إعداد شرائح الحصين الحادة من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك وامراض الشيخوخة خلال اميلويد

Published 3/23/2011
30 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience
 

Summary

توضح هذه المقالة الإجراءات اللازمة لإعداد شرائح الحصين من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك الدماغ المرتبطة بالشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر الاعصاب ، مثل مرض الزهايمر.

Cite this Article

Copy Citation

Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330, doi:10.3791/2330 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إعداد شريحة القوارض الحصين وربما كان الأكثر استخداما على نطاق واسع أداة لتحقيق وظيفة متشابك الثدييات واللدونة. ويمكن استخراج الحصين بسرعة وبسهولة من الجرذان والفئران وشرائح تبقى قابلة للحياة لعدة ساعات في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي. وعلاوة على ذلك ، يتم تطبيقها بسهولة electrophysisologic التقنيات الأساسية للتحقيق في وظيفة متشابك في قرن آمون شرائح وقدمت بعض من أفضل المؤشرات الحيوية للإدراكيا. شريحة الحصين فهو يحظى بشعبية خاصة لدراسة آليات اللدونة متشابك المشاركة في التعلم والذاكرة. وكثيرا ما تستخدم التغييرات في تحريض بعيدة المدى والاكتئاب (LTP و LTD) من فعالية متشابك في قرن آمون شرائح (أو نقص منه) لوصف النمط الظاهري العصبية للحيوانات معرفيا ، ضعف و / أو لتقييم آلية عمل nootropic المركبات. توضح هذه المقالة الإجراءات التي نستخدمها لإعداد شرائح الحصين من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك المرتبطة بالشيخوخة الدماغ ومرض الزهايمر (ميلادي) 1-3. ويمكن استخدام الجرذان والفئران الذين تتراوح أعمارهم بين نموذج ميلادي يقدم مجموعة فريدة من التحديات التي تواجه الباحثين الذين اعتادوا على استخدام الفئران الأصغر سنا و / أو الفئران في أبحاثهم. الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الجماجم وسمكا والنسيج الضام من اشد الأصغر الجرذان والفئران ، والتي يمكن تأخير استخراج الدماغ و / أو التشريح وبالتالي ينفي أو المبالغة الحقيقية العمر الاختلافات في وظيفة متشابك واللدونة. أمراض الشيخوخة واميلويد قد يؤدي الى تفاقم الضرر أيضا الحصين لحقت به خلال إجراء تشريح ، مما يعقد مجددا وجود أي استنتاجات المستخلصة من تقييم فيزيولوجي. هنا ، نحن مناقشة الخطوات التي اتخذت خلال إجراء تشريح للحد من هذه المشاكل. وتقدم أمثلة من الردود متشابك المكتسبة في "صحية" و "غير صحية" شرائح من الجرذان والفئران ، وكذلك ممثل التجارب اللدونة متشابك. وتناقش أيضا التأثير المحتمل للعوامل المنهجية الأخرى على وظيفة متشابك في هذه النماذج الحيوانية (مثل مكونات الحل تسجيل والمعلمات التحفيز). وينبغي في حين أن التركيز في هذه المقالة على استخدام الجرذان والفئران المعدلة وراثيا العمر ، علم وظائف الأعضاء المبتدئين لشريحة تجد ما يكفي من التفاصيل هنا للبدء في الدراسات الخاصة بها ، وذلك باستخدام مجموعة متنوعة من النماذج القوارض.

Protocol

1. إعداد الجليد الباردة المؤكسد السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF)

  1. إعداد 2 لتر من "كا 2 + خالية" ACSF. في دورق مخروطي 2L ، إضافة ما يقرب من 1.5 لتر من معقم أو مزدوجة المقطر 2 H - O ، والبدء في التحريك بقوة على طبق من ضجة. إضافة المكونات التالية ACSF (مم) : 124 كلوريد الصوديوم (2) ، بوكل ، 1.25 KH 2 PO 4 ، 2 MgSO 4 و 26 NaHCO 3 ، و 10 الدكستروز (انظر الجدول 1). جلب لحجم 2 لتر مع المقطر O. 2 H
  2. استخدام عوامات ماء وأنابيب موصولة إلى O 95 ٪ 05/02 ٪ خزان الهواء CO 2 ، ACSF الأوكسجين بقوة لحوالي 20-30 دقيقة. فحص درجة الحموضة ، وإذا لزم الأمر ، والتكيف مع 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.
  3. صب 750 مل من الاوكسيجين كا 2 + خالية ACSF في دورق مخروطي منفصل ، مع تغطية افتتاح parafilm ، ونقل إلى ultrafreezer (-80 درجة مئوية) لمدة 20-30 دقيقة. وسيتم استخدام هذه الوسائط لتشريح الدماغ وشرائح الحصين الحادة *. إضافة CaCl 2 مم 2 إلى حجم 1.25 لتر المتبقية من ACSF # ، يقلب جيدا ، واستئناف الأوكسجين مع 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2. وسيتم استخدام هذه الوسائط لتخزين شرائح الدماغ بعد التشريح ، وشرائح perfusing خلال التسجيلات الكهربية.
    * الثلج الباردة كا 2 + يستخدم وسائل الاعلام الحرة لإبطاء عملية التمثيل الغذائي وتقليل كا 2 + التي تعتمد على excitotoxicity أثناء تشريح.
    ويمكن للتغيرات في الكالسيوم # 2 + التقلبات خلال الشيخوخة وميلادي يكون لها تأثير كبير على تحريض كا 2 + التي تعتمد على اللدونة متشابك 4-9. قد تقارير متضاربة عن الاختلافات في سن المحدودة يمكن أن تعزى جزئيا إلى استخدام مختلف ACSF كا 2 + : + نسب Mg2 خلال تسجيلات شريحة (انظر 2،4،10). أهمية الكالسيوم 2 + التنظيم وجهها كا 2 + ACSF المستوى في دراسات الشيخوخة في بمزيد من التفصيل في الفرع مناقشة.
  4. بينما كا 2 + خالية ACSF هو تجميد ، وإعداد غرفة عقد لصيانة شرائح الدماغ قبل وخلال التسجيلات الكهربية *. نحن نستخدم مخصص الكلي عقد بالغرفة ، أنه يحتوي على أربعة microchambers الفردية (انظر الشكل 2). الاوكسيجين H 2 O يملأ macrochamber مع عقيمة ، وmicrochambers هي أساسا الجزر التي تبرز فوق سطح الماء. داخل كل microchamber ، على إدراج بقية شرائح احرز في بركة ضحلة ACSF الاوكسيجين. شرائح ليست مغمورة تماما ، ولكن الجلوس على واجهة مع ترطيب الجو. عنصر التدفئة معزولة داخل macrochamber يسمح لتعديل درجات الحرارة.
    * أصناف عدة من غرف عقد تتوفر أيضا تجاريا (مثل وارنر الآلات يجعل انغمار على غرار "ما قبل الدائرة # ش - PC) ويجب أن يكون مناسبا للاستخدام في دراسات الشيخوخة وراثيا شريحة الماوس. وفي قرصة ، يمكن الحفاظ على شرائح عدة ساعات في طبق بتري صغيرة مليئة ACSF. اصنع ثقب صغير في الغطاء بتري لأنبوب الأوكسجين التسليم. كن حذرا بأن فقاعات الأوكسجين لا تستنهض الهمم جسديا الشرائح. شرائح سوف تحصل على ما يكفي من الأوكسجين إذا تم رفع أنبوب لمجرد التسليم فوق سطح ACSF (يجب أن تشتت الغاز تسبب المسافة البادئة في سطح السائل).

2. تشريح الدماغ وازالة قرن آمون في المسنين (> 20 شهرا من عمره الفئران)

  1. * إعداد منطقة تشريح بجوار حوض كبير (انظر الشكل 1 والجدول 2). وضع المقصلة حيوان صغير في الحوض ووضع الأدوات الجراحية والمواد اللازمة لإزالة تشريح الدماغ والحصين بما منشفة ورقة مطوية ، شفرة # 11 مشرط ، مقص beebee ، rongeurs العظام ، "أداة قرن آمون" (ملعقة المتخصصة المزدوج من أدوات جراحية دقيقة) ، مقص جراحية صغيرة ورقيقة المزدوج انتهت ملعقة بلاستيكية ماصة باستور ، 110 مم القطر Whatman تصفية الورق ، وبغطاء زجاجي طبق بتري 100 مم مملوءة الجليد ، وملعقة من البلاستيك. أيضا الاحتفاظ كيس بلاستيكي في مكان قريب للتخلص من الجثة.
    * ينبغي استكمال استخراج الدماغ في أقرب وقت ممكن ، حتى انها فكرة جيدة لعقليا "المشي من خلال" إجراءات ووضع الصكوك الخاص بها في النظام للاستخدام.
  2. إزالة كا 2 + خالية ACSF من الفريزر. وينبغي أن يكون جزئيا وسائل الاعلام ، وليس تماما ، والمجمدة. صب حوالي 50 مليلتر من ACSF في الدورق الزجاجي ، مع تغطية Parafilm ، والمكان المجاور للمنطقة تشريح. وسيتم استخدام هذه الوسائط لتخزين لفترة وجيزة في الدماغ مرة يتم إزالته. كا 2 المتبقية سوف + خالية من وسائل الاعلام أن تستخدم لملء الخزان في Vibratome لإعداد شريحة. يمكن reoxygenated هذه الوسائط ، أو مغطاة ببساطة مع parafilm ووضعها في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
  3. الموت ببطء والفئران باستخدام الأساليب المعتمدة من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة الاستخدام (IACUC). توضع حيواناتنا في الغرفة الصغيرة التي زجاجي مليء تدريجيا مع 100 ٪ CO 2. فقدان الوعي يحدث عادة في غضون خمس دقائق ، وتأكد من عدم وجود نشاط المنعكسبعد قرصة أخمص قدميه.
  4. قطع رأس الفأر منقاري فورا إلى فقرة في عنق الرحم الأول ووضع رأسه على منشفة ورقة مطوية. باستخدام مشرط رقم 11 ، وجعل سرعان ما شق في منتصف فروة الرأس ابتداء قرب عظم الأنف وتشغيل caudally حتى العظم القذالي. يجب التأكد من قطع تماما من خلال العضلات الجلدي ، وفضح تماما الغرز على السطح الظهري للجمجمة.
  5. قطع طريق لوحات سكل مع مقص beebee. في صغار الفئران والجرذان ، ويمكن إزالتها بسرعة الجمجمة مع استخدام rongeurs العظام وحدها. ومع ذلك ، تتراوح أعمارهم بين الفئران والجرذان أكثر سمكا من جماجم البالغين الشباب والفئران التي يمكن أن تجعل هذا الإجراء أمرا صعبا. لقد وجدنا أن القطع من خلال الجمجمة يسهل إلى حد كبير مع إزالة العظام rongeurs ، ويقلل إصابة في الدماغ ، ويحفظ ثوان ثمينة. مع رأس فأر بقوة على قمة مضادة ، وتضع طليعة انخفاض الهائل من مقص beebee في المنطقة العلوية من ماغنوم الثقبة في الجزء الخلفي من الجمجمة. حفظ انخفاض الهائل بحزم ضد سطح الجمجمة الداخلية (وبعيدا عن الدماغ) * ، قطع طريق لوحة القذالي ، ومن ثم على طول خط الوسط الدرز من اللوحات الجدارية. المضي قدما حتى قمت بقص rostrally من خلال لوحات الجمجمة الأمامية.
    * ومن المهم بمكان أن يتم توجيه الضغط بعيدا عن الدماغ لمنع قياس غير مقصود.
  6. فصل القذالي ، الجدارية ، وألواح الجمجمة الصدغي من الدماغ. تواصل عقد رئيس بحزم كونترتوب للاستقرار وقوة وانزلاق الفك السفلي من rongeurs تحت ضغط الصفيحة الجدارية اليسرى الحفاظ على السطح الداخلي للجمجمة. المقبل ، ضغط على فكي rongeurs معا ، ولفة معصمك صعودا ونحوك لسحب لوحات الجدارية والقذالي بعيدا عن الدماغ. هذا يجب فضح معظم السطح الظهري من نصف الكرة المخية الأيسر. إذا لزم الأمر ، استخدم rongeurs لإزالة اللوحة الأمامية اليسرى أيضا. كرر هذه العملية لنصف الكرة الأرضية الأخرى. مرة واحدة هم نازحون لوحات ، لتفقد بسرعة أي مسألة الجافية التي قد تكون ملحقة لوحات الزمنية وامتدت عبر سطح الدماغ. برفق بعيدا مع هذه rongeurs أو قطع مع مقص *. الآن ، وانزلاق الفك العلوي من rongeurs بين الدماغ والزمانية لوحة الحق ، وحفظ الضغط مرة أخرى على نحو الجمجمة وبعيدا عن الدماغ. الضغط وتطور لوحة الزمنية بعيدا عن الدماغ. يجب أن يسمع / يشعر "أزمة" كما تفعل هذا. كرر على الجانب الأيسر.
    * يمكن أن يكون من الصعب الجافية على الفور ، وخاصة إذا كان الحيوان perfused transcardially مع ACSF. ومع ذلك ، إذا لم تتم إزالة الجافية ، فإنها من خلال شريحة الدماغ (وعلى الأرجح قرن آمون) مثل الحلاقة عندما تتم إزالة لوحات الزمانية. والقص وبعيدا الجافية بالقرب من لوحات الزمنية التقليل من احتمال الطعن في الدماغ.
  7. استخراج الدماغ *. إزالة بسرعة parafilm من كا 2 + خالية ACSF "ذائب". الشريحة الآن رئيس ملعقة كبيرة من أداة الحصين بين السطح البطني للدماغ وجمجمة لوحات أسفل حتى يتم تماما تحت الدماغ. تحريك ملعقة من أفقيا جنبا إلى جنب ومن ثم إلى الأمام وإلى الخلف عدة مرات لقطع أعصاب في الجمجمة سليمة. مغرفة الآن خارج الدماغ مع أداة قرن آمون ويغرق في كا 2 + خالية ACSF وتغطي مع parafilm. السماح للفتور الدماغ لمدة دقيقة واحدة. هذا هو الوقت المناسب لتنظيف قبالة المقصلة ، والتخلص من الجثة ، وإعادة تنظيم منطقة تشريح.
    * للحصول على خطوات 2،3-2،7 والسرعة هو جوهر المسألة. ونحن نحاول استكمال هذا الإجراء (من قطع الرؤوس الى غمر في الدماغ ACSF) في 30-35 ثانية. في تجربتنا ، والاستخراج وقتا أطول من دقيقة ويبدو أن تؤثر سلبا على صحة شريحة الحصين ، وخاصة بالنسبة للفئران المسنين. باستخدام هذه الإجراءات ، وقد لاحظنا في الآونة توجد فروق بين الفئران استخراج المسنين والشباب لدراساتنا.
  8. استخراج الحصين. وضع ورقة Whatman تصفية على غطاء صحن بتري الجليد الباردة ويضعف ورقة مع ACSF باستخدام ماصة نقل من البلاستيك. استرداد المخ من ACSF باستخدام ملعقة ومكان على ورقة مبللة Whatman. باستخدام شفرة المشرط ، إزالة المخيخ والربع تقريبا واحد من الفصوص الجبهية ومنقاري. تشغيل شفرة المشرط من خلال الشق intrahemispheric منفصلة تماما لنصفي الكرة الأرضية. مكان واحد مرة أخرى في نصف الكرة ذائب ACSF و "الوقوف" على البعض في هذه المرحلة تشريح ان الطائرة الاكليلية من الفص الجبهي لأسفل. يجب أن تكون قادرا على التمييز بوضوح في جذع الدماغ والدماغ المتوسط ​​(والتي هي بيضاء) من القشرة الفوقية (والذي هو الوردي / رمادي). تحديد موقع أكيمات الأعلى والأدنى في الدماغ المتوسط ​​، وهذه ستبدو اثنين "المقابض" أبيض وسيتم في "القمة" في الدماغ في هذا الاتجاه. باستخدام مقص جراحي ، اضغط برفق الدماغ المتوسط ​​في مكان وحرك الملعقة في وزنها أن الفجوةتوين في أكيمات واللحاء الجديد لل. بلطف شديد ، لا تزال شريحة وملعقة أسفل وسحب الدماغ / المخ الأوسط / كشف المهاد بعيدا داخل البطين الجانبي والسطح وسطي للالحصين. استخدام حافة حادة من ملعقة إلى قطع بسلاسة القبو ؛ حزمة من الألياف البيضاء التي تقع في الجزء الأمامي / الظهرية للحصين. مع مقص ، ومواصلة بلطف لسحب الدماغ / المخ الأوسط / المهاد بعيدا دون قطع تماما عن بقية المخ. وينبغي أن القشرة مع الحصين تكمن الآن العودة بحرية من الدماغ *. المقبل ، تشغيل المرحلة تشريح بحيث كنت تبحث في قرن آمون والقشرة الفوقية الإنسي كما لو كان مقطع سهمي (ناقص المهاد). يجب عليك الآن أن نرى ألياف بيضاء الخمل التي تشكل القطع الزائد الضحلة في الجزء السفلي من قرن آمون في هذه الطائرة. باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، بخ بلطف بعض ACSF في فجوة تحت الخمل للمساعدة في فصل الحصين من القشرة. الشريحة بلطف ملعقة في هذه الفجوة ، بحيث يكون الجانب طويلة من الملوق بالتوازي مع المحور الطويل للقرن آمون. مرة واحدة ملعقة تماما تحت الحصين ، باستمرار الدماغ / المخ الأوسط / المهاد بحزم مع المقص ولفة ملعقة بعيدا عن جسمك لفصل فعليا الحصين عن بقية المخ. مرة واحدة في قرن آمون حر ، وتقليم بلطف بعيدا أي القشرة الباقية ، والأوعية الدموية ، والمادة البيضاء. حلج القطن على كمية صغيرة من ذائب ACSF على الجانب البعيد من مرحلة تشريح. موقف بلطف الحصين بجوار طين واخماد ملليلتر مع قليل من ACSF باستخدام ماصة نقل من البلاستيك. المقبل ، وإزالة نصف الكرة الأرضية الأخرى وكرر تشريح.
    * قد تحتاج إلى مقص قص بعيدا النسيج الضام إضافية ، المادة البيضاء ، أو الأوعية الدموية التي تمنع انفصال القشرة من الدماغ. نقاط المقص الخاص بك وسوف تكون قريبة جدا من الحصين ، لذا يجب التأكد من تسليم القصاصات دقيقة جدا (مقص حاد لا بد منه).

3. إزالة قرن آمون في الدماغ وتشريح الفئران المعدلة وراثيا في المسنين

  1. الموت ببطء والقضاء على راس الماوس وجعل شق خط الوسط على فروة الرأس كما هو موضح في القسم 2.3. الفئران والجماجم أرق بكثير من الفئران التي يبسط إلى حد كبير استخراج المخ. قطع طريق الجمجمة مع مقص هو بالتالي لا داعي لها. استخدام rongeurs العظام مع أصغر الفكين (الجدول 2) لسحب بعيدا القذالي ، الجدارية ، وألواح الجمجمة الزمانية. كما هو الحال مع الفئران ، وتذكر لاستخدام الحركات الخاضعة للرقابة واسحب بإحكام والفك السفلي من rongeurs إلى السطح الداخلي للجمجمة ، وبعيدا عن الدماغ وإزالة لوحات. حالما يتم إزالة لوحات ، واستخدام نهاية الضيقة للأداة الحصين لقطع الأعصاب القحفية المتبقية وحلج القطن في الدماغ الجليد الباردة كا 2 + خالية ACSF.
  2. إعداد شرائح الدماغ. يمكن أن يرجع ذلك إلى حجم أصغر من دماغ الفأر ، تشريح الحصين يكون قليلا أكثر صعوبة (على الرغم من المؤكد قابلة للتنفيذ) من عند استخدام الفئران. لذا ، لجعل الأمور أسهل ، ونحن إزالة المخيخ ونصائح منقاري من الفص الجبهي ، ولكن لا تشريح خارج الحصين. بدلا من ذلك ، يتم فصل نصفي المخ جسديا بشفرة مشرط وتركت على حالها لsectioning Vibratome (أنظر القسم 4 أدناه).

4. المقطع إلى شرائح أنسجة المخ باستخدام مشراح بالاهتزاز (Vibratome) ونقل الى غرفة القابضة *

  1. ملء خزان للVibratome مع الثلج الباردة كا 2 + خالية ACSF ، ان هذه هي غارقة تماما في مرحلة التقطيع والنصل. لصنع شرائح الفئران ، قطع نصائح منقاري والذيلية كل الحصين بشفرة المشرط. وسوف تسمح هذه التخفيضات لكم موقف عموديا الحصين معا بشكل وثيق مثل عمودين. هذا يعمل بشكل أفضل إذا التلفيف المسنن كل الحصين تواجه بعضها البعض ، والمناطق CA3 موجهة في نفس الاتجاه. لصنع شرائح الماوس ، موقف كل نصف الكرة عموديا معا بشكل وثيق مع الفص الجبهي لأسفل. الغراء على أنسجة المخ كتلة متزايدة ونقلها إلى مرحلة sectioning من Vibratome. نحن نستعد عادة ~ 400 UM المقاطع للتجارب الفيزيولوجيا متشابك. وينبغي إعداد أرق المقاطع إذا كان سيتم إجراء التصوير فلوري (التحقيقات مثلا كا 2 + المستويات والعابرين). جمع شرائح واسعة مع ماصة الفم أو فرشاة الطلاء # ونقل إلى طبق بتري صغيرة تحتوي على الجليد الباردة كا 2 + خالية ACSF.
    * استخدام الضرر الذي يقلل Vibratome إلى السطوح العلوية والسفلية من شريحة وأوصت بالتأكيد للدراسات التي تتطلب تحليل الخلايا بالقرب من السطح شريحة (مثل المشبك والجهد كا 2 + دراسات التصوير). ومع ذلك ، ارخص البدائل متاحة ومناسبة لتوليد شرائح للتجارب الفيزيولوجيا خارج الخلية. وقد استخدمنا صغيرة الجاذبية التي تسيطر عليها المروحية 2،11 المروحية والأنسجة McIlwain 12 مع نجاح جيدة. لثييتم وضعها الداخلي ليالي الحصين على مراحل ومقطوع مع المروحية العمودية. يتم استخدام فرشاة لنقل شرائح (واحدة في وقت واحد) إلى صحن عقد صغيرة مليئة الجليد الباردة كا 2 + خالية ACSF. مشكلة واحدة مع هذا النهج هو أن الحصين يمكن ان تتحرك بين القطع الناتجة في الفروع متفاوتة. أيضا ، كن حذرا لإزالة والمادة البيضاء من ذلك بكثير ، وخصوصا الأوعية الدموية من ذلك بكثير ، ممكن قبل التقطيع. وهذه المواد تلتصق الفرشاة ، وشفرة حلاقة ، أو كليهما ، مما يجعل من الصعب جدا نقل شريحة وزيادة احتمال تمتد أو إتلاف الأنسجة.
    # عندما باستخدام فرشاة ، في محاولة لبقية شريحة طول الحكيم عبر شعيرات. قد التفاف شريحة حول الطرف فرشاة سبب لا لزوم لها تمتد الأنسجة.
  2. نقل شرائح الدماغ الى الغرفة حيث عقد استحم هم في الاوكسيجين كا 2 + المحتوية ACSF. تحقيق درجة حرارة الغرفة تدريجيا من 27 درجة الى 32 درجة مئوية (+1 ° كل خمس دقائق). السماح للشرائح لاحتضان 1-1،5 ح قبل التجارب الكهربية.

5. وسجل حصول CA3 - CA1 الردود متشابك

  1. للتسجيلات خارج الخلية الأساسية في شرائح الحادة ، وسوف يتصل بك الكهربية المحطة تحتاج إلى تضمين * : غرفة تسجيل ، ونظام نضح ؛ المجهر مع القدرة> التكبير 4X ، تسجيل ، وتحفيز ، وأقطاب الأرض ، والماكرو micromanipulators ؛ جامدة الاهتزاز المقاوم الجدول كبار وقفص فاراداي ، مشجعا ألف ؛ مكبر للصوت والتناظرية إلى الرقمية (A / D) المحول ؛ الذبذبات (يفضل) ؛ والكمبيوتر الشخصية مع البرمجيات المناسبة اكتساب
    * كير العلمية الآلات الكهربية يقدم نظام رائعة وغير مكلفة (أي تسجيل مناديل كير النظام) لإجراء مجموعة من التجارب الأساسية الكهربية شريحة. هذا النظام له بصمة صغيرة ، والتحفيز والتشجيع المحمولة ومكبرات الصوت ، ويمكن استخدامها على مستوى المختبر مقاعد البدلاء دون الحاجة إلى قفص فاراداي الضخمة.
    بالطبع ، يمكن أيضا أن تستخدم شرائح الدماغ لأداء العديد من التفاصيل تقنيات الكهربية والتصوير ، والتي سوف تتطلب معدات ومواد إضافية. على سبيل المثال ، لدينا محطة الكهربية الرئيسي يحتوي على مكبر للصوت مع الجهد وسريع القدرات الحالية ، المشبك ، ونظام الإضاءة الفلورسنت ، وكاميرا رقمية. وتستخدم هذه المحطة للتسجيلات ميدانية خارج الخلية في الدماغ شرائح ، فضلا عن التصحيح ، المشبك التسجيلات والتصوير الفلورية في شرائح وثقافات الخلية 3،12،13. انظر الجدول 3 للحصول على قائمة كاملة من المعدات والمكونات.
  2. باستخدام ماصة واسع الفم أو فرشاة الدهان الصغيرة ، ونقل احد أو أكثر من شرائح لغرفة تسجيل * السماح لها حتى يتأقلم لمدة 10-15 دقيقة قبل التحفيز / تسجيل. لدراساتنا ، وغرقت في شرائح ACSF والباقي على المعاوضة إدراجها في دائرة RC - 22 بواسطة الآلات وارنر (انظر الشكل 3). ACSF هو بالجاذبية من خلال تنظيم لضبط تدفق الصرف ، وprewarmed إلى 32 درجة مئوية عن طريق سخان الجزئي مضمنة قبل الوصول إلى غرفة تسجيل. ويستخدم خط وسط فراغ لإزالة ASCF.
    * أنواع مختلفة كثيرة من الغاطسة وغرف تسجيل واجهة على غرار متاحة تجاريا. وقد لاحظنا أن المعرض شرائح ردود متشابك أكثر قوة في غرفة واجهة (أي شريحة يجلس في واجهة وترطيب الهواء مع ACSF) 2،11. ومع ذلك ، responsivity عموما أكثر استقرارا عندما تكون مغمورة في شرائح ACSF. نضح المخدرات هي أيضا أكثر فعالية في غرف غمر.
  3. وتسجيل موقف تحفيز كهربائي. مع تحول المعزل أو مشجعا على التحفيز ، ولكن الإخراج التي تم الاتصال بها وصولا الى 0 ، موقف القطب حفز أكثر من شريحة في المنطقة من الطبقة المشععة CA2 قرب الحدود CA3 (انظر الشكل 4). نستخدم الايريديوم البلاتين الملتوية سلك لتوصيل نبضات 5-10 ثنائي الطور لنا CA3 ألياف شيفر (SC) الجانبية. يمكن استخدام الأسلاك الايريديوم البلاتين والبقول ثنائي الطور مساعدة تصغير الاستقطاب الكهربائي. انخفاض القطب تسجيل CA1 في الطبقة المشععة ، وكسر للتو على سطح الشريحة. لدينا تسجيل الكهربائي هو سلك حج / AgCl في micropipette ACSF الزجاج مملوءة (المقاومة غيض من MΩ ~ 7). بدوره ناتج عن منشط تصل إلى مستوى معتدل (ونحن لدينا مجموعة من الحوافز لالمعزل 150 أمبير ~) وتبدأ بالإدارة البقول تحفيز النشاط والحصول على استخدام البرمجيات اقتناء مثل Clampex من شركة أكسون ، آلات أقل ببطء في تحفيز كهربائي صغير وتسجل فترات حتى artificact التحفيز في CA1. المقبل ، ومواصلة خفض ببطء كل ​​من الأقطاب الكهربائية تحفيز والتسجيل في فترات حين الحصول على ردود حتى CA1 تسديدة الألياف (FV) واحتمال مثير بعد المشبكي (الكامن الاستثاري بعد المشبكي) سعة تصل إلى المستويات القصوى (انظر الشكل 4B).
  4. إنشاء منحنى قوة متشابك والتحقيق اللدونة متشابك. لإنشاء منحنى قوة متشابك ، وتقديم الحوافز لSC البقول على أعلى كثافة متزايدة وسجل عشرةه الموافق في النشاط CA1. يجوز للمجموعة وعدد من مستويات كثافة استخدام التحفيز تختلف ولكن يجب أن تكون كافية لتوليد المنحنى السيني عندما تآمر ضد أي FV أو قيم الكامن الاستثاري بعد المشبكي (الشكل 5). السعة FV يوفر تقدير موثوق به لنسبة الألياف قبل المشبكي تفعيلها ، في حين أن المنحدر الكامن الاستثاري بعد المشبكي يوفر تدبيرا غير ملوثة للتيارات CA3 - CA1 الأحادي المشبك. التآمر المنحدر الكامن الاستثاري بعد المشبكي ضد FV عبر مستويات الكثافة يعكس بالتالي تحفيز حجم الكامن الاستثاري بعد المشبكي في عدد من afferents المنشط وتقديرا ممتازا للCA3 CA1 القوة متشابك. عادة ، يتم تخفيض كبير في مستويات القوة المشبكية CA1 منطقة الجرذان والفئران الذين تتراوح أعمارهم بين APP/PS1 ، بالنسبة للفئران الشباب والعمر المتطابقة الفئران البرية من نوع انظر على سبيل المثال 4،14.
  5. يتم استبعاد شرائح التي تظهر علامات على سوء الحالة الصحية (أي السعة القصوى الكامن الاستثاري بعد المشبكي <1 بالسيارات) أو فرط الاستثارية (أي ظهور طفرات 2 أو أكثر من السكان) خلال منحنى قوة متشابك من التحليل الإحصائي (انظر الشكل 4C). لقد وجدنا أن هذه الشرائح نادرا ما تظهر ردود مستقرة عبر / و 60 دقيقة أو مدة المعرض استجابات شديدة التباين التالية تحريض اللدونة متشابك. تستحقه مشيرا الى ان "شرائح غير صحية" يشكلون نحو 10-20 ٪ فقط من جميع شرائح نقل الى غرفة تسجيل. علاوة على ذلك ، في تجربتنا ، وتواتر تحديد شريحة غير الصحية هي مشابهة جدا في السن ، والأنواع ، وراثى.
  6. حمل بعيدة المدى (الكمونية) ، أو على المدى الطويل الاكتئاب (LTD) في الشرائح. LTP و LTD زيادات دائمة (الكمونية) والنقصان (المحدودة) في وظيفة متشابك استجابة لأنماط مختلفة من التنشيط متشابك. ويعتقد على نطاق واسع لتعكس كلتا العمليتين آليات حاسمة للتعلم وmemory15 وتوفير تدابير تحقق نتائج مفيدة للآليات العصبية الخلوية من اختلال وظيفي و / أو لتقييم استراتيجيات لتخفيف العجز الصيدلانية الذاكرة وتنكس عصبي 16.
    للتجارب اللدونة متشابك ، إعادة تعيين كثافة حافزا للجميع لشرائح * 1 بالسيارات والتحفيز يبدأ خط الأساس على تردد 0،033 هرتز. وينبغي أن القيم المنحدر الكامن الاستثاري بعد المشبكي تكون مستقرة على الأقل 20 دقيقة قبل تحريض الكمونية أو المحدودة. ترصد عن كثب EPSPs خلال هذا الوقت ، وإعادة تعيين كثافة التحفيز إذا كان المنحدر يتقلب أكثر من 10 ٪ وبدء خط جديد. حمل LTP باستخدام القطار ثانية واحدة من التحفيز هرتز 100 أو رشقات نارية قصيرة متعددة (~ 10 البقول) من التحفيز هرتز 100 مللي تعطى كل 200. لتحريض المحدودة ، وتقديم الحوافز البقول 900 بمعدل 1 هرتز. بعد استحثاث أو الكمونية المحدودة ، وجمع ردود متشابك ل60 دقيقة إضافية أو أكثر. تتم مقارنة القيم المنحدر الكامن الاستثاري بعد المشبكي حصل عليها قبل وبعد 60 دقيقة التحفيز تردد عال / منخفض لتحديد وجود أو الكمونية LTD.
    الجرذان والفئران الذين تتراوح أعمارهم بين APP/PS1 تميل إلى إظهار LTP ناقصة وLTD المعززة (انظر الشكل 5) ، واقترحت هذه التغييرات تسهم في ضعف الادراك في هذه النماذج الحيوانية 6،16. لكن ، خلافا APP/PS1 الفئران ، والتغيرات في LTP / المحدودة في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين متغيرة عبر المختبرات. الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المعرض عموما مستويات مماثلة LTP مقارنة بالبالغين ردا على "مكثفة" التحفيز (أي 100 هرتز) ، ولكن العجز تظهر عندما يتم استخدام معلمات أخف التحفيز (أي أقل ترددات التحفيز أو البقول أقل التحفيز) (انظر 4،6 لاستعراضها ، 16). أيضا ، وقد لاحظ بعض المختبرات ، بما في ذلك بلدنا ، زيادة التعرض للتحريض المحدودة في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 2،17-19 ، في حين أن جماعات أخرى لم تجد الفرق أو حساسية في انخفاض حيواناتهم المسنين. كما نوقشت بإيجاز أدناه (انظر مناقشة) ، قد الاختلافات الدقيقة ولكنها حاسمة في بروتوكول تجريبي حساب لتلك التناقضات.
    * يمكن لشدة الإثارة والسعة الكامن الاستثاري بعد المشبكي تأثير تحريض الكمونية ، وربما يكون أحد الأسباب الهامة للنتائج متفاوتة في الأدب. وسينظر هذا المقطع في مزيد من المناقشة.

6. ممثل النتائج

عملنا ، والعمل من المجموعات الأخرى ، وتشير إلى أن التغييرات في نجمية المستندة إلى إشارات قد تؤدي إلى التهابات و / أو تعجيل خلل عصبي أثناء الشيخوخة وميلادي 13،20،21. في الآونة الأخيرة ، وقد استخدمنا قوة متشابك ، الكمونية ، ونقطة النهاية المحدودة بوصفها تدابير للتحقق من كفاءة وآليات العمل للعديد من الكواشف الرواية المضادة للالتهابات في الفئران APP/PS1 منتصف العمر (انظر (22) لوصف هذا النموذج) والذين تتراوح أعمارهم بين فيشر 344 الفئران. تم الحصول على النتائج الواردة أدناه باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المادة.

واحدة من الرواية المضادة للالتهابات الغدة المرتبطة - 16 وقد تبين الفيروسي (AAV) الكواشف المخبرية التي وضعتها لدينا في الدراسات التجريبية إلى زيادة كبيرة في قوة متشابك (ع <0.05) ومنع العجز الكمونية (ع <0.05) في منتصف العمر ( شهرا من العمر) APP/PS1 الفئران (ن = 4-6 شرائح في حالة العلاج). ممثل منحنيات قوة متشابك والتجارب LTP اثنين من شرائح مختلفة ، كولected من الماوس 16 شهرا من العمر نفسه APP/PS1 ، وتظهر في الشكل 5A - C. تم استخراج شريحة واحدة من نصف الكرة تعامل مع AAV الرواية لدينا (الكاشف A) ، في حين تم التعامل مع شريحة أخرى لمراقبة AAV كاشف (مراقبة). وكان المستحث الكمونية في كل شرائح باستخدام اثنين من القطارات 1 ثانية من التحفيز هرتز 100 (10 ثوانى intertrain الفاصل). علما أن تحول منحنى قوة متشابك لالكاشف A - تعامل شريحة إلى اليسار من شريحة التحكم ، مما يدل على قوة أكبر متشابك. نلاحظ أيضا أن الفئران LTP نموذجية لAPP/PS1 منتصف العمر ، التهاوي السريع لشريحة أساسية في السيطرة (على سبيل المثال 23). على العكس ، التهاوي LTP قليلا في شريحة تعامل مع كاشف رواية لدينا.

في دراسة حديثة الثاني ، لاحظنا LTD كبيرة في السيارة لمعاملة الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (85 ٪ من خط الأساس قبل LTD ، P <0.05). في المقابل ، لم يلاحظ أي المحدودة في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين تعامل مع رواية "دواء" المضادة للالتهابات (97 ٪ من قبل LTD الأساس ، وليس كبيرا). لم يلاحظ أي آثار المخدرات على قوة متشابك. ويوضح ممثل التجارب المحدودة من هذا مجموعة البيانات (ن = 80-10 الفئران في كل مجموعة) في الشكل 5D - F.

الشكل 1
الشكل 1. الأدوات والمواد التي تستخدم في تشريح الدماغ. منشفة ورقية. B ، شفرة المشرط. C ، Beebee المقص. D ، rongeurs العظام (بالنسبة للفئران). E ، rongeurs العظام (بالنسبة للفئران / الجرذان). F ، ملعقة بلاستيكية. G ، ماصة بلاستيكية النقل. H ، أداة قرن آمون. الأول ، الملعقة. J ، مقص جراحي. K ، والزجاج طبق بتري.

الشكل 2
الشكل 2. شريحة الدماغ المخصصة عقد الغرفة. macrochamber A. B ، الغطاء. C ، H 2 O مع خزان أنابيب مثقبة السيليكون. D ، microchamber. E ، ACSF أنبوب التسليم (البولي ايثيلين). F ، O أنبوب توصيل 2. G ، المنفذ للتحكم بدرجة الحرارة. H ، عادت إدراج microchamber.

الشكل 3
الشكل 3. RC22 غمر الغرفة ألف غرفة تسجيل. B ، القطب الأرضي. C ، إبرة الطموح.

الشكل 4
الشكل 4. الحصين التوضيح شريحة والطول الموجي خارج الخلية. رسما كاريكاتوريا ، لمقطع الحصين عرضية الكهربية المستخدمة في التجارب. = CA قرن آمون. ج = التلفيف المسنن. SC = الضمانات شيفر. S المشععة = الطبقة المشععة. تليها باء ، والتحفيز الكهربائي للSC (محور عصبي CA3 المسالك) يتسبب قطعة أثرية التحفيز ، وعلى الفور تقريبا من قبل السكان ارتفاعا قبل المشبكي أو رشقة من الألياف (FV). اتساع FV يتناسب طرديا مع عدد من ألياف SC تفعيلها. المنحدر من مرحلة السلبية مستمرة من إمكانات الحقل بعد المشبكي مثير (الكامن الاستثاري بعد المشبكي) يقابل مباشرة إلى تفعيل depolarizing التيارات متشابك في الخلايا العصبية الهرمية CA1 ردا على اطلاق سراح الغلوتامات من محطات SC. C ، وتداخل الموجات خارج الخلية ممثل المسجلة في CA1 الطبقة المشععة استجابة إلى تسعة مستويات مختلفة من الشدة التحفيز (3-50 أمبير) في "صحية" (اللوحة اليسرى) ، "غير صحية" ، و "الشديدة الاستثارة" شريحة. وبلغ متوسط ​​الطول الموجي خمسة لكل مستوى. شرائح صحية تستجيب بشكل حيوي عبر هذا النطاق التحفيز ويحمل واحدة إيجابية الجارية ارتفاع عدد السكان (التي تعكس أداء الخلايا العصبية CA1) في أعلى مستويات التحفيز. في غرفة RC22 غمر ، EPSPs القصوى عادة ما تتراوح 1،5-3 بالسيارات في السعة. شرائح غير صحية (لوحة المتوسطة) يحمل في كثير من الأحيان FV كبيرة ، ولكن الكامن الاستثاري بعد المشبكي الصغيرة القصوى (<1 بالسيارات) ، وعادة ما تظهر ليونة الفقراء. شرائح الشديدة الاستثارة (اللوحة اليمنى) شاهد اثنين أو أكثر من السكان التموج التجدد في الطرف الصاعد من الكامن الاستثاري بعد المشبكي. الردود في شرائح الشديدة الاستثارة وغالبا ما تكون عطوب وتتأثر بنسب مختلفة بواسطة المحدودة / LTP التحفيز.

الشكل 5
الشكل 5. ممثل التجارب التي أجريت على شرائح الكهربية الحادة من الذين تتراوح أعمارهم بين منتصف (16 MOS) الفئران APP/PS1 والذين تتراوح أعمارهم بين (22 MOS) فيشر 344 الفئران. وحات AB تظهر البيانات التي تم جمعها من APP/PS1 الفئران التي عولجت مع سيطرة الغدة المرتبطة بها (AAV) الفيروسية بناء (مراقبة) أو كاشف AAV رواية (الكاشف A) الذي تم تطويره من قبل مجموعة مختبرنا. بالنسبة لشريحة السيطرة ، وتعامل مع شريحة الكاشف والمعارض تحولا ملحوظا في اليسار الكامن الاستثاري بعد المشبكي : FV منحنى (A) يدل على قوة أكبر متشابك. شريحة الكاشف - A المعاملة كما يبين LTP قوية ومستقرة (B) بعد تسليم ثوانى 1 اثنين ، 100 قطار التحفيز هرتز ، في حين أن شريحة التحكم المعارض LTP ناقصة ، نموذجية من هذا النموذج الحيواني. مدافع لوحات تظهر البيانات التي تم جمعها من الفئران عمرهما الفردية التي وردت المزمنة (4 أسبوع) perfusions intrahippocampal المركبة أو الرواية المضادة للالتهابات المخدرات (دواء). وكان قوة متشابك القاعدية بعيدة نسبيا عن العلاج من تعاطي المخدرات(D). ومع ذلك ، كان دواء فعال جدا في منع تحريض المحدودة (E). لوحات جيم وواو تظهر ممثل الكامن الاستثاري بعد المشبكي الطول الموجي المسجلة من قبل شرائح الفردية (قبل) ، وبعد 60 دقيقة (آخر) تسليم LTP / التحفيز LTD لاحظ أن لا تظهر التحف التحفيز.

Discussion

سوف الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول مساعدة ضمان أن تتم تشريح الدماغ على الاقل وبسرعة وكفاءة في العمر ، كما هو الحال في الفئران البالغين الشبان. كما نقوم بتوفير تفاصيل كافية للمبتدئين لإعداد الدراسات الخاصة بها على شريحة والكمونية LTD. إذا استكشاف مزيد من الشيخوخة والتغيرات في وظيفة ميلادي متشابك واللدونة هو واحد من أهدافك ، هناك اثنين على الأقل من القضايا المنهجية الأخرى ، وألمح إليها أعلاه ، التي تستحق مزيدا من الدراسة. وقد عرض لأول مرة ، ومختبرات عدة كا 2 + : + Mg2 نسبة في تسجيل ACSF يمكن أن يكون لها تأثير ملحوظ على تحريض اللدونة متشابك في قرن آمون شرائح 2،10،24،25. CSF في الثدييات ، كا 2 + : + Mg2 النسبة واحدة تقريبا (انظر على سبيل المثال 26). ومع ذلك ، ACSF كا 2 + : + Mg2 تستخدم عادة نسب أقرب إلى 2 في الدراسات شريحة وظيفة متشابك واللدونة. في الدراسات في وقت مبكر ، ربما تم تكييفها لتحسين هذه الممارسة تحريض الكمونية ، ثم أصبح لاحقا الروتيني لجميع الدراسات اللدونة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الممارسة الإشكالية في دراسات الشيخوخة وميلادي بسبب الخلافات جيدا تتميز الخلايا العصبية في كاليفورنيا 2 + التنظيم. على وجه التحديد ، كا 2 + تدفق و / أو كا 2 + من صنع كا 2 + هو ارتفاع في الافراج عن الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين و / أو نموذج الفئران ميلادي أثناء تنشيط الخلايا العصبية 3،27-31. تحريض المحدودة هي حساسة بشكل خاص للتغيرات طفيفة في مستويات الكالسيوم ACSF + 2. لدينا بروتوكول ، والذي يستخدم 2mm وكا 2 + و 2 ملي Mg2 + والنتائج عادة في LTD عن العمر ، ولكن ليس صغار الحيوانات البالغة 2 ، في حين أن الدراسات باستخدام كا 2 + : Mg2 + نسبة أقرب إلى اثنين ، وقد لاحظ LTD قوية لدى البالغين في عدم وجود فارق السن 2،10 أو بالتزامن مع خفض المحدودة في الفئران عمرها 32 عاما. هذه الملاحظات تسليط الضوء على الحاجة إلى النظر بعناية ACSF كا 2 + و + Mg2 المستويات عند مقارنة كا 2 + التي تعتمد على الحيوانات في اللدونة البالغين المسنين والشباب.

المسألة الثانية تتعلق التبعية المنهجية قوية من الكمونية على الاستقطاب بعد المشبكي 33 و ممكن الشيخوخة / اختلافات في التركيب الوراثي قوة متشابك. يتم ضبط عموما في تجربة نموذجية الكمونية ، والأساس LTP كثافة التحفيز لإنتاج نصف الحد الأقصى (أو ثلاثة أرباع القصوى) الكامن الاستثاري بعد المشبكي السعة. المشكلة المحتملة هي أن الجرذان والفئران الذين تتراوح أعمارهم بين APP/PS1 عادة تظهر انخفاض القوة النسبية متشابك مع نظرائهم الاصغر نوع و / أو البرية ، وهذا يعني أن القيم الأساس الكامن الاستثاري بعد المشبكي سيكون أيضا أصغر في الجرذان والفئران الذين تتراوح أعمارهم بين APP/PS1. ربما أصغر EPSPs تترجم إلى أقل الاستقطاب من خلال التحفيز الكمونية ، مما أدى إلى انخفاض احتمال لإحداث LTP 33. وبسبب هذا الخلط المحتملة ، فإنه من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه الحيوانات تظهر عجزا الإنتاجية ، وعجز اللدونة أو كليهما. وهذا هو ، قد آليات تحريض الكمونية في العمر والفئران / أو APP/PS1 سليمة وظيفيا (أي العجز اللدونة) ، ولكن حفز كاف (العجز الإنتاجية) في ظل هذه الظروف. هذا التمييز ضروري ، وآليات لنقل البيانات وآليات لدونة قد تستجيب بشكل مختلف للغاية لمعالجة دوائية محددة. ونحن نحاول الحد من تأثير انخفاض الإنتاجية في الحث الكمونية التي تطبيع السعة الكامن الاستثاري بعد المشبكي على نفس المستوى (مثل بالسيارات 1) في جميع شرائح قبل LTP التحفيز. استراتيجيات أخرى قد تكون فعالة وكذلك (مثل استخدام التيار الكهربائي أو المشبك الحالية لمعادلة غشاء المحتملة عبر مجموعات خلال التحفيز الكمونية) ، وينبغي النظر فيها عند التحقيق الكمونية في هذه النماذج الحيوانية.

Disclosures

وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو لايكا مايكروسيستمز.

Acknowledgements

العمل بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة AG027297 ، وهي جائزة من الحبل الشوكي والثقة كنتاكي رئيس أبحاث الإصابات ، وهدية من مؤسسة Kleberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Fisher Scientific BP366-500
KH2PO4 (monobasic) Sigma-Aldrich P5379-100G
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643-500G
CaCl2 (dihydrate) Sigma-Aldrich C3306-250G
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500
C6H12O6 (dextrose) Fisher Scientific BP350-1
Table 1. Reagents required
Erlenmeyer Flasks Fisher Scientific FB-500-2000 FB-500-1000
Aquarium Bubbler Used for oxygenating media. Available at most pet stores
50 mL Glass beaker Fisher Scientific 02-540G For brain storarge in ACSF
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Small Animal Guillotine World Precision Instruments, Inc. DCAP-M
Flat paper towel
#11 Feather surgical blade Fisher Scientific 08-916-5B
Beebee bone scissors Fine Science Tools 16044-10
Lempert Rongeurs Roboz Surgical Instruments Co. RS-8321 Use for rats
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16020-14 Use for mice or rats
Hippocampus tool Fine Science Tools 10099-15
Spoon A plastic teaspoon will do
Spatula Fisher Scientific 21-401-25A Spatula
Surgical iris scissors Fine Science Tools 14058-09
plastic transfer pipets Fisher Scientific 13-711-43
110mm Whatman filter paper Fisher Scientific 09-805E Whatman cat. 1001-110
Glass petri dish Fisher Scientific
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome Vibratome VT1000P
0.1mm FA-10 Feather S blade Ted Pella, Inc. 121-9 0.1mm FA-10 Feather S blade
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) Fisher Scientific 13-678-20A For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening
35 mm Polysterine Culture dish Corning 430588 Used for collecting slices after dissection
Table 2. Tools and materials for dissection
Holding chamber Custom Made
P-97 Horizontal Pipette Puller Sutter Instrument Co.
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corp.
Faraday cage Custom Made
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm Corning 1220-1L
Gravity-contolled IV set with regulator Baxter Internationl Inc. 2C8891
Central Vacuum Line Available in most modern labs
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix Scott-Gross Co.
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery Fisher Scientific Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes.
Eclipse E600FN Microscope Nikon Instruments with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters
Cool Snap ES Digital Camera Photometrics Cool Snap ES Digital Camera
X-Cite Fluorescent Illuminator EXFO X-Cite Fluorescent Illuminator
Microscope Platform Siskiyou, Inc. Custom assembled
RC-22 Submersible recording chamber Warner Instruments 64-0228 Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner)
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller Cell Microcontrols
4 Axis Manual Miniature manipulator Siskiyou, Inc.
Platinum Iridium Wire (0.002 in) World Precision Instruments, Inc. PTT0203
A365 Stimulus Isolator World Precision Instruments, Inc. A365 Stimulus Isolator
Multiclamp 700b Amplifier Axon Instruments
Digidata 1322A A/D converter Axon Instruments
PClamp software Axon Instruments
Personal Computer (Pentium 4) Dell
Table 3. Electrophysiology equipment and materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
  2. Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
  3. Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
  4. Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
  5. Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
  6. Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
  7. Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
  8. Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
  9. Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
  10. Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
  11. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  12. Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
  13. Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
  14. Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
  15. Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
  16. Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
  17. Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
  18. Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
  19. Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
  20. Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
  21. Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
  22. Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
  23. Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
  24. Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
  25. Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
  26. Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
  27. Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
  28. Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
  29. Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
  30. Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
  31. Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
  32. Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
  33. McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).

Comments

30 Comments

  1. A great protocol and discussion. What kind of stimulating electrode do you use?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 12:16 PM
  2. Thank you Louise. We use platinum iridium wire to make a bipolar electrode. The last time we purchased this wire we used World Precision Instruments (cat # ptt050²). Let me know if you need any other info

    Reply
    Posted by: chris n.
    May 3, 2011 - 12:54 PM
  3. Great protocol. However, I have got a problem. I can observe huge fiber volleys but with small or no EPSPs. Do you know what could be the problem? Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:57 AM
  4. Hi Olivier. Thanks for the kind words. In re to huge FVs and small EPSPs...Sometimes the fix can be as simple as tweaking the placement of your stimulating and recording electrodes (e.g. adjusting the depth and distance between trodes). However, if you've tried this and are still having problems there are a few possibilities. It could be that the tissue is being damaged and/or mishandled during the dissection/slicing procedure. As we mentioned in the protocol above, tissue from old animals and amyloidogenic animals tends to be a little more vulnerable to damage caused by the slicing procedure. If you haven't already, you may try dissecting a young adult mouse/rat (31 C). EPSPs are generally smaller at colder temperatures. 3)Make sure the pH of the incubation/recording medium is between 7.35 and 7.45. In the past, I've found that slices tend to exhibit big FVs and small EPSPs when they're sitting in media with a low pH (<7.3). 4) Make sure the slices are getting oxygenated efficiently DURING incubation, else they will die :). Usually, if oxygenation is good during incubation, but poor during the recording, the slices start off looking good but then become hyperexcitable as the experiment progresses. I hope this info helps. If you've tried all these fixes with no luck, feel free to email me.

    Best,

    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 11, 2011 - 12:52 PM
  5. Hi Chris,

    Thank you very much for your response but I think still need to bother you again. Indeed, it dŒs not seem to be related to the age of the animals. I think my slice are ok even if I use a McIlwain slicer. Indded, I had some responses last week (from 0.² to ² mV with immerged slices). Artefacts and fiber volleys were small compared to the responses. Now I can't see anymore proper responses (or very rarely) and as I said before, the amplitude of the fiber volley is huge (0.5-² mV) even for small stimulations. Moreover, it has two components a positive and a negative one. The artefact of stimulation became incredibly huge e.g 35 mV for a 100 us stimulation at 500 uA. Would you have any suggestion? I will test my headstage with the model cell. Thank you very much.

    Best regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 2:42 PM
  6. Hi Olivier, sorry for the late response. If you wanted to send me a picture of your EPSP waveforms to my email address (should be listed somewhere above or on the .pdf), I'd be happy to take a look at them. If you send this to me, please include information on the type of stimulator unit and electrodes your using as well as your ACSF composition.
    Best,
    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 18, 2011 - 12:12 PM
  7. Dear Chris,

    I have finally found the solution. Everything is working perfectly now. It was an issue with the glue I used for my holding chamber. Thank you again for your precious help.

    Kind regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 19, 2011 - 5:18 AM
  8. Dear Olivier,
    I am having the exact same problem as you. Would you please be more specific about how you were able to correct it? It would be so helpful!
    Best regards,
    Cristiane

    Reply
    Posted by: Cristiane T.
    July 12, 2012 - 11:58 AM
  9. Dear Cristiane,

    As explained in me previous message my problem of poor viability and small responses was related to the holding chamber to keep the slices at 35°C before experimenting. However, low viability can be due to many other reasons. You should work fast, in presence of AMPA and or NMDA blocker (or low sodium solution). You should avoid to fold the hippocampal tissues etc....

    Hope it will help.

    Reply
    Posted by: Olivier P.
    July 16, 2012 - 4:12 AM
  10. Hi every body, i was really so glad when i see your web site, and i want offer my thanks for your great site.
    i am from shefa neuroscience research center in iran where managed by proff. ALI GORJI who one of the first person worked on spreading depression in the world.
    i am working on Spreading Depression too and use LTP technique.
    please contact with me by e-mail for Future cooperation.
    Best Regard
    ahmad ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2011 - 10:56 AM
  11. Hi, I got a problem with my hippocampal slice recording. When I just transferred my slices from that incubation beaker into recording chamber, a large fEPSP response can be recorded, but after sitting in that chamber for a while, the response tended to become smaller even disapper compared with that when slices were just put in chamber. I have tried to adjusted the rate of oxygenation and temperature to ensure sufficient oxygen supply and correct temperature. I can garantee that oxygen supply has no problem and temperature is in normal range (²6 -30 C). But the problem is still there. Somebody told me that is cause by a "heat shock" when slices are transferred to a warmer enviornment. Can you help to resolve this problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2012 - 7:03 PM
  12. hi, you should put your slice in chamber(²8- 30c) for 1 hour after you get slice. And after that you should transfer your slice to second chamber( LTP chamber) in 3²c.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 3, 2012 - 11:48 AM
  13. Hi,

    I suppose you can't record at 35°C, don't you? May be the problem is that your slice moves slightly during the recording. Did you try to change the position of your recording electrode to see if you can recover a response with the initial amplitude?

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 1:21 PM
  14. Yes, I did. I move the recording electrode to several different positions trying to elicite a good amplitude. But the problem is still there. I have noticed that after sitting in the recording chamber for a while, the slices tended to lost activity. No matter where you put the recording electrode, you cannot recover a good amplitude as the initial one. I suspected that was caused by a slow flow rate, which is 1.5-² ml/min in my chamer. My chamer is different from others, because I currently use a blind method to record fEPSPs and eEPSCs. So my chamber is bigger than others with approximately 1-² ml volume for fluid exchange. I am trying to increase that flow rate to ².5-3 ml/min to see what will happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 3:26 PM
  15. Hi, sorry to hear about the problems you're having. Are your slices submerged in the recording chamber or at an interface with the air? Is your stimulus artifact changing, or just the synaptic response? What about the fiber volley, dŒs it die too? How do you know that the oxygen levels in your media are adequate? If your recording chamber is wide and your bath shallow, that would provide quite a bit of surface area for the oxygen to escape. Testing the bath pH with a micro pH meter would help determine if O² levels are stable. If you're worried about heat shocking the slice when you transfer it to the recording chamber, you could try slowly bringing the temperature of the media in your holding chamber up to recording temperature during the incubation period (maybe raising it 1 or ² degrees every 10-15 min).

    Reply
    Posted by: chris n.
    January 17, 2012 - 3:56 PM
  16. Hello again, I want to know the distance between stimulating electrode and recording one in your experiments. Some people put them in a very short distance (²00-300 micrometers). In my experiments, I usually put the stimulating electrodes at the initial part of the schaffer collateral fibers in CA1 area, and put that recording ones at a site as far as possible to avoid the large artifacts, but sometimes I was unable to get a stable LTP after HFS. I believe the reasons for that might be that many neural circuits are activated during HFS including inhibitory ones, because more circuits can be activated simultaneously with the increased distance. Is that correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 5:03 PM
  17. I need more detail, since I am still facing some problem.

    Reply
    Posted by: Zaman K.
    February 9, 2012 - 2:38 AM
  18. Finally, I found out the problem that leads to loss of viability of the hippocampal neurons in my experiment. It was caused by my chamber, which is so different from others. It has a very large volume, with a large surface. So I was assuming that my problem was caused by the anoxia resulted by rapid diffusion of ACSF into the large shallow surface. I already increase the flow rate to ².5 ml/min in my previous chamber, but still had that problem. So I made a polycarbonate slice chamber according to Warner company's criteria. Now I can get a pretty stable response throughout my experiment.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:02 PM
  19. What is the significance of air interface vs. submerged slices, is one better than the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:38 PM
  20. BTW, the criteria to judge the anoxia is the production of bubble in the chamber. If you see the bubble present in the chamber, that means the ACSF is oxygen-saturated. Heating makes the extra oxygen escape from the solution. If not, the ACSF is not saturated by oxygen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 3:10 PM
  21. Good for morale to read that I'm not the only one having problems with acute slices. Due to the comments above I'm going to try a few new things with my set-up. It MIGHT just be the oxygen-saturation, since I pre-heat the ACSF to 4² Celsius, trying to record at ~34 Celsius AND have a relative large chamber. Temperatures are experimental variables of the design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 28, 2012 - 11:15 AM
  22. Increasing the perfusion rate to 4 ml/min and changing to a bath that is diamond shaped and has a far lower volume were the solution. Getting a decent signal is still something of a black magic. =/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 7:14 AM
  23. Thank you for sharing your protocol - excellent video.

    Is there an advantage to dissecting out the hippocampus before slicing, as opposed to slicing the whole brain (or one hemisphere of the brain)?

    If I am not mistaken, you cite "netting" in the bottom of the recording chamber. DŒs that mean that the slice is suspended off of the bottom of the chamber?

    Is the resistance of the recording pipette a critical factor?

    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2012 - 5:33 AM
  24. Hi Chris, sorry for the late reply. For rats, whole hemisphere slices are fairly large and can be a bit of a problem if you have small recording and holding chambers. Also, the hippocampus in an adult rat is fairly easy to dissect away. For mice, on the other hand, the hippocampus is very small and a little trickier to dissect out (though it can certainly be done effectively). You can therefore save time by simply slicing the whole mouse hemisphere into sections. And unlike the rat, whole hemisphere mouse slices aren't so big that they are difficult to work with and store. In re to netting: yes we do use netting, which raises the slice off of the bottom of the dish. In re to the recording pipette resistance: we typically use smaller tip diameters to minimize damage to the recording region of the slice.

    Reply
    Posted by: chris n.
    June 19, 2012 - 4:36 PM
  25. Hi, Prof. Norris:
    Great protocol to follow and precious comments to refer to. As a beginner to this tech, I have a few questions in my mind.
    1. Some papers claimed that they used sucrose-ACSF(0 Na 0 Ca) as the dissection medium, some even put AMPAR/NMDAR blocker(i.e. Kynurenic acid) and/or ascorbic acid in. According to your experiences, is there any difference btw sACSF and normal ACSF to the slice health? Is postsynaptic blocker and/or ascorbic acid necessary?
    ². In some literatures, they used different ways of anesthetization, such as barbiturates, TCA, ether, isoflurane, halothane etc. DŒs anesthetizing method affect the slice quality and the electrophysiological results? In this paper, you used CO², were there any possibility that the brain might get some anoxia-like influence or damage?
    3. For holding and recording temperatures, I found variable ways in different papers, is there any general principle of how to set the proper temperatures? In your paper, after slicing all the brain sections(put in ice cold 0Ca ACSF temporally), and tranfering them to ²7degree and gradually elevating temperature, is my understanding correct? Could you please tell me how much time will each step take(i mean, "cutting"->"temporally storage"->"recovery solution")?
    4. What are the proper cutting speed (mm/min) and vibrating frequency for hippocampal slices?
    5. what cutting direction is proper? longitudinally from CA3 corner to DG corner or the opposite, or laterally across hippo? or it dŒsn't matter?
    Thanks so much!
    sincerely,
    Hang

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:13 PM
  26. I have another question:
    6. In re to literatures, some used bipolar twisted electrodes and some used concentric electorde, do you have some comments to these two types?

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:21 PM
  27. i am very interesting the custom brain slice holdiing chamber, would you mind sharing the supplier?
    Thank you.

    Reply
    Posted by: CHIA S.
    March 26, 2013 - 3:23 AM
  28. Hi,

    I was very excited when I came across this video/article today, since my Masters project is going to be entirely based on recording after LTP induction on adult mouse hippocampi in vitro.

    I have just started trying to obtain decent slices, and have only gotten so far as extracting the brain from the mouse with acceptable quality. All that comes after has been a little bit frustrating so far. So, I have a few questions regarding the slicing step itself (we have the very same vibratome at our lab, which makes things easier, I guess!):

    - Every time I try to slice the brain, the blade actually pushes the brain away instead of cutting through it! This leads to either a completely useless slice or not even that, as the blade will only cut the last few milimiters of the brain and yield something not even worth calling a slice! The blades are brand new, but I bought them at a drugstore and they were intended to be shaving blades. Might that be the issue, a blade not sharp enaugh?

    - I haven't yet tried separating the hemispheres. Maybe I should do that!

    - I see you use this little block onto which you glue the brain (hippocampus, in your case). I've been using a sort of plate attached to the vibratome, which gŒs in the same place as the block. Do you reckon the block is a better call?

    - Do you have a better method for drying the cutting chamber after using it than letting the ice thaw and then sucking it up with vacum?

    If there are any remarks you should think of that haven't been shown in the video regarding the actual slicing step, I'd apreciate if you could share!

    Best regards,

    Thomaz Dias
    UFMG - Brazil

    Reply
    Posted by: Thomaz L.
    March 28, 2013 - 5:16 PM
  29. Great information here. I have a quick question about the aCSF containing bottle; would you keep it at room temperature or in a water bath at 34 degrees C?

    I will be recording at 34 degrees with a recording chamber heater and was wondering what would be the best way to hold the aCSF that is coming into the chamber?.

    I know there is an inverse relationship with dissolved oxygen and temperature in water, but would it be better to have it constant in the bottle and chamber or best to have it room temperature in the bottle and warm upto 24 degrees in the chamber?

    Any advice would be much appreciated.

    Minos

    Reply
    Posted by: Minos K.
    July 12, 2013 - 11:50 AM
  30. Hi
    Your projects are amazing. Oh here I can’t help sharing some experience of fabrication after designs done.
    We are working with a OverMolding vendor in China the name is Zetar Industry (http://www.zetarmold.com), Located in Shanghai China (a very big modern city). They are really good.Moving fast and very professional. They helped me with my new design. I asked them to do the injection mold, then Injection Moldingmass production. I was surprised by their rich experience in Insert Molding
    and punched lead time. Guys in Zetar deserve every good word just as you are.

    Reply
    Posted by: info z.
    September 2, 2013 - 11:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats