הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

Published 3/23/2011
30 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience
 

Summary

מאמר זה מתאר פרוצדורות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים סינפטיים הקשורים להזדקנות המוח הקשורים לגיל מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.

Cite this Article

Copy Citation

Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330, doi:10.3791/2330 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הכנת בהיפוקמפוס מכרסם פרוסה היא אולי הכלי הנמצא בשימוש הנרחב ביותר על חקירת פונקציה הפלסטיות הסינפטית יונקים. ההיפוקמפוס ניתן לחלץ בקלות ובמהירות מן חולדות ועכברים ופרוסות להישאר קיימא עבור שעות בנוזל השדרתי מחומצן מלאכותית. יתר על כן, טכניקות בסיסיות electrophysisologic מוחלים בקלות החקירה של תפקוד סינפטי של פרוסות בהיפוקמפוס סיפקו כמה סמנים הטוב ביותר עבור ליקויים קוגניטיביים. פרוסה בהיפוקמפוס פופולרי במיוחד עבור המחקר של מנגנוני הפלסטיות הסינפטית המעורבים בלמידה ובזיכרון. שינויים אינדוקציה של potentiation לטווח ארוך ודיכאון (LTP ו LTD) יעילות הסינפטית בתוך פרוסות בהיפוקמפוס (או חוסר שלה) משמשים לעתים קרובות כדי לתאר את הפנוטיפ נוירולוגית של חיות קוגניטיבית ראייה ו / או להעריך את מנגנון הפעולה של nootropic תרכובות. מאמר זה מתאר את ההליכים בהם אנו משתמשים להכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים סינפטיים הקשורים להזדקנות המוח לבין מחלת האלצהיימר (AD) 1-3. שימוש של חולדות בגילאים מודל עכברים לספירה יכול להציג קבוצה ייחודית של אתגרים החוקרים רגילים להשתמש חולדות צעירות ו / או עכברים המחקר שלהם. חולדות גיל יש גולגלות עבה רקמת חיבור קשה יותר מאשר חולדות ועכברים הצעיר, אשר יכול לעכב מיצוי המוח ו / או דיסקציה וכתוצאה מכך לשלול או להגזים אמיתי גיל הבדלים בתפקוד הפלסטיות הסינפטית ו. הזדקנות עמילואיד הפתולוגיה אף עלולה להחמיר פגיעה בהיפוקמפוס מתמשכת במהלך ההליך לנתיחה, שוב סיבוך כלשהו להסיק מסקנות הערכה פיזיולוגית. כאן, אנו דנים הצעדים שננקטו במהלך ההליך לנתיחה כדי למזער את הבעיות הללו. דוגמאות של תגובות הסינפטי שנרכש "בריא" או "לא בריא" פרוסות של חולדות ועכברים מסופקים, וכן נציג ניסויים הפלסטיות הסינפטית. ההשפעה האפשרית של גורמים מתודולוגיים אחרים על תפקוד סינפטי אלה במודלים של בעלי חיים (למשל פתרון הקלטה הרכיבים, הפרמטרים גירוי) הם דנו גם. למרות ההתמקדות של מאמר זה היא על השימוש של חולדות ומעלה העכברים הטרנסגניים, מתחילים לחתוך הפיזיולוגיה צריך למצוא את הפרטים כאן מספיק כדי להתחיל לעבוד על מחקרים משלהם, באמצעות מגוון של מודלים מכרסם.

Protocol

1. הכנת קרות כקרח מחומצן נוזל השדרה מלאכותית (ACSF)

  1. הכינו 2 ליטר של "Ca 2 +-free" ACSF. בבקבוק Erlenmeyer 2L, להוסיף כ -1.5 ליטר של סטרילית או פעמיים מזוקקים H 2 O, ומתחיל לבחוש במרץ בצלחת ומערבבים. מוסיפים את הרכיבים הבאים ACSF (מ"מ): 124 NaCl, KCl 2, 1.25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3, ו - 10 דקסטרוז (ראה לוח 1). מביאים בהיקף של 2 ליטר עם מזוקקים H 2 O.
  2. שימוש bubbler אקווריום צינורות המחוברים של 95% O 2 / 5% CO 2 טנקים אוויר, חמצן ACSF במרץ כ 20-30 דקות. בדוק את ה-pH, ובמידת הצורך, להסתגל 7.4 באמצעות NaOH או HCl.
  3. יוצקים 750 מ"ל של Ca 2 + מחומצן ללא ACSF לתוך בקבוק Erlenmeyer נפרדים, לכסות את הפתח עם parafilm, ולהעביר ultrafreezer (-80 מעלות צלזיוס) במשך 20-30 דקות. מדיה זה ישמש לניתוח של פרוסות בהיפוקמפוס במוח חריפה *. הוסף 2 מ"מ CaCl 2 לנפח 1.25 הנותרים L של ACSF #, ומערבבים היטב, ולהמשיך חמצון עם 95% O 2 / 5% CO 2. מדיה זה ישמש לאחסון פרוסות המוח לאחר והניתוחים, ועל המרוססת פרוסות במהלך הקלטות אלקטרו.
    * קרות כקרח Ca 2 + חינם התקשורת משמש כדי להאט את חילוף החומרים ולמזער Ca 2 + תלויי excitotoxicity במהלך לנתיחה.
    # שינויים Ca 2 + dysregulation במהלך ההזדקנות לספירה יכולה להיות השפעה גדולה על אינדוקציה של Ca 2 + תלויי הפלסטיות הסינפטית 4-9. דיווחים סותרים על השוני בגיל בע"מ ניתן לייחס בחלקו לשימוש שונה ACSF Ca 2 +: Mg2 + יחסי במהלך ההקלטות פרוסה (ראה 2,4,10). חשיבותה של Ca 2 + תקנה את ACSF Ca 2 + רמת לימודי הזדקנות מופנית ביתר פירוט בסעיף דיון.
  4. בעוד 2 Ca + ללא ACSF הוא מקפיא, להכין חדר מחזיק לשמירה על פרוסות המוח לפני ובמהלך ההקלטות אלקטרו *. אנו משתמשים קאמרית אישית המאקרו אחזקות מכיל ארבעה microchambers הפרט (ראה איור 2). Macrochamber מלא סטרילי, חמצן H 2 O ו microchambers הם למעשה איים הבולטות מעל פני המים. בתוך כל microchamber, פרוסות לנוח על הכנס מרושת בבריכה רדודה של ACSF מחומצן. Slices אינם שקועים לחלוטין, אבל לשבת עם ממשק האוויר humidified. החימום מבודדים בתוך macrochamber מאפשר התאמת הטמפרטורה.
    * סוגים אחדים של תאים מחזיק גם הם זמינים מסחרית (לדוגמה וורנר עושה Instruments השקיעה בסגנון "קדם לשכת # BSC-PC) והוא אמור להיות מתאים לשימוש הזדקנות מהונדס פרוסה מחקרים העכבר. באין ברירה, פרוסות יכול להישמר עבור כמה שעות בצלחת פטרי קטן מלא ACSF. לעשות חור קטן במכסה פטרי עבור צינור העברת חמצן. היזהר כי בועות חמצן לא פיזית להתסיס את הפרוסות. Slices יקבל מספיק חמצן אם צינור אספקת מועלות רק מעל פני השטח ACSF (פיזור הגז אמור לגרום חריץ במשטח נוזל).

2. מוח להסרת ו Dissection בהיפוקמפוס גיל (> 20 בן חודש, חולדות)

  1. הכן את השטח לנתיחה * ליד הכיור גדול (ראה תרשים 1 ו טבלה 2). מניחים הגיליוטינה חיה קטנה הכיור לפרוס מכשירי ניתוח חומרים להסרת המוח לנתיחה בהיפוקמפוס כולל מגבת נייר מקופל, להב # 11 אזמל, מספריים beebee, rongeurs העצם, "כלי היפוקמפוס" (מרית כפול התמחה מ כלי כירורגי פיין), מספריים כירורגיות קטנות, מרית דקה פעמיים הסתיים, פיפטה פסטר מפלסטיק, בקוטר 110 מ"מ Whatman סנן נייר, זכוכית עפעפיים 100 מ"מ צלחת פטרי מלאות קרח, כפית פלסטיק. כמו כן לשמור על שקית פלסטיק סמוך לסילוק של הגווייה.
    * שאיבת מוח יש להשלים מהר ככל האפשר, כך שזה רעיון טוב מבחינה מנטלית "לעבור" הליך ולהניח המכשירים שלך לפי סדר השימוש.
  2. הסר Ca 2 + ללא ACSF מהמקפיא. התקשורת צריכה להיות חלקית, לא לחלוטין, קפוא. יוצקים כ - 50 מ"ל של ACSF לתוך כוס זכוכית, מכסים Parafilm, ומקום ליד אזור לנתיחה. מדיה זה ישמש בקצרה לאחסן את המוח ברגע שהוא מוסר. Ca 2 + הנותרים ללא התקשורת ישמש כדי למלא את המאגר בתוך Vibratome להכנת פרוסה. מדיה זה יכול להיות reoxygenated, או שפשוט כיסה עם parafilm והניח במקרר ב 4 ° C.
  3. להרדים את העכברוש בשיטות אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC). החיות שלנו ממוקמים בתא פלסטיק קטן מלא בהדרגה עם 100% CO 2. איבוד הכרה מתרחש בדרך כלל תוך חמש דקות, והוא אושר על ידי היעדר פעילות רפלקסלהלן קמצוץ הבוהן.
  4. לערוף את העכברוש מקורי מיד לחוליה הראשונה של הצואר מקום ראש על מגבת נייר מקופלת. באמצעות אזמל # 11, במהירות עושים חתך באמצע הקרקפת מתחיל ליד עצם האף ריצה caudally לעצם העורפית. הקפידו לחתוך לחלוטין את השריר עורית, מלא לחשוף את התפרים על פני השטח הגבי של הגולגולת.
  5. לחתוך את צלחות לחתור במספריים beebee. ב חולדות ועכברים צעירים, הגולגולת ניתן להסיר במהירות עם השימוש rongeurs העצם לבד. עם זאת, חולדות בגילאי יש גולגלות עבה יותר חולדות ועכברים בוגרים צעירים שיכולים להפוך הליך זה קשה. מצאנו כי חיתוך דרך הגולגולת הסרת העצם מאוד מקל עם rongeurs, מפחית פגיעה במוח, ושומר שניות יקרות. עם ראש של חולדה בתוקף על גבי הדלפק, למקום את חוד החנית של הצרופה התחתון של המספריים beebee לאזור מעולה של מגנום ב foramen החלק האחורי של הגולגולת. שמירה העצום נמוך בתקיפות נגד פני השטח הפנימי של הגולגולת (והרחק המוח) *, לחתוך הצלחת העורפית, ולאחר מכן לאורך תפר את קו האמצע של צלחות הקודקודית. המשך rostrally עד לחתוך את לוחות הגולגולת הקדמי.
    * חשוב ביותר כי הלחץ מופנה הרחק המוח כדי למנוע מודד בשוגג.
  6. הפרד את העורפית, הקודקודית, וצלחות הגולגולת הזמני מהמוח. המשך מחזיק את הראש היטב הדלפק ליציבות למנף והחלק את הלסת התחתונה של rongeurs תחת הלחץ צלחת הקודקודית השמאלית שמירה על המשטח הפנימי של הגולגולת. בשלב הבא, לסחוט את הלסתות של rongeurs ביחד לגלגל את פרק כף היד כלפי מעלה וכלפי לך למשוך את הקודקודית וצלחות העורפית מן המוח. זה צריך לחשוף את רוב השטח הגבי של האונה השמאלית. במידת הצורך, להשתמש rongeurs להסיר את צלחת חזיתית שמאל גם כן. חזור על תהליך זה עבור חצי הכדור השני. לאחר הצלחות הם עקורים, לבדוק במהירות לכל עניין הדורה שעשויים להיות מחוברים לוחות הזמני נמתח על פני השטח של המוח. משוך בעדינות אלה משם עם rongeurs או לחתוך עם מספריים *. עכשיו, החלק את הלסת העליונה של rongeurs בין המוח לבין הצלחת המצחית הימנית, שוב שמירה על לחץ כלפי הגולגולת מן המוח. לסחוט ולסובב את הצלחת הזמני מן המוח. אתה צריך לשמוע / להרגיש "מחנק", כפי שאתה עושה את זה. חזור על הצד השמאלי.
    * דורה יכול להיות קשה לזהות, בייחוד אם החיה כבר perfused transcardially עם ACSF. עם זאת, אם דורה לא יוסרו, הם יחתכו דרך המוח (וקרוב לוודאי ההיפוקמפוס) כמו תער כאשר צלחות הזמני יוסרו. החיתוך הדורה משם ליד צלחות הזמני יהיה למזער את הסבירות של דקירה המוח.
  7. חלץ את המוח *. במהירות להסיר את parafilm מן Ca 2 + ללא ACSF "עכור". עכשיו להחליק את הראש מרית רחבה של כלי בהיפוקמפוס בין המשטח הגחוני של המוח ואת לוחות הגולגולת התחתונה עד שהוא לחלוטין תחת המוח. הזז את המרית רוחבית מצד לצד עד ואז קדימה ואחורה כמה פעמים לנתק את עצבי הגולגולת ללא פגע. עכשיו סקופ את המוח עם הכלי לצלול בהיפוקמפוס וב Ca 2 + ללא ACSF ומכסים parafilm. תנו את צינת המוח למשך דקה אחת על. זהו הזמן המתאים כדי לנקות את הגיליוטינה, תשליך הפגר, ולארגן מחדש את אזור הניתוח.
    * לקבלת צעדים 2.3-2.7, המהירות היא מהות. אנחנו מנסים להשלים הליך זה (מ עריפת ראש למוח והשקיעה ACSF) ב 30-35 שניות. מניסיוננו, עקירות לוקח יותר מדקה נראה להשפיע לרעה על בריאות פרוסה בהיפוקמפוס, במיוחד בגילאי חולדות. באמצעות תהליכים אלה, ראינו הבדלים בין הזמנים מיצוי חולדות בגילאים צעירים ללימודים שלנו.
  8. חלץ את hippocampi. הנח את הנייר Whatman לסנן על מכסה של צלחת פטרי קרים כקרח לצנן את הנייר עם ACSF בעזרת פיפטה העברת פלסטיק. אחזר את המוח מן ACSF בעזרת כף ומניחים על נייר Whatman לחה. בעזרת סכין את האזמל, להסיר את המוח הקטן ואת כרבע של האונות המצחיות מקורי. הפעל את הלהב אזמל דרך הסדק intrahemispheric לחלוטין להפריד בין שתי ההמיספרות. מקום אחד בחצי הכדור בחזרה עכור ACSF ו "לעמוד" עד אחר על הבמה לנתח כך את המטוס העטרה של האונה הפרונטלית היא פונה כלפי מטה. אתה צריך להיות בבירור להבחין בגזע המוח ובמוח באמצע (אשר לבן) מהקורטקס שמעליה (שהוא ורוד / אפור). אתר את הקוליקולוס העליון ונחות על המוח התיכון; אלה ייראו כמו שני "כפתורים" לבן יהיה בבית "העליון" של המוח בכיוון הזה. בעזרת מספריים כירורגיות, בעדינות להחזיק את המוח התיכון במקום והחלק את המרית במשקל בפער להיותtween colliculi ואת הניאוקורטקס. בעדינות רבה, להמשיך להחליק את המרית למטה ולמשוך את המוח / המוח התיכון / התלמוס ממנו לחשוף את החלק הפנימי של החדר לרוחב פני השטח המדיאלי של ההיפוקמפוס. השתמש קצה חד של מרית כדי לנתק את חלקה fornix; צרור סיבים לבנים הממוקם בחלק הקדמי / הגבי של ההיפוקמפוס. עם המספריים, בעדינות להמשיך למשוך את המוח / המוח התיכון / התלמוס בלי לנתק אותו לחלוטין משאר חלקי המוח. קליפת עם ההיפוקמפוס עכשיו צריך להניח בחופשיות חזרה גזע המוח *. בשלב הבא, להפוך את שלב הביתור כך אתה מסתכל על ההיפוקמפוס המדיאלי ו הקורטקס שמעליה כאילו קטע sagittal (מינוס התלמוס). כעת אתה אמור לראות את הסיבים הלבנים fimbria היוצרים היפרבולה רדוד בתחתית של ההיפוקמפוס במישור זה. בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להשפריץ בעדינות קצת ACSF לתוך הפער מתחת fimbria לעזור ההיפוקמפוס נפרד מן הקליפה. החלק בעדינות את המרית לתוך הפער הזה, כגון שהצד ארוכה של המרית מקביל עם ציר האורך של ההיפוקמפוס. לאחר המרית לחלוטין תחת בהיפוקמפוס, החזק את המוח / המוח התיכון / התלמוס היטב עם המספריים ומגלגלים את המרית מהגוף שלך ליצור הפרדה פיסית בין ההיפוקמפוס משאר חלקי המוח. לאחר בהיפוקמפוס היא בחינם, בעדינות לחתוך כל קליפת המוח הנותרים, כלי דם, ואת החומר הלבן. סקופ כמות קטנה של ACSF עכור על הצד המרוחק של הבמה לנתח. בעדינות לתפקיד ההיפוקמפוס ליד הרפש ואת לכבות עם כמה מיליליטרים של ACSF בעזרת פיפטה העברת פלסטיק. בשלב הבא, להסיר את הכדור השני וחזור על לנתיחה.
    * ייתכן שתצטרך את המספריים כדי לגזור ממנו רקמת חיבור נוספות, החומר הלבן, או בכלי הדם המונעת הפרדה של קליפת המוח של גזע המוח. נקודות מספריים שלך יהיה קרוב מאוד בהיפוקמפוס, כדי להיות בטוח, כדי לספק חיתוכים מאוד מדויק (במספריים חדים הם חובה).

3. מוח להסרת ו Dissection בהיפוקמפוס העכברים הטרנסגניים בני

  1. להרדים ו לערוף את העכבר ולעשות חתך קו האמצע על הקרקפת, כמתואר בסעיף 2.3. עכברים יש גולגלות הרבה יותר רזה חולדות אשר מאוד מפשט מיצוי המוח. חיתוך דרך הגולגולת במספריים מיותר לכן. השתמש rongeurs עצם עם לסתות קטנות (טבלה 2) כדי להתרחק הקודקודית העורפית, וצלחות הגולגולת הזמני. כמו העכברוש, לזכור להשתמש בתנועות מבוקרת היטב למשוך את הלסת התחתונה של rongeurs אל פני השטח הפנימי של הגולגולת הרחק המוח כמו שאתה להסיר את הצלחות. לאחר הצלחות מוסרים, להשתמש סוף הצר של הכלי בהיפוקמפוס לנתק את עצבי הגולגולת הנותרים סקופ המוח לתוך קר כקרח Ca 2 + ללא ACSF.
  2. הכן את פרוסות המוח. בשל גודלו הקטן של מוח העכבר, בניתוח hippocampi יכול להיות קצת מאתגר יותר (אם כי אפשרי בהחלט) מאשר בעת השימוש חולדות. לכן, כדי להקל עליהם, אנו מסירים את המוח הקטן וטיפים מקורי של האונות המצחיות, אבל לא לנתח את hippocampi. במקום זאת, המיספרות המוח מופרדים פיזית עם להב אזמל והשאיר על כנו חתך Vibratome (ראה סעיף 4 להלן).

4. סעיף רקמות המוח לפרוסות Microtome באמצעות רטט (Vibratome) והעברה אחזקות לשכת *

  1. מלאו את המאגר של Vibratome עם קרים כקרח Ca 2 + ללא ACSF, כך על הבמה להב חיתוך שקועות לגמרי. להכנת פרוסות חולדה, לנתק את עצות מקורי ואת הזנב של ההיפוקמפוס כל עם להב אזמל. קיצוצים אלו יאפשרו לך אנכית עמדת hippocampi בשיתוף פעולה הדוק כמו שתי עמודות. זה עובד הכי טוב אם gyrus משוננת של ההיפוקמפוס כל אחד מול השני ו CA3 האזורים מכוונים לאותו כיוון. להכנת פרוסות העכבר, כל עמדה אנכית הכדור בשיתוף פעולה הדוק עם האונות הקדמיות כלפי מטה. דבק רקמות המוח גובר על גוש ולהעביר לשלב חתך של Vibratome. אנחנו בדרך כלל להכין ~ 400 מקטעים UM לניסויים בפיזיולוגיה הסינפטי. הסעיפים רזה צריך להיות מוכן אם פלורסנט הדמיה ייערכו (למשל חקירות של Ca 2 + רמות הארעיים). איסוף פרוסות עם פיפטה בפה רחב או מברשת צבע # ולהעביר בצלחת פטרי קטן המכיל קר כקרח Ca 2 + ללא ACSF.
    * שימוש נזק ממזער Vibratome אל משטחי העליון והתחתון של הפרוסה והוא מומלץ בהחלט ללימודי המחייב ניתוח של תאים קרוב לפני השטח פרוסה (למשל מהדק מתח Ca 2 + בדיקות הדמיה). עם זאת, חלופות זולות יותר זמינים ומתאימים ליצירת פרוסות לניסויים פיזיולוגיה תאית. השתמשנו מסוק קטן הכבידה שבשליטת 2,11 ו ופר רקמות McIlwain 12 עם הצלחה טובה. עבור thiזה הליך hippocampi ממוקמות על מבוים מחולק עם המסוק אנכית. מברשת משמש להעברת פרוסות (אחד בכל פעם) אל צלחת קטנה מחזיקה מלאים קר כקרח Ca 2 + ללא ACSF. בעיה אחת עם גישה זו היא כי hippocampi יכול לנוע בין צלעות וכתוצאה מכך חלקים לא שווים. כמו כן, להיזהר להסיר כעניין לבן הרבה, במיוחד כאשר vasculature רב, ככל האפשר לפני החיתוך. חומר זה מקל על המברשת, סכין גילוח, או שניהם, מה שהופך את העברת פרוסה קשה מאוד להגדיל את ההסתברות של מתיחה או פגיעה ברקמה.
    # כאשר בעזרת מברשת, לנסות שאר פרוסה אורך מבחינת ברחבי זיפים. גלישת את הפרוסה סביב קצה המברשת עשוי לגרום רקמה מיותרת מתיחה.
  2. העברת פרוסות המוח אל החדר שבו הם מחזיקים טובל מחומצן Ca 2 + המכילים ACSF. בהדרגה להעלות את טמפרטורת החדר של ° 27-32 ° C (1 ° כל חמש דקות). אפשר פרוסות כדי לדגור על 1-1.5 שעות לפני ניסויים אלקטרו.

5. לעורר וניהול רישומים CA3-CA1 התגובות Synaptic

  1. עבור הקלטות תאיים בסיסיים פרוסות חריפה, תחנת electrophysiology שלכם צריך לכלול *: חדר הקלטה, מערכת זלוף: מיקרוסקופ עם יכולת> הגדלה 4X, הקלטה, מגרה, ואלקטרודות הקרקע; מאקרו micromanipulators; נוקשה רטוט עמידים שולחן העליון כלוב פאראדיי, ממריץ, מגבר ו-to-Analog דיגיטליות (A / D) ממיר; אוסצילוסקופ (רצוי); למחשב האישי עם תוכנה מתאימה לרכישה.
    * קר מכשירים מדעיים מציעה מערכת פנטסטי וזול electrophysiology (כלומר מערכת הקלטה קר רקמות) לביצוע מגוון של ניסויים בסיסיים electrophysiology פרוסה. מערכת זו יש טביעת רגל קטנה, לגירוי ניידים מגברים, והוא יכול לשמש על תקן מעבדה ספסל ללא צורך של כלוב פאראדיי מגושם.
    כמובן, פרוסות המוח יכול לשמש גם לביצוע מספר רב של טכניקות אלקטרו הדמיה משוכללים, אשר דורשים ציוד וחומרים נוספים. למשל, תחנת הראשי שלנו electrophysiology מכיל מגבר עם מתח ומהירה מהדק הנוכחי יכולות, מערכת תאורה פלורסנט, ומצלמה דיגיטלית. תחנה זו משמשת הקלטות שדה תאיים על פרוסות המוח, כמו גם טלאי-clamp הקלטות הדמיה ניאון פרוסות בתרביות תאים 3,12,13. ראה לוח 3 לקבל רשימה מלאה של ציוד ורכיבים.
  2. בעזרת פיפטה בפה רחב או מברשת צבע קטנה, העברה אחד או יותר פרוסות לתא הקלטה * המאפשרים לו להסתגל 10-15 דקות לפני גירוי / הקלטה. במשך הלימודים שלנו, פרוסות שקועות ACSF והשאר על הרשת מוכנס לתוך תא RC-22 על ידי וורנר מכשירים (ראה איור 3). ACSF היא הכבידה-fed באמצעות הרגולטור להתאים את זרימת קצב, ו prewarmed עד 32 ° C על ידי תנור מיקרו מוטבעות לפני שהגיע לתא הקלטה. קו שואב אבק מרכזי משמשת להסרת ASCF.
    * סוגים שונים של הצוללת ממשק בסגנון חדרי הקלטה זמינים מסחרית. ראינו כי פרוסות התערוכה התגובות סינפטי חזק יותר בתא ממשק (פרוסה כלומר יושב ממשק עם אוויר humidified ו ACSF) 2,11. עם זאת, תגובתיות הוא בדרך כלל יציב יותר כאשר פרוסות שקועות ACSF. זלוף והתרופות גם יעיל יותר לתאי שהייה במים.
  3. מיקום מגרה הקלטה אלקטרודות. עם המבודד ממריץ או גירוי מופעלת, אך פלט שחויגו עד 0, בעמדה אלקטרודה מגרה על הפרוסה באזור שכבה radiatum של Ca2 סמוך לגבול CA3 (ראה איור 4). אנו משתמשים פלטינה אירידיום שזור חוט לספק 50-100 פעימות diphasic לנו CA3 שפר (SC) סיבי בטחונות. השימוש חוט פלטינה אירידיום וקטניות diphasic יכול לעזור קיטוב אלקטרודות ממוזער. תחתון אלקטרודה הקלטה לתוך CA1 שכבה radiatum, רק לשבור את פני השטח של הפרוסה. אלקטרודה הקלטה שלנו היא חוט Ag / AgCl ב ACSF מלא זכוכית micropipette (התנגדות קצה ~ 7 MΩ). סובבו את התפוקה ב ממריץ עד בינונית (שהצבנו המבודד הגירוי שלנו ~ 150 μA) ולהתחיל מתן פולסים הגירוי רכישת הפעילות באמצעות רכישת התוכנה, כגון Clampex מ"אקסון מכשירים, Inc לאט לאט להוריד את האלקטרודה מגרה ב קטן מרווחי עד artificact גירוי נרשם CA1. בשלב הבא, ממשיכים לאט נמוך גם מגרה הקלטה אלקטרודות במרווחים תוך רכישת CA1 התגובות עד מטח סיבים (ע"ע) ואת הפוטנציאל postsynaptic מעוררים (EPSP) אמפליטודות להגיע לרמות מקסימלי (ראה תרשים 4 ב).
  4. הקמת עקומת כוח הסינפטי ולחקור הפלסטיות הסינפטית. כדי ליצור עקומת כוח הסינפטי, ולספק פולסים גירוי כדי SC בעוצמות יותר ויותר גבוה ה שיאדואר פעילות מקבילה CA1. טווח ומספר רמות עוצמת הגירוי השתמשו עשוי להשתנות אבל צריך להיות מספיק כדי ליצור עקומת sigmoidal כאשר זמם נגד או FV או ערכים EPSP (איור 5). משרעת FV מספק אומדן מהימן של פרופורציה של סיבי presynaptic מופעל, בעוד המדרון EPSP מספק אמצעי מזוהמת של CA3-CA1 זרמים monosynaptic. שרטוט במדרון EPSP נגד FV פני רמות עוצמת הגירוי ולכן משקף את הגודל של EPSP לכל מספר afferents מופעל מספק אומדן מצוין של חוזק CA3 CA1 הסינפטי. בדרך כלל, רמות חוזק סינפטי מופחתים באופן משמעותי באזור CA1 של חולדות ומעלה APP/PS1 עכברים, חולדות צעיר יחסית וגיל בהתאמה wild-type עכברים למשל לראות 4,14.
  5. Slices כי להראות סימנים של בריאות לקויה (כלומר המשרעת המקסימלית EPSP <1 mV) או לרגשנות יתר (כלומר, את המראה של 2 או יותר קוצים האוכלוסייה) במהלך עקומת כוח הסינפטי אינן נכללות בניתוח סטטיסטי (ראה איור 4C). מצאנו כי פרוסות אלה לעתים רחוקות תערוכה התגובות יציבה על פני תקופה של 60 דקות ו / או להראות התגובות משתנה מאוד בעקבות אינדוקציה של הפלסטיות הסינפטית. זה ראוי לציין כי "פרוסות בריא" לפצות רק על 10-20% מכלל פרוסות הועבר לתא הקלטה. יתר על כן, הניסיון שלנו, תדירות זיהוי פרוסה בריא דומה מאוד בכל גיל, מין, ואת הגנוטיפ.
  6. להשרות הגברה לטווח ארוך (LTP) או ארוכת טווח דיכאון (בע"מ) של פרוסות. LTP ו LTD הן מגדילה טווח (LTP) ומפחיתה (בע"מ) בתפקוד סינפטי בתגובה דפוסים שונים של הפעלת הסינפסה. שני התהליכים האמינו רבים כדי לשקף מנגנונים קריטי ללמידה memory15 ולספק מדדי התוצאה שימושי לחקר מנגנוני הסלולר של חוסר תפקוד עצבי ו / או להערכת אסטרטגיות תרופתי עבור לטיוב גירעונות זיכרון ניוון מוחיים 16.
    על הניסויים הפלסטיות הסינפטית, לאפס את עוצמת הגירוי על כל הפרוסות על * 1 mV ולהתחיל גירוי הבסיס בתדר של Hz 0.033. ערכים EPSP מדרון צריכה להיות יציבה במשך לפחות 20 דקות לפני האינדוקציה של LTP או בע"מ. לעקוב מקרוב אחר EPSPs בתקופה זו ולאפס את עוצמת הגירוי אם המדרון משתנה יותר מ -10% ולהתחיל הבסיס החדש. להשרות LTP באמצעות רכבת שנייה אחת של גירוי 100 הרץ או צרורות קצרים מרובים (~ 10 פולסים) של גירוי 100 הרץ נתון כל 200 מילישניות. לזירוז בע"מ, לספק גירוי 900 פולסים בקצב של 1 הרץ. לאחר גיוס של LTP או בע"מ, לאסוף תגובות הסינפטי 60 דקות נוספות או יותר. ערכים EPSP מדרון שהושג לפני 60 דקות לאחר גירוי גבוה / נמוך תדר מושווים כדי לקבוע את הנוכחות של LTP או בע"מ.
    חולדות ועל בני APP/PS1 עכברים נוטים להראות LTP לקוי משופרת בע"מ (ראה איור 5), שינויים אלו הוצעו כדי לתרום קוגניציה לקויי אלה במודלים של בעלי חיים 6,16. עם זאת, בניגוד APP/PS1 עכברים, שינויים LTP / בע"מ בחולדות בגיל משתנה על פני מעבדות. חולדות בני בדרך כלל התערוכה רמות LTP דומה לעומת מבוגרים בתגובה לגירוי "עז" (כלומר 100 הרץ), אך גירעונות להראות כאשר פרמטרים משמשים גירוי מתון (כלומר תדרים גירוי נמוך יותר או פחות גירוי פולסים) (לסקירה ראו 4,6, 16). כמו כן, כמה מעבדות, כולל שלנו, הבחינו רגישות מוגברת אינדוקציה בע"מ בחולדות בגיל 2,17-19, בעוד קבוצות אחרות מצאו שום הבדל או רגישות מופחתת בבעלי חיים בגיל שלהם. כפי שנדון בקצרה להלן (ראה דיון), הבדלים דקים אך קריטי פרוטוקול הניסוי עשוי להסביר פערים אלה.
    * עוצמת הגירוי משרעת EPSP יכול להשפיע על זירוז LTP ועלול להיות גורם חשוב של תוצאות סותרות בספרות. זה ייחשב עוד במדור דיון.

6. נציג תוצאות

העבודה שלנו, ולעבוד מקבוצות אחרות, עולה כי שינויים איתות astrocyte מבוססי דלקתיות עשוי לעורר ו / או לזרז את תפקוד נוירולוגי במהלך ההזדקנות לספירה 13,20,21. לאחרונה, השתמשנו חוזק סינפטי, LTP ו LTD כאמצעים נקודת הסיום כדי לחקור את יעילות מנגנוני הפעולה של מספר אנטי דלקתיות ריאגנטים רומן באמצע בני APP/PS1 עכברים (ראה 22 לתיאור של המודל הזה) ואת בני פישר 344 חולדות. התוצאות להלן התקבלו באמצעות פרוטוקולים המתואר במאמר זה.

אחד רומן אנטי דלקתיות adeno הקשורים ויראלי (AAV) ריאגנטים שפותח על ידי המעבדה שלנו הוכח במחקרים טייס להגדיל באופן משמעותי את כוח הסינפטי (p <0.05) ולמנוע גירעונות LTP (p <0.05) באמצע בני (16 בן חודש) APP/PS1 עכברים (n = 4-6 פרוסות לכל מצב הטיפול). נציג כוח עקומות הסינפטי וניסויים LTP משתי פרוסות שונות, קולected מהעכבר 16 בן חודש באותו APP/PS1, מוצגים באיור 5A-C. פרוסה אחת היה שחולצו מן האונה שטופלו רומן AAV שלנו (מגיב), בעוד פרוסה אחר טופלה מגיב AAV שליטה (Control). LTP היה מושרה בשתי פרוסות באמצעות שתי רכבות 1 שניות של גירוי 100 הרץ (10 שניות intertrain אינטרוולים). שים לב כי עקומת כוח הסינפטי עבור מגיב שטופלו פרוסה מוסט לצד שמאל של הפרוסה שליטה, מעיד על חוזק סינפטי גדול. בנוסף, שים לב, אופייני אמצע בגילאי APP/PS1 עכברים, רקובים LTP במהירות הבסיס של הפרוסה שליטה (למשל 23). לעומת זאת, רקובים LTP מעט הפרוסה שטופלו מגיב הרומן שלנו.

במחקר שנערך לאחרונה השני, צפינו בע"מ משמעותי ברכב חולדות שטופלו בגיל (85% של טרום בע"מ הבסיס, p <0.05). לעומת זאת, בע"מ לא נצפתה אצל חולדות שטופלו בגיל "סמים" רומן אנטי דלקתיות (97% של הבסיס טרום בע"מ, לא משמעותי). תופעות לא סמים על חוזק סינפטי נצפו. נציג ניסויים בע"מ ממערכת נתונים אלה (n = 80-10 חולדות לכל קבוצה) הם באיור 5D-F.

איור 1
באיור 1. כלים וחומרים המשמשים לניתוח מוח. מגבת נייר. ב ', להב סכין המנתחים. C, Beebee מספריים. D, העצם rongeurs (עבור חולדות). E, rongeurs העצם (על עכברים / חולדות). F, כפית פלסטיק. G, פיפטה העברת פלסטיק. H, כלי בהיפוקמפוס. אני, מרית. J, מספריים כירורגיות. K, צלוחית זכוכית שהיתה.

איור 2
איור 2. פרוסת המוח מותאם אישית מחזיק קאמרית., Macrochamber. B, המכסה. C, מאגר H 2 O עם צינורות סיליקון מחורר. D, microchamber. E, צינור ACSF המסירה (פוליאתילן). F, צינור 2 O הלידה. G, יציאת בקרת טמפרטורה. H, הכנס microchamber מרושת.

איור 3
איור 3. RC22 קאמרית שהייה במים. קאמרית, הקלטה. B, אלקטרודה קרקע. C, מחט שאיפה.

איור 4
איור 4. פרוסה איור בהיפוקמפוס גל תאיים. קריקטורה, קטע בהיפוקמפוס רוחבי השתמשו בניסויים electrophysiology. CA = cornu Ammonis. DG = משוננת gyrus. SC = בטחונות שפר. S = radiatum שכבה radiatum. B, גירוי חשמלי של SC (האקסון CA3 בדרכי) מעורר חפץ גירוי, כמעט מיד לאחר ספייק אוכלוסייה presynaptic, או צרור סיבים (ע"ע). משרעת של FV עומד ביחס ישר במספר סיבי SC הופעל. השיפוע של שלב שלילי מתמשך של הפוטנציאל בתחום מעוררים postsynaptic (EPSP) תואמת ישירות ההפעלה של depolarizing זרמים סינפטיים ב CA1 עצב פירמידליים בתגובה גלוטמט שחרור מסופי SC. C, חופפים גל תאיים נציג נרשם CA1 שכבה radiatum בתגובה לתשע רמות שונות עוצמת הגירוי (30-500 μA) ב (פאנל משמאל) "בריא", "לא בריא", ופורסים "hyperexcitable". חמש גל היו בממוצע לכל רמה. פרוסות בריא להגיב באופן דינמי על פני טווח זה הגירוי תערוכת יחיד חיובי מתמשך האוכלוסייה ספייק (המשקף CA1 פריקה עצבי) ברמות גירוי גבוה יותר. בתא RC22 הטבילה, EPSPs מקסימאלית בדרך כלל נע בין 1.5 ל 3 mV ב משרעת. פרוסות לא בריאה (פאנל באמצע) לעיתים קרובות תערוכה FV גדול, אבל EPSP מקסימלי קטן (<1 mV) ובדרך כלל להראות גמישות ירודה. פרוסות Hyperexcitable (פאנל מימין) להראות שניים או יותר קוצים האוכלוסייה משובי באיבר עולה של EPSP. התגובות של פרוסות hyperexcitable לעיתים קרובות יציב והם מושפעים על ידי גירוי variably בע"מ / LTP.

איור 5
איור 5. נציג electrophysiology ניסויים שבוצעו על פרוסות חריפה מאמצע בני (16 חודש) APP/PS1 עכברים בני (22 חודש) פישר 344 חולדות. פאנלים א.ב. הנתונים שנאספו מראים APP/PS1 העכברים שטופלו שליטה adeno הקשורים (AAV) ויראלי לבנות (Control) או מגיב רומן AAV (מגיב), אשר פותחה על ידי קבוצת במעבדה שלנו. יחסית נתח השליטה, הפרוסה שטופלו מגיב תערוכות שינוי שמאלה המסומנים ב EPSP: FV עקומה (A) מעיד על חוזק סינפטי גדול. פרוסה מגיב-A-התייחסו גם מראה LTP איתנה ויציבה (ב) לאחר מסירה של שני 1 שניות, 100 רכבות הרץ גירוי, בעוד נתח השליטה תערוכות LTP לקוי, טיפוסי של מודל זה החי. לוחות DF הנתונים שנאספו מראים שני עכברושים בני אדם שקיבלו כרונית (4 בשבוע) perfusions intrahippocampal של הרכב או תרופה חדשנית אנטי דלקתיות (תרופות). חוזק סינפטי בסל היה מושפעים יחסית על ידי טיפול תרופתי(ד). עם זאת, התרופה היה יעיל מאוד במניעת גיוס בע"מ (E). לוחות C ו-F להראות נציג EPSP גל רשמה פרוסות בודדות לפני (קדם) ו 60 דקות אחרי (הודעה) המסירה של גירוי LTP / בע"מ. שים לב חפצים גירוי אינם מוצגים.

Discussion

הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה יעזור להבטיח כי והניתוחים המוח מתבצעות לפחות במהירות וביעילות בגיל, כמו חולדות מבוגרים צעירים. כמו כן אנו מספקים פירוט מספיק המתחיל להקים מחקרים משלהם פרוסה על LTP ו LTD. אם חקירה נוספת של הזדקנות לספירה שינויים בתפקוד הפלסטיות הסינפטית הוא אחד היעדים שלך, יש לפחות שתי בעיות מתודולוגיות אחרות, שנאמר לעיל, כי מגיע שיקול נוסף. ראשית, מספר מעבדות הראו כי Ca 2 +: Mg2 + יחס הקלטה ACSF יכולה להיות השפעה ניכרת על הפלסטיות הסינפטית אינדוקציה בתוך פרוסות בהיפוקמפוס 2,10,24,25. ב CSF היונקים, Ca 2 +: Mg2 יחס + הוא בערך (למשל לראות 26). עם זאת, ACSF Ca 2 +: Mg2 + יחס קרוב 2 משמשים בדרך כלל מחקרים פרוסה של הפונקציה ואת הפלסטיות הסינפטית. במחקרים הראשונים, הנוהג הזה היה מותאם כנראה כדי לייעל את האינדוקציה של LTP, אז לאחר מכן הפכו לדבר שבשגרה עבור כל המחקרים הפלסטיות. עם זאת, בפועל זה יכול להיות בעייתי במחקרים הזדקנות לספירה בגלל הבדלים היטב מאופיין ב Ca העצבית תקנה 2 +. באופן ספציפי, Ca 2 + ו - זרם / או Ca 2 +-Induced Ca 2 + שחרור מוגבה בחולדות בגיל ו / או מודל עכברים לספירה במהלך ההפעלה העצבית 3,27-31. אינדוקציה של בע"מ הוא רגיש במיוחד שינויים עדינים ACSF Ca 2 + רמות. שלנו פרוטוקול, אשר משתמשת 2mm Ca 2 + ו - 2 מ"מ Mg2 +, בדרך כלל תוצאות בע"מ עבור בני, אבל לא צעירים בעלי חיים מבוגר 2, ואילו מחקרים באמצעות Ca 2 +: Mg2 + יחס קרוב יותר לשני, הבחינו בע"מ חזקים מבוגרים העדר הבדל גיל 2,10 או בשילוב עם בע"מ מופחת בחולדות בגיל 32. תצפיות אלו מדגישים את הצורך לשקול היטב ACSF Ca 2 + ו - Mg2 + רמות כאשר משווים Ca 2 + תלויי פלסטיות בבעלי חיים מבוגרים בגילאים צעירים.

הבעיה המתודולוגית השנייה נוגעת תלות חזקה של LTP על שלילת קוטביות postsynaptic 33 ואפשרי הזדקנות / גנוטיפ הבדלי חוזק סינפטי. בניסוי LTP הבסיס טיפוסי, עוצמת הגירוי LTP מותאם בדרך כלל לייצר וחצי מקסימלי (או שלושה רבעים מקסימלית) משרעת EPSP. הבעיה היא כי פוטנציאל חולדות ומעלה APP/PS1 עכברים בדרך כלל מופחת להראות חוזק סינפטי יחסית עמיתיהם הצעירים ו / או פרא שלהם סוג, כלומר EPSP ערכי הבסיס יהיה גם קטן יותר אצל חולדות ומעלה APP/PS1 עכברים. EPSPs קטנים עשויים לתרגם שלילת קוטביות פחות במהלך גירוי LTP, וכתוצאה מכך ההסתברות מופחת עבור גרימת LTP 33. בגלל לבלבל את הפוטנציאל הזה, קשה לקבוע אם החיות האלה התערוכה גירעון התפוקה, גירעון פלסטיות או שניהם. כלומר, מנגנונים אינדוקציה ב-LTP בגיל ו / או APP/PS1 עכברים עשויה להיות שלם פונקציונלי (אין הגירעון הפלסטיות), אך מגורה מספיק (גירעון התפוקה) בתנאים אלה. הבחנה זו היא קריטית, כמו מנגנונים התפוקה מנגנונים פלסטיות עשויים להגיב בצורה שונה לטיפול תרופתי ספציפי. אנחנו מנסים למזער את ההשפעה של הפחתת התפוקה על ידי אינדוקציה LTP נרמול את המשרעת EPSP באותה רמה (למשל 1 mV) פרוסות על פני כל גירוי לפני LTP. אסטרטגיות אחרות עשויות להיות יעילות גם כן (למשל, שימוש של מתח או מהדק הנוכחית להשוות את פוטנציאל הממברנה בקבוצות במהלך גירוי LTP), וכן יש לשקול כאשר חוקרים LTP אלה במודלים של בעלי חיים.

Disclosures

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות Leica Microsystems.

Acknowledgements

העבודה נתמכת על ידי NIH AG027297 מענק, פרס מחוט השדרה קנטאקי ואת פגיעת ראש אמון המחקר, מתנת קרן Kleberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Fisher Scientific BP366-500
KH2PO4 (monobasic) Sigma-Aldrich P5379-100G
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643-500G
CaCl2 (dihydrate) Sigma-Aldrich C3306-250G
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500
C6H12O6 (dextrose) Fisher Scientific BP350-1
Table 1. Reagents required
Erlenmeyer Flasks Fisher Scientific FB-500-2000 FB-500-1000
Aquarium Bubbler Used for oxygenating media. Available at most pet stores
50 mL Glass beaker Fisher Scientific 02-540G For brain storarge in ACSF
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Small Animal Guillotine World Precision Instruments, Inc. DCAP-M
Flat paper towel
#11 Feather surgical blade Fisher Scientific 08-916-5B
Beebee bone scissors Fine Science Tools 16044-10
Lempert Rongeurs Roboz Surgical Instruments Co. RS-8321 Use for rats
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16020-14 Use for mice or rats
Hippocampus tool Fine Science Tools 10099-15
Spoon A plastic teaspoon will do
Spatula Fisher Scientific 21-401-25A Spatula
Surgical iris scissors Fine Science Tools 14058-09
plastic transfer pipets Fisher Scientific 13-711-43
110mm Whatman filter paper Fisher Scientific 09-805E Whatman cat. 1001-110
Glass petri dish Fisher Scientific
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome Vibratome VT1000P
0.1mm FA-10 Feather S blade Ted Pella, Inc. 121-9 0.1mm FA-10 Feather S blade
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) Fisher Scientific 13-678-20A For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening
35 mm Polysterine Culture dish Corning 430588 Used for collecting slices after dissection
Table 2. Tools and materials for dissection
Holding chamber Custom Made
P-97 Horizontal Pipette Puller Sutter Instrument Co.
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corp.
Faraday cage Custom Made
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm Corning 1220-1L
Gravity-contolled IV set with regulator Baxter Internationl Inc. 2C8891
Central Vacuum Line Available in most modern labs
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix Scott-Gross Co.
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery Fisher Scientific Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes.
Eclipse E600FN Microscope Nikon Instruments with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters
Cool Snap ES Digital Camera Photometrics Cool Snap ES Digital Camera
X-Cite Fluorescent Illuminator EXFO X-Cite Fluorescent Illuminator
Microscope Platform Siskiyou, Inc. Custom assembled
RC-22 Submersible recording chamber Warner Instruments 64-0228 Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner)
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller Cell Microcontrols
4 Axis Manual Miniature manipulator Siskiyou, Inc.
Platinum Iridium Wire (0.002 in) World Precision Instruments, Inc. PTT0203
A365 Stimulus Isolator World Precision Instruments, Inc. A365 Stimulus Isolator
Multiclamp 700b Amplifier Axon Instruments
Digidata 1322A A/D converter Axon Instruments
PClamp software Axon Instruments
Personal Computer (Pentium 4) Dell
Table 3. Electrophysiology equipment and materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
  2. Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
  3. Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
  4. Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
  5. Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
  6. Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
  7. Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
  8. Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
  9. Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
  10. Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
  11. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  12. Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
  13. Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
  14. Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
  15. Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
  16. Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
  17. Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
  18. Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
  19. Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
  20. Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
  21. Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
  22. Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
  23. Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
  24. Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
  25. Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
  26. Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
  27. Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
  28. Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
  29. Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
  30. Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
  31. Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
  32. Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
  33. McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).

Comments

30 Comments

  1. A great protocol and discussion. What kind of stimulating electrode do you use?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 12:16 PM
  2. Thank you Louise. We use platinum iridium wire to make a bipolar electrode. The last time we purchased this wire we used World Precision Instruments (cat # ptt050²). Let me know if you need any other info

    Reply
    Posted by: chris n.
    May 3, 2011 - 12:54 PM
  3. Great protocol. However, I have got a problem. I can observe huge fiber volleys but with small or no EPSPs. Do you know what could be the problem? Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:57 AM
  4. Hi Olivier. Thanks for the kind words. In re to huge FVs and small EPSPs...Sometimes the fix can be as simple as tweaking the placement of your stimulating and recording electrodes (e.g. adjusting the depth and distance between trodes). However, if you've tried this and are still having problems there are a few possibilities. It could be that the tissue is being damaged and/or mishandled during the dissection/slicing procedure. As we mentioned in the protocol above, tissue from old animals and amyloidogenic animals tends to be a little more vulnerable to damage caused by the slicing procedure. If you haven't already, you may try dissecting a young adult mouse/rat (31 C). EPSPs are generally smaller at colder temperatures. 3)Make sure the pH of the incubation/recording medium is between 7.35 and 7.45. In the past, I've found that slices tend to exhibit big FVs and small EPSPs when they're sitting in media with a low pH (<7.3). 4) Make sure the slices are getting oxygenated efficiently DURING incubation, else they will die :). Usually, if oxygenation is good during incubation, but poor during the recording, the slices start off looking good but then become hyperexcitable as the experiment progresses. I hope this info helps. If you've tried all these fixes with no luck, feel free to email me.

    Best,

    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 11, 2011 - 12:52 PM
  5. Hi Chris,

    Thank you very much for your response but I think still need to bother you again. Indeed, it dŒs not seem to be related to the age of the animals. I think my slice are ok even if I use a McIlwain slicer. Indded, I had some responses last week (from 0.² to ² mV with immerged slices). Artefacts and fiber volleys were small compared to the responses. Now I can't see anymore proper responses (or very rarely) and as I said before, the amplitude of the fiber volley is huge (0.5-² mV) even for small stimulations. Moreover, it has two components a positive and a negative one. The artefact of stimulation became incredibly huge e.g 35 mV for a 100 us stimulation at 500 uA. Would you have any suggestion? I will test my headstage with the model cell. Thank you very much.

    Best regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 2:42 PM
  6. Hi Olivier, sorry for the late response. If you wanted to send me a picture of your EPSP waveforms to my email address (should be listed somewhere above or on the .pdf), I'd be happy to take a look at them. If you send this to me, please include information on the type of stimulator unit and electrodes your using as well as your ACSF composition.
    Best,
    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 18, 2011 - 12:12 PM
  7. Dear Chris,

    I have finally found the solution. Everything is working perfectly now. It was an issue with the glue I used for my holding chamber. Thank you again for your precious help.

    Kind regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 19, 2011 - 5:18 AM
  8. Dear Olivier,
    I am having the exact same problem as you. Would you please be more specific about how you were able to correct it? It would be so helpful!
    Best regards,
    Cristiane

    Reply
    Posted by: Cristiane T.
    July 12, 2012 - 11:58 AM
  9. Dear Cristiane,

    As explained in me previous message my problem of poor viability and small responses was related to the holding chamber to keep the slices at 35°C before experimenting. However, low viability can be due to many other reasons. You should work fast, in presence of AMPA and or NMDA blocker (or low sodium solution). You should avoid to fold the hippocampal tissues etc....

    Hope it will help.

    Reply
    Posted by: Olivier P.
    July 16, 2012 - 4:12 AM
  10. Hi every body, i was really so glad when i see your web site, and i want offer my thanks for your great site.
    i am from shefa neuroscience research center in iran where managed by proff. ALI GORJI who one of the first person worked on spreading depression in the world.
    i am working on Spreading Depression too and use LTP technique.
    please contact with me by e-mail for Future cooperation.
    Best Regard
    ahmad ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2011 - 10:56 AM
  11. Hi, I got a problem with my hippocampal slice recording. When I just transferred my slices from that incubation beaker into recording chamber, a large fEPSP response can be recorded, but after sitting in that chamber for a while, the response tended to become smaller even disapper compared with that when slices were just put in chamber. I have tried to adjusted the rate of oxygenation and temperature to ensure sufficient oxygen supply and correct temperature. I can garantee that oxygen supply has no problem and temperature is in normal range (²6 -30 C). But the problem is still there. Somebody told me that is cause by a "heat shock" when slices are transferred to a warmer enviornment. Can you help to resolve this problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2012 - 7:03 PM
  12. hi, you should put your slice in chamber(²8- 30c) for 1 hour after you get slice. And after that you should transfer your slice to second chamber( LTP chamber) in 3²c.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 3, 2012 - 11:48 AM
  13. Hi,

    I suppose you can't record at 35°C, don't you? May be the problem is that your slice moves slightly during the recording. Did you try to change the position of your recording electrode to see if you can recover a response with the initial amplitude?

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 1:21 PM
  14. Yes, I did. I move the recording electrode to several different positions trying to elicite a good amplitude. But the problem is still there. I have noticed that after sitting in the recording chamber for a while, the slices tended to lost activity. No matter where you put the recording electrode, you cannot recover a good amplitude as the initial one. I suspected that was caused by a slow flow rate, which is 1.5-² ml/min in my chamer. My chamer is different from others, because I currently use a blind method to record fEPSPs and eEPSCs. So my chamber is bigger than others with approximately 1-² ml volume for fluid exchange. I am trying to increase that flow rate to ².5-3 ml/min to see what will happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 3:26 PM
  15. Hi, sorry to hear about the problems you're having. Are your slices submerged in the recording chamber or at an interface with the air? Is your stimulus artifact changing, or just the synaptic response? What about the fiber volley, dŒs it die too? How do you know that the oxygen levels in your media are adequate? If your recording chamber is wide and your bath shallow, that would provide quite a bit of surface area for the oxygen to escape. Testing the bath pH with a micro pH meter would help determine if O² levels are stable. If you're worried about heat shocking the slice when you transfer it to the recording chamber, you could try slowly bringing the temperature of the media in your holding chamber up to recording temperature during the incubation period (maybe raising it 1 or ² degrees every 10-15 min).

    Reply
    Posted by: chris n.
    January 17, 2012 - 3:56 PM
  16. Hello again, I want to know the distance between stimulating electrode and recording one in your experiments. Some people put them in a very short distance (²00-300 micrometers). In my experiments, I usually put the stimulating electrodes at the initial part of the schaffer collateral fibers in CA1 area, and put that recording ones at a site as far as possible to avoid the large artifacts, but sometimes I was unable to get a stable LTP after HFS. I believe the reasons for that might be that many neural circuits are activated during HFS including inhibitory ones, because more circuits can be activated simultaneously with the increased distance. Is that correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 5:03 PM
  17. I need more detail, since I am still facing some problem.

    Reply
    Posted by: Zaman K.
    February 9, 2012 - 2:38 AM
  18. Finally, I found out the problem that leads to loss of viability of the hippocampal neurons in my experiment. It was caused by my chamber, which is so different from others. It has a very large volume, with a large surface. So I was assuming that my problem was caused by the anoxia resulted by rapid diffusion of ACSF into the large shallow surface. I already increase the flow rate to ².5 ml/min in my previous chamber, but still had that problem. So I made a polycarbonate slice chamber according to Warner company's criteria. Now I can get a pretty stable response throughout my experiment.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:02 PM
  19. What is the significance of air interface vs. submerged slices, is one better than the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:38 PM
  20. BTW, the criteria to judge the anoxia is the production of bubble in the chamber. If you see the bubble present in the chamber, that means the ACSF is oxygen-saturated. Heating makes the extra oxygen escape from the solution. If not, the ACSF is not saturated by oxygen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 3:10 PM
  21. Good for morale to read that I'm not the only one having problems with acute slices. Due to the comments above I'm going to try a few new things with my set-up. It MIGHT just be the oxygen-saturation, since I pre-heat the ACSF to 4² Celsius, trying to record at ~34 Celsius AND have a relative large chamber. Temperatures are experimental variables of the design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 28, 2012 - 11:15 AM
  22. Increasing the perfusion rate to 4 ml/min and changing to a bath that is diamond shaped and has a far lower volume were the solution. Getting a decent signal is still something of a black magic. =/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 7:14 AM
  23. Thank you for sharing your protocol - excellent video.

    Is there an advantage to dissecting out the hippocampus before slicing, as opposed to slicing the whole brain (or one hemisphere of the brain)?

    If I am not mistaken, you cite "netting" in the bottom of the recording chamber. DŒs that mean that the slice is suspended off of the bottom of the chamber?

    Is the resistance of the recording pipette a critical factor?

    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2012 - 5:33 AM
  24. Hi Chris, sorry for the late reply. For rats, whole hemisphere slices are fairly large and can be a bit of a problem if you have small recording and holding chambers. Also, the hippocampus in an adult rat is fairly easy to dissect away. For mice, on the other hand, the hippocampus is very small and a little trickier to dissect out (though it can certainly be done effectively). You can therefore save time by simply slicing the whole mouse hemisphere into sections. And unlike the rat, whole hemisphere mouse slices aren't so big that they are difficult to work with and store. In re to netting: yes we do use netting, which raises the slice off of the bottom of the dish. In re to the recording pipette resistance: we typically use smaller tip diameters to minimize damage to the recording region of the slice.

    Reply
    Posted by: chris n.
    June 19, 2012 - 4:36 PM
  25. Hi, Prof. Norris:
    Great protocol to follow and precious comments to refer to. As a beginner to this tech, I have a few questions in my mind.
    1. Some papers claimed that they used sucrose-ACSF(0 Na 0 Ca) as the dissection medium, some even put AMPAR/NMDAR blocker(i.e. Kynurenic acid) and/or ascorbic acid in. According to your experiences, is there any difference btw sACSF and normal ACSF to the slice health? Is postsynaptic blocker and/or ascorbic acid necessary?
    ². In some literatures, they used different ways of anesthetization, such as barbiturates, TCA, ether, isoflurane, halothane etc. DŒs anesthetizing method affect the slice quality and the electrophysiological results? In this paper, you used CO², were there any possibility that the brain might get some anoxia-like influence or damage?
    3. For holding and recording temperatures, I found variable ways in different papers, is there any general principle of how to set the proper temperatures? In your paper, after slicing all the brain sections(put in ice cold 0Ca ACSF temporally), and tranfering them to ²7degree and gradually elevating temperature, is my understanding correct? Could you please tell me how much time will each step take(i mean, "cutting"->"temporally storage"->"recovery solution")?
    4. What are the proper cutting speed (mm/min) and vibrating frequency for hippocampal slices?
    5. what cutting direction is proper? longitudinally from CA3 corner to DG corner or the opposite, or laterally across hippo? or it dŒsn't matter?
    Thanks so much!
    sincerely,
    Hang

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:13 PM
  26. I have another question:
    6. In re to literatures, some used bipolar twisted electrodes and some used concentric electorde, do you have some comments to these two types?

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:21 PM
  27. i am very interesting the custom brain slice holdiing chamber, would you mind sharing the supplier?
    Thank you.

    Reply
    Posted by: CHIA S.
    March 26, 2013 - 3:23 AM
  28. Hi,

    I was very excited when I came across this video/article today, since my Masters project is going to be entirely based on recording after LTP induction on adult mouse hippocampi in vitro.

    I have just started trying to obtain decent slices, and have only gotten so far as extracting the brain from the mouse with acceptable quality. All that comes after has been a little bit frustrating so far. So, I have a few questions regarding the slicing step itself (we have the very same vibratome at our lab, which makes things easier, I guess!):

    - Every time I try to slice the brain, the blade actually pushes the brain away instead of cutting through it! This leads to either a completely useless slice or not even that, as the blade will only cut the last few milimiters of the brain and yield something not even worth calling a slice! The blades are brand new, but I bought them at a drugstore and they were intended to be shaving blades. Might that be the issue, a blade not sharp enaugh?

    - I haven't yet tried separating the hemispheres. Maybe I should do that!

    - I see you use this little block onto which you glue the brain (hippocampus, in your case). I've been using a sort of plate attached to the vibratome, which gŒs in the same place as the block. Do you reckon the block is a better call?

    - Do you have a better method for drying the cutting chamber after using it than letting the ice thaw and then sucking it up with vacum?

    If there are any remarks you should think of that haven't been shown in the video regarding the actual slicing step, I'd apreciate if you could share!

    Best regards,

    Thomaz Dias
    UFMG - Brazil

    Reply
    Posted by: Thomaz L.
    March 28, 2013 - 5:16 PM
  29. Great information here. I have a quick question about the aCSF containing bottle; would you keep it at room temperature or in a water bath at 34 degrees C?

    I will be recording at 34 degrees with a recording chamber heater and was wondering what would be the best way to hold the aCSF that is coming into the chamber?.

    I know there is an inverse relationship with dissolved oxygen and temperature in water, but would it be better to have it constant in the bottle and chamber or best to have it room temperature in the bottle and warm upto 24 degrees in the chamber?

    Any advice would be much appreciated.

    Minos

    Reply
    Posted by: Minos K.
    July 12, 2013 - 11:50 AM
  30. Hi
    Your projects are amazing. Oh here I can’t help sharing some experience of fabrication after designs done.
    We are working with a OverMolding vendor in China the name is Zetar Industry (http://www.zetarmold.com), Located in Shanghai China (a very big modern city). They are really good.Moving fast and very professional. They helped me with my new design. I asked them to do the injection mold, then Injection Moldingmass production. I was surprised by their rich experience in Insert Molding
    and punched lead time. Guys in Zetar deserve every good word just as you are.

    Reply
    Posted by: info z.
    September 2, 2013 - 11:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats