫生署2 120μL,10%
TEMED 12微升
加入APS和TEMED immedia - tely浇筑前凝胶,这些试剂促进聚合。

这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。
8 阴极缓冲二 - 三15毫米
甘氨酸50毫米
考马斯亮蓝G250 0.02%

准备1公升为10倍的股票,调整pH至7.0,用HCl,并储存在4 ° C。
使用前,应与卫生署2稀释的1:10。
不要代替其他类型考马斯染料,如考马斯亮蓝R250或胶体考​​马斯亮蓝调。
9 阳极缓冲二 - 三50毫米

准备1公升为10倍的股票,调整pH至7.0,用HCl,并储存在4 ° C。
使用前,应与卫生署2稀释的1:10。
10 标记混合醛缩酶(158 KD)10毫克/毫升
过氧化氢酶(232 KD)10毫克/毫升
铁蛋白(440和880 KD)10毫克/毫升
甲状腺球蛋白(670 KD)10毫克/毫升
BSA(66和132 KD)10毫克/毫升
二 - 三20毫米
氯化钠20毫米
甘油10%

用HCl调节pH至7.0。保存在4 ° C。
分子量标记也从几个来源,其中包括的体外根或法玛西亚市售。
11 SDS样品缓冲液三12.5毫米
SDS的4%
甘油20%
溴酚蓝0.02%

调节pH值至6.8。为了减少二硫键,加9毫升β-巯基乙醇。
作为一个粉和β- MER - captoethanol SDS是有毒的。因此,使用手套和引擎盖下工作。
12 4X降低缓冲区三1.5米
SDS的0.4%

调节pH值至8.8。
SDS的粉末是有毒的。因此,使用手套和引擎盖下工作。
13 4X上层缓冲区三0.5 M
SDS的0.4%

调节pH值至6.8。
SDS的粉末是有毒的。因此,使用手套和引擎盖下工作。
14 10%分离胶丙烯酰胺(30%)2.0毫升
4X较低的缓冲液1.5毫升
生署2 O 2.454毫升
黄芪多糖,在卫生署2 O 40μL的10 %
TEMED 6微升
加入APS和TEMED immedia - tely浇筑前凝胶,这些试剂促进聚合。

这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。
15 4.8%的浓缩胶酰胺(30%)320μL,
4X上层缓冲液500μL
生署2 O 1.16毫升
APS的,卫生署2的10%:20 μL
TEMED 2微升
加入APS和TEMED immedia - tely浇筑前凝胶,这些试剂促进聚合。

这食谱足以投出30毫升的凝胶。调整卷的数量和大小的凝胶被浇。
16 半干转移缓冲器三48毫米
甘氨酸39毫米
甲醇20%
SDS的0.1%

音量调整到1升,与DH 2 O在室温下储存。
粉末和甲醇SDS是有毒的。因此,使用手套和引擎盖下工作。

Discussion

在这项研究中,我们描述的多用途储值卡的BN - PAGE分析。二维的方法是使用天然条件下的第一次单独的储值卡,然后进一步细分到其各个组成部分,由第二维的SDS - PAGE。

样品制备细胞裂解液。对于许多的多用途储值卡的增溶,适当的清洁剂是必要的,保留的蛋白质复合物的结构。在这里,我们使用0.1%的Triton X - 100的。然而,最佳的清洁剂和适宜浓度必须确定每MPC经验。的Triton X - 100的情况下,例如,它已经报道,洗涤剂浓度低允许确定一个二聚体形式的F 1 F 0 - ATP酶复合物(阿诺德, 普发等 ,1998 )。高等教育TRITON X - 100的浓度,然而,导致二聚体解离的单体 F 1 F 0 - ATP酶复合体的相应增加。这与我们以前的研究之一,我们表明,多价,T细胞受体复合物(TCR)的提取与Brij 96的低浓度时保留,而浓度较高,或另一种洗涤剂的使用所谓的毛地黄皂苷结果提取单体的TCR(Schamel,Arechaga 等,2005)。常用的洗涤剂,可以测试包括毛地黄皂苷(0.5%至1%),TRITON X - 100(0.1至0.5%),Brij 96(0.1%至0.5%),或dodecylmaltoside(0.1%至0.5%)。这些试剂均为非离子型洗涤剂,这往往是最适合MPC稳定。请注意,应避免接触,与SDS和其他强洗涤剂(卡马乔的瓦哈尔,Wollscheid等,2004)

透析需要的细胞裂解液,以实现货币政策委员会在BN -凝胶分离(卡马乔瓦哈尔,Wollscheid 等2004);(海斯,Junkes 2005)。看来,盐的浓度或去除低分子量杂质的调整是高分辨率的关键。值得注意的是,膜制剂和储值卡,已immunopurified后来就从抗体洗脱,适合BN - PAGE(斯瓦米,Siegers 等,2006)。在这两种情况下,样品没有要的BN - PAGE分离,如果膜溶解或洗脱的BN -裂解液进行透析。

BN - PAGE对蛋白质的分离,染料考马斯亮蓝需要,结合unspecifically蛋白质和覆盖带负电荷。从而,考马斯蓝可在中性pH(Schägger和1991年冯Jagow)的蛋白质对阴极电泳迁移;(Cramer等Schägger,1994年)。此外,考马斯蓝阻止蛋白质聚集在电泳过程中的浓缩胶。 BN - PAGE,考马斯亮蓝G250考马斯亮蓝R250或胶体考​​马斯亮蓝调,而不是要使用。

在运行BN - 凝胶之前,它是必要的,以确保适合凝胶的百分比利益MPC的预期大小。预制与不同梯度和适当的缓冲区是自Invitrogen(NativePAGE NOVEX双三凝胶体系)市售的BN -凝胶。但英国国民凝胶也可以使用与persistaltic泵的梯度混合器准备。为了保证一个完整的渐变,液体应在浇筑,并应避免气泡流不断。我们建议加载到不同的凝胶样品稀释,因为超载可能导致在电泳过程中蛋白质沉淀。此外,应运行的BN -凝胶,在4 ° C到防止蛋白质的降解,并保持储值卡完好。

BN - PAGE,储值卡的可视化后,可以通过考马斯亮蓝染色,银染或免疫。考马斯亮或银染色可视化蛋白条带,适合作进一步的分析,通过质谱(卡马乔的瓦哈尔,Wollscheid等, 2004)。在免疫的情况下,感兴趣的多用途储值卡的最佳传输条件要凭经验确定。要知道,考马斯蓝也是在一个BN - 凝胶印迹转移。因此,凝胶将无色的成功转让后,而膜将对蓝色。此外,重要的是要提,不是每一个主要的抗体,用于SDS - PAGE后检测工作,是适用于根据BN - PAGE免疫印迹。它可以发生抗体不承认利益MPC的,因为他们的抗原表位是隐藏的蛋白质天然构象。为了克服这个问题,很可能在转让之前,由沸腾不久在1X SDS样品缓冲液凝胶BN - 凝胶内的蛋白质变性。

在我们的例子中,我们并没有受到直接的BN - 凝胶检测蛋白条带。相反,我们进一步除以第二dimensi BN - PAGE分离裂解在SDS - PAGE。在第二维SDS凝胶,单体蛋白在双曲对角线由于在第一和第二个维度(卡马乔的瓦哈尔,Wollscheid 等,2004)的线性凝胶梯度凝胶迁移。这使得易于识别的储值卡,因为它们是低于这个双曲线​​对角线本地化。子组件的一个独特的货币政策委员会在第二维的SDS - PAGE垂直线分开。组件的几个dinstinct储值卡的选民可以在一个水平线上,根据MPC的大小确定。但是,它必须考虑到多个蛋白斑点出现在一个垂直线,也可以单独的复合物,迁移在同一位置的BN - PAGE的一部分。最后证明,他们是在相同的货币政策委员会目前可以通过抗体为基础的凝胶迁移实验。在这个实验中,细胞裂解液是一种抗体孵育,反对由一个确定的点之前的BN - PAGE表示的一种蛋白质。这样的结果在所有的多用途储值卡包含对​​这种蛋白的分子质量较高的,在第一维转变。其他蛋白质,这些储值卡的一部分,将经过这个复杂的具体的转变,因此容易识别,在第二维SDS凝胶。

组成的多用途储值卡不仅可以BN - PAGE分析,但也可能确定其化学计量(2000年Schamel和Reth)(Schamel 2001年),(斯瓦米,Minguet等2007 )。为此,NAMOS法(以抗体为基础的的移动移法)可以执行。在抗体为基础的的凝胶迁移实验,细胞裂解液培养单克隆亚基特异性抗体。这将导致在诱导国民凝胶电泳immunoshifts,允许从推理移位的程度,对多用途储值卡的化学计量

conlusion,BN - PAGE是适合多用途储值卡的识别和他们的规模,构成,以及相对丰度的决心。作为NAMOS检测执行的,它也提供了可能性,确定一定MPC的化学计量。由于其普遍适用性,这项技术是一个非常有用的工具为表征(德克尔,Muller 1996年)的多用途储值卡;(2008年维蒂希和Schagger);(瓦格纳,Rehling等2009);(2009年维蒂希和Schägger) 。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢迈克尔Reth,Schägger赫尔曼和玛格丽塔卡马乔的瓦哈尔科学支持。这项工作是由FORSYS从Bundesministerium附耳教化和Forschung(BMBF)的资助,由德意志研究联合会(DFG)的BIOSS,并在部分支持由德国联邦和各州政府的卓越倡议(GSC - 4,研究生院Spemann )。

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  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

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