Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

Published 3/23/2011
30 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience
 

Summary

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Cite this Article

Copy Citation

Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330, doi:10.3791/2330 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het knaagdier hippocampus plak voorbereiding is misschien wel de meest breed gebruikte tool voor het onderzoek van zoogdieren synaptische plasticiteit en functie. De hippocampus kunnen snel en eenvoudig worden geëxtraheerd uit ratten en muizen en plakjes levensvatbaar te blijven voor het uur in zuurstofrijk kunstmatige cerebrospinale vloeistof. Bovendien zijn fundamentele electrophysisologic technieken makkelijk kan worden toegepast voor het onderzoek van synaptische functie in de hippocampus plakjes en hebben enkele van de beste biomarkers voor cognitieve stoornissen. De hippocampus slice is vooral populair voor de studie van synaptische plasticiteit mechanismen die betrokken zijn bij leren en geheugen. Veranderingen in de inductie van de lange termijn potentiëring en depressie (LTP en LTD) van synaptische werkzaamheid in hippocampale plakken (of het gebrek daarvan) worden vaak gebruikt om de neurologische fenotype van cognitief-gestoorde dieren en / beschrijven of om het werkingsmechanisme van de te evalueren nootropische verbindingen. Dit artikel schetst de procedures die we gebruiken voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met hersen veroudering en de ziekte van Alzheimer (AD) 1-3. Het gebruik van oude ratten en AD model muizen kunnen presenteren een unieke reeks uitdagingen voor onderzoekers gewend zijn aan het gebruik van jongere ratten en / of muizen in hun onderzoek. Oude ratten hebben dikkere schedels en harder bindweefsel dan jongere ratten en muizen, die de hersenen extractie en / of dissectie kunnen vertragen en daarmee ontkennen of overdrijf echt leeftijdsgebonden verschillen in de synaptische functie en plasticiteit. Veroudering en amyloid pathologie kan ook verergeren hippocampus schade tijdens de dissectie procedure, opnieuw complicerende eventuele gevolgtrekkingen getrokken uit fysiologische beoordeling. Hier bespreken we de stappen die tijdens de dissectie procedure om deze problemen te minimaliseren. Voorbeelden van synaptische reacties verworven in "gezond" en "ongezonde" segmenten van ratten en muizen zijn voorzien, alsmede representatieve synaptische plasticiteit experimenten. Het mogelijke effect van andere methodologische factoren op de synaptische functie in deze diermodellen (bijvoorbeeld het opnemen van componenten van de oplossing, stimulatie parameters) worden ook besproken. Terwijl de focus van dit artikel is op het gebruik van oude ratten en transgene muizen, beginners tot fysiologie slice moeten vinden genoeg detail hier aan de slag met hun eigen studies, met behulp van een verscheidenheid aan diermodellen.

Protocol

1. Voorbereiden van Ice-koude Zuurstofrijk Artificial cerebrospinale vloeistof (ACSF)

  1. Bereid 2 L van "Ca 2 +-vrij" ACSF. In een 2L erlenmeyer, voeg ongeveer 1,5 L van steriele of dubbel gedestilleerd H 2 O, en beginnen onder krachtig roeren op een roer plaat. Voeg de volgende ACSF componenten (in mm): 124 NaCl, 2 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3 en 10 dextrose (zie tabel 1). Brengen tot een volume van 2 L met gedestilleerd H 2 O.
  2. Met behulp van een aquarium bubbler en slangen aangesloten op een 95% O 2 / 5% CO 2 de lucht tank, zuurstof ACSF krachtig gedurende ongeveer 20-30 minuten. Controleer de pH en, indien nodig, aan te passen aan 7,4 met NaOH of HCl.
  3. Giet 750 ml van zuurstofrijk Ca 2 +-vrij ACSF in een aparte erlenmeyer, dek de opening af met parafilm, en transfer naar een ultrafreezer (-80 ° C) gedurende 20-30 minuten. Deze media zal gebruikt worden voor dissectie van de hersenen en acute hippocampus plakken *. Voeg 2 mM CaCl 2 om de resterende 1,25 L volume van ACSF #, goed roeren, en oxygenatie met 95% O 2 / 5% CO 2 te hervatten. Deze media zal worden gebruikt voor het opslaan van de hersenen plakjes na dissecties, en voor perfuseren plakken tijdens de elektrofysiologische opnamen.
    * Ice-koude Ca 2 + vrije media wordt gebruikt om de stofwisseling vertragen en Ca 2 +-afhankelijke excitotoxiciteit te minimaliseren tijdens de dissectie.
    # Veranderingen in de Ca 2 + ontregeling bij het ​​ouder worden en AD kan een grote impact hebben op de inductie van Ca 2 +-afhankelijke synaptische plasticiteit 4-9. Tegenstrijdige rapporten over leeftijdsverschillen in LTD kunnen deels toe te schrijven aan het gebruik van verschillende ACSF Ca 2 +: Mg2 + ratio's tijdens de slice-opnamen (zie 2,4,10). Het belang van Ca 2 + regeling en de ACSF Ca 2 +-niveau in veroudering studies wordt behandeld in meer detail in de discussie sectie.
  4. Terwijl de Ca 2 +-vrij ACSF is bevriezen, bereiden een holding kamer voor het onderhoud van de hersenen plakjes voor en tijdens elektrofysiologisch opnames *. We maken gebruik van een aangepaste macro-holding kamer die vier individuele microchambers (zie figuur 2) bevat. De macrochamber is gevuld met een steriele, zuurstofrijke H 2 O en de microchambers zijn in wezen eilanden die uitsteken boven het wateroppervlak. Binnen elke microchamber, plakken rust op gesaldeerd invoegen in een ondiepe poel van zuurstofrijk ACSF. Slices zijn niet volledig onder water, maar zitten op een interface met de bevochtigde lucht. Een geïsoleerde verwarmingselement in de macrochamber zorgt voor temperatuurregeling.
    * Verschillende soorten van het bedrijf kamers zijn ook commercieel verkrijgbaar (bijv. Warner Instruments biedt een onderdompeling-stijl "Pre Kamer # BSC-PC) en moet geschikt zijn voor gebruik in de veroudering en transgene muizen slice studies. In een snuifje, kan schijfjes worden gehandhaafd voor enkele uren in een kleine petrischaal gevuld met ACSF. Maak een klein gaatje in het deksel van een petrischaal zuurstof levering buis. Zorg ervoor dat zuurstof belletjes niet fysiek de plakjes schudden. Slices voldoende zuurstof krijgen als de buis is verhoogd tot net boven het ACSF oppervlak (gas dispersie moet leiden tot een inkeping in de vloeistof oppervlak).

2. Brain verwijderen en de hippocampus Dissection in Aged (> 20-maanden-oude-ratten)

  1. Bereid de dissectie gebied * naast een grote wastafel (zie figuur 1 en tabel 2). Plaats een klein dier guillotine in de gootsteen en de lay-out chirurgische instrumenten en materialen voor de hersenen verwijderen en de hippocampus dissectie met een opgevouwen papieren handdoek, een # 11 scalpel, beebee schaar, bot rongeurs, een "Hippocampus gereedschap" (een gespecialiseerd dual spatel uit fijne chirurgische instrumenten), kleine chirurgische schaar, een dunne double-ended spatel, plastic Pasteur pipet, 110 mm diameter Whatman filter papier, een deksel 100 mm glazen petrischaal gevuld met ijs, en een plastic lepel. Houd ook een plastic zak in de buurt voor de verwijdering van het karkas.
    * Brain-extractie moet worden ingevuld zo snel mogelijk, dus het is een goed idee om mentaal "wandeling door" de procedure en leg uw instrumenten die in de volgorde van de te gebruiken.
  2. Verwijder de Ca 2 +-vrij ACSF uit de vriezer. Media moeten gedeeltelijk, niet helemaal, bevroren. Giet ongeveer 50 mL van ACSF in een glazen beker, dek af met Parafilm, en leg naast de dissectie gebied. Deze media zal worden gebruikt om kort op te slaan in de hersenen als het eenmaal is verwijderd. De overige Ca 2 +-vrije media zal gebruikt worden om het reservoir te vullen in het Vibratome voor slice voorbereiding. Deze media kunnen worden reoxygenated, of gewoon bedekt met parafilm en geplaatst in de koelkast bij 4 ° C.
  3. Euthanaseren de rat met behulp van methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Onze dieren worden geplaatst in een kleine plexiglas kamer die geleidelijk wordt gevuld met 100% CO 2. Verlies van het bewustzijn treedt in het algemeen binnen vijf minuten en wordt bevestigd door de afwezigheid van reflex-activiteitna een teen knijpen.
  4. Onthoofden de rat onmiddellijk rostraal van de eerste halswervel en plaats het hoofd op de gevouwen papieren handdoek. Met behulp van de # 11 scalpel, al snel maakt een incisie in het midden van de hoofdhuid te beginnen bij het neusbeen en uitvoeren caudaal naar het schedelbeen. Zorg ervoor dat u volledig dwars door de huid spier volledig blootleggen van de hechtingen op het dorsale oppervlak van de schedel.
  5. Knip de schedel platen met beebee schaar. Bij jonge ratten en muizen, kan de schedel snel worden verwijderd met het gebruik van bot rongeurs alleen. Echter, in de leeftijd ratten hebben dikkere schedels dan jonge volwassen ratten en muizen die kunnen maken deze procedure moeilijk. We hebben geconstateerd dat dwars door de schedel sterk botverwijdering faciliteert met rongeurs, vermindert schade aan de hersenen, en bespaart kostbare seconden. Met het hoofd van de rat stevig op het aanrecht, plaats het snijvlak van de onderste pure van de beebee schaar in de superieure gebied van het foramen magnum op het achterste gedeelte van de schedel. Houd de onderste pure stevig tegen binnenste van de schedel van het oppervlak (en weg van de hersenen) *, dwars door de occipitale plaat, en dan langs de middellijn hechting van de pariëtale platen. Ga rostraal tot u dwars door de frontale schedel platen.
    * Het is van cruciaal belang dat de druk is weg uit de hersenen gericht zijn op onbedoelde meten te voorkomen.
  6. Scheiden de occipitale, pariëtale en temporale schedel platen van de hersenen. Houd het hoofd stevig op het aanrecht voor stabiliteit en de hefboomwerking en schuif de onderkaak van de rongeurs onder de linker pariëtale plaat handhaven van de druk tegen de binnenkant van de schedel. Vervolgens Knijp de kaken van de rongeurs en rol je pols naar boven en naar u toe om de pariëtale en occipitale platen weg te trekken van de hersenen. Dit moet blootstellen grootste deel van het dorsale oppervlak van de linker hersenhelft. Indien nodig, gebruik dan de rongeurs aan de linker frontale plaat te verwijderen ook. Herhaal dit proces voor de andere halfrond. Zodra de platen zijn ontheemd, snel te inspecteren voor elke dura zaak die kan worden bevestigd aan de tijdelijke platen en strekte zich over het oppervlak van de hersenen. Voorzichtig trek deze met de rongeurs of wegknippen met een schaar *. Nu, schuift u de bovenkaak van de rongeurs tussen de hersenen en de juiste tijdelijke plaat, opnieuw houden van de druk in de richting van de schedel en de weg van de hersenen. Knijp en draai de tijdelijke plaat uit de buurt van de hersenen. U moet horen / voelen een 'crunch' als je dit doet. Herhaal dit voor de linkerkant.
    * De dura kan moeilijk zijn te herkennen, vooral als het dier is transcardially is geperfuseerd met ACSF. Echter, als dura niet worden verwijderd, zullen ze slice door de hersenen (en waarschijnlijk de hippocampus), als een scheermes als tijdelijke borden worden verwijderd. Knippen van de dura weg in de buurt van de tijdelijke borden zal het minimaliseren van de kans op steken in de hersenen.
  7. Pak het brein *. Snel te verwijderen van de parafilm van de Ca 2 +-free ACSF "modderige". Schuif nu de brede spatel hoofd van de hippocampus gereedschap tussen de ventrale oppervlak van de hersenen en de schedel onderste platen totdat deze volledig onder de hersenen. Beweeg de spatel zijdelings van links naar rechts en vervolgens naar voren en naar achteren een paar keer om intact craniale zenuwen te verbreken. Nu schep de hersenen uit met de hippocampus tool en onder te dompelen in Ca 2 +-vrij ACSF en bedek met parafilm. Laat de hersenen chill gedurende ongeveer een minuut. Dit is een geschikt moment schoon te maken uit de guillotine, gooi het karkas, en reorganiseren van de dissectie gebied.
    * Voor de stappen 2.3-2.7, de snelheid is van de essentie. We proberen deze procedure (van onthoofding naar de hersenen onderdompeling in ACSF) compleet in 30-35 sec. In onze ervaring, extracties die langer dan een minuut lijkt een negatief effect hippocampus plak de gezondheid, vooral voor de oude ratten. Met behulp van deze procedures, hebben we geen verschillen waargenomen in de extractie-tijden tussen de oude en jonge ratten voor onze studies.
  8. Extract van de hippocampus. Plaats het Whatman filtreerpapier op het deksel van het ijs-koude petrischaal en dempen het papier met ACSF het gebruik van de plastic overdracht pipet. Haal de hersenen van de ACSF met behulp van een lepel en plaats op de bevochtigde Whatman papier. Met behulp van de scalpel, verwijder de kleine hersenen en ongeveer een kwart van de rostrale frontale kwabben. Voer de scalpel door de intrahemispheric spleet volledig te scheiden van de twee hersenhelften. Plaats een halfrond terug in het ACSF modderige en "stand" de andere op het ontleden podium zodanig dat het frontale vlak van de frontale kwab is naar beneden gericht. Je moet duidelijk kunnen de hersenstam en midden hersenen (die zijn wit) van de bovenliggende cortex (die roze / grijs) te onderscheiden. Zoek de superieure en inferieure colliculi op de middenhersenen, deze eruit zal zien twee witte "knoppen" en zal aan de "top" van de hersenen in deze oriëntatie. Met behulp van de chirurgische schaar voorzichtig houd de middenhersenen op zijn plaats en schuif de wegen spatel in het gat wordentussen de colliculi en de neocortex. Heel voorzichtig verder met de spatel glijden en trek de hersenstam / middenhersenen / thalamus weg waaruit de binnenkant van de laterale ventrikel en de mediale oppervlak van de hippocampus. Gebruik de scherpe rand van de spatel om soepel verbreken van de fornix, een witte vezelbundel zich op de voorste / dorsale deel van de hippocampus. Met de schaar voorzichtig blijven de hersenstam / middenhersenen / thalamus weg te trekken zonder dat het volledig verbreken van de rest van de hersenen. De cortex met hippocampus zou nu vrij terug te leggen van de hersenstam *. Draai vervolgens het ontleden stadium, zodat u op zoek bent naar de mediale hippocampus en cortex liggende alsof het een sagittale doorsnede (minus de thalamus). U ziet nu de witte fimbria vezels die een ondiepe hyperbool aan de onderkant van de hippocampus in dit vlak vorm. Met behulp van de plastic overdracht pipet voorzichtig spuiten sommige ACSF in de opening onder de fimbria te scheiden van de hippocampus van de cortex te helpen. Voorzichtig de spatel glijden in dit gat, zodanig dat de lange kant van de spatel loopt parallel met de lange as van de hippocampus. Zodra de spatel is volledig onder de hippocampus, houdt u de hersenstam / middenhersenen / thalamus stevig met de schaar en het wegrollen van de spatel uit je lichaam naar de hippocampus fysiek gescheiden van de rest van de hersenen. Zodra de hippocampus is vrij voorzichtig trimmen weg alle resterende cortex, bloedvaten en witte stof. Schep een kleine hoeveelheid ACSF modderige naar de andere kant van het ontleden podium. Voorzichtig de positie van de hippocampus naast de slush en blussen met enkele milliliters van ACSF het gebruik van de plastic overdracht pipet. Verwijder vervolgens de andere halfrond en herhaal de dissectie.
    * Mogelijk hebt u de schaar om snip weg extra bindweefsel, witte stof, of vaatstelsel, dat scheiding van de cortex voorkomt de hersenstam. De punten van uw schaar zal zeer dicht bij de hippocampus, dus zorg ervoor dat heel precies snips (scherpe schaar is een must) te leveren.

3. Brain verwijderen en de hippocampus Dissection in Aged transgene muizen

  1. Euthanaseren en onthoofden de muis en maak een middellijn incisie op de hoofdhuid, zoals beschreven in paragraaf 2.3. Muizen hebben veel dunner schedels dan ratten die sterk vereenvoudigt de hersenen extractie. Dwars door de schedel met een schaar is dus niet nodig. Gebruik bot rongeurs met kleinere kaken (tabel 2) weg te trekken occipitale, pariëtale en temporale schedel platen. Net als bij de rat, vergeet niet om gecontroleerde bewegingen te gebruiken en goed de onderkaak van de rongeurs te trekken in de interne oppervlak van de schedel en uit de buurt van de hersenen als het verwijderen van de platen. Zodra de platen zijn verwijderd, gebruik maken van de smalle uiteinde van de hippocampus gereedschap om de resterende craniale zenuwen scheiden en schep de hersenen in de ijskoude Ca 2 +-vrij ACSF.
  2. Bereid de hersenen plakjes. Vanwege de kleinere omvang van de hersenen van muizen, het ontleden van de hippocampus kan een beetje meer uitdagende (maar zeker goed te doen) dan bij het gebruik van ratten. Dus, om dingen makkelijker te maken, verwijderen we het cerebellum en de rostrale tips van de frontale kwabben, maar niet ontleden de hippocampus. In plaats daarvan worden hersenhelften fysiek van elkaar gescheiden met een scalpel en intact gelaten voor Vibratome snijden (zie onder 4).

4. Sectie hersenweefsel in plakjes met behulp van een trillende Microtoom (Vibratome) en Transfer naar Holding kamer *

  1. Vul het reservoir van de Vibratome met ijs-koud Ca 2 +-vrij ACSF, zodanig dat de uitsnijden en het blad volledig ondergedompeld. Voor het maken van rat plakjes, snijd de rostrale en caudale uiteinden van elk hippocampus met een scalpel. Deze bezuinigingen zal u toelaten om verticaal de positie van de hippocampus nauw samen als twee kolommen. Dit werkt het beste als de dentate gyrus van elk hippocampus is tegenover elkaar en CA3 regio's zijn georiënteerd in dezelfde richting. Voor het maken van de muis plakjes, verticaal positie elke hersenhelft nauw samen met de frontale kwabben naar beneden. Lijm hersenweefsel op een montage blok en over te dragen aan het snijden fase van de Vibratome. We meestal voor te bereiden ~ 400 uM secties voor synaptische fysiologie experimenten. Dunnere gedeelten moeten worden voorbereid als fluorescerende beeldvorming zal worden uitgevoerd (bijvoorbeeld onderzoek van Ca 2 + niveaus en transiënten). Verzamel plakjes met een brede bek pipet of een penseel # en overbrengen in een petrischaaltje met ijskoud Ca 2 +-vrij ACSF.
    * Gebruik van een Vibratome minimaliseert schade aan de bovenste en onderste oppervlakken van de slice en is zeker een aanrader voor studies die analyse van cellen in de buurt van de slice oppervlak (bijv. spanning klem en Ca 2 + imaging studies). Echter, goedkopere alternatieven beschikbaar zijn en geschikt zijn voor het genereren van schijfjes voor extracellulair fysiologie experimenten. We hebben gebruik gemaakt van een kleine zwaartekracht-gecontroleerde chopper 2,11 en een McIlwain Tissue Chopper 12 met goed succes. Voor this procedure hippocampus zijn geplaatst op een gefaseerde en coupes met een verticale chopper. Een borstel wordt gebruikt voor het plakken (een per keer) over te dragen aan een kleine holding schaaltje gevuld met ijskoude Ca 2 +-vrij ACSF. Een probleem met deze benadering is dat de hippocampus kan bewegen tussen de karbonades wat resulteert in ongelijke delen. Wees ook voorzichtig te verwijderen zoveel mogelijk witte stof, en vooral zo veel vaatstelsel, zo mogelijk voor hakken. Dit materiaal zal vasthouden aan de borstel, het scheermes, of beide, waardoor slice overdracht erg moeilijk en het vergroten van de kans op uitrekken of beschadiging van het weefsel.
    # Bij gebruik van een borstel, probeer dan de slice lengte-wise rust in de haren. Wikkelen de slice rond de borstel tip kan leiden tot onnodig weefsel stretching.
  2. Overdracht hersenen plakjes het aanhouden kamer waar ze badend in zuurstof Ca 2 +-bevattende ACSF. Geleidelijk aan de kamer temperatuur van 27 ° tot 32 ° C (+1 ° om de vijf minuten). Laat plakjes te incubeer gedurende 1 tot 1,5 uur voor elektrofysiologische experimenten.

5. Ontlokken en Record CA3-CA1 Synaptic Reacties

  1. Voor basis extracellulaire opnames in acute plakjes, zal uw elektrofysiologie station moeten * zijn onder meer: ​​een opname kamer, een perfusie-systeem, een microscoop met> 4x vergroting capaciteit; opname, stimulerend, en massa-elektroden, macro-en micromanipulators, een rigide vibratie-bestendige table-top en de kooi van Faraday, een stimulator, versterker en analoog-naar-digitaal (A / D) converter; oscilloscoop (bij voorkeur) en persoonlijke PC met de juiste acquisitie software.
    * Kerr Scientific Instruments biedt een fantastisch en goedkoop electrofysiologie systeem (dat wil zeggen de Kerr Tissue Recording System) voor het uitvoeren van een variëteit van basis slice elektrofysiologie experimenten. Dit systeem heeft een kleine footprint, draagbare stimulatoren en versterkers, en kan gebruikt worden op een standaard lab-bank zonder de noodzaak van een omvangrijke kooi van Faraday.
    Natuurlijk kan de hersenen plakjes ook worden gebruikt voor het uitvoeren van een groot aantal uitgebreide elektrofysiologische en beeldvormende technieken, die extra uitrusting en materialen zal vereisen. Bijvoorbeeld, onze belangrijkste elektrofysiologie station bevat een versterker met snelle spanning-en stroom-klem-mogelijkheden, een tl-verlichting systeem, en een digitale camera. Dit station wordt gebruikt voor het extracellulaire veldopnames in de hersenen plakjes, evenals patch-clamp opnamen en fluorescerende beeldvorming in plakjes en celculturen 3,12,13. Zie tabel 3 voor een volledige lijst van apparatuur en onderdelen.
  2. Met behulp van een brede mond pipet of kleine kwast, overdracht van een of meer plakjes om de opname kamer * waardoor het acclimatiseren voor 10-15 minuten voor de stimulatie / opname. Voor onze studies, worden ondergedompeld in plakjes ACSF en rusten op netting ingebracht in een RC-22 kamer door Warner Instruments (zie figuur 3). ACSF de zwaartekracht is gevoed door een regulator om debiet aan te passen, en voorverwarmd tot 32 ° C door een inline micro-heater voor het bereiken van de opname kamer. Een centrale stofzuiger lijn wordt gebruikt om ASCF te verwijderen.
    * Veel verschillende variëteiten van dompelpompen en interface-style opname kamers zijn commercieel verkrijgbaar. We hebben waargenomen dat schijfjes meer robuuste synaptische reacties vertonen in een interface kamer (dat wil zeggen slice zit aan een interface met bevochtigde lucht en ACSF) 2,11. Echter, responsiviteit is over het algemeen stabieler wanneer plakjes worden ondergedompeld in ACSF. Drug perfusie is ook efficiënter in onderdompeling kamers.
  3. Plaats stimulerende en registrerende elektroden. Met de stimulator of stimulus isolator is ingeschakeld, maar de output gekozen tot 0, de positie van een elektrode op het schijfje in het stratum radiatum regio van CA2 de buurt van de CA3 grens (zie figuur 4). We maken gebruik van een gedraaide platina iridium draad tot 50-100 uS difasisch pulsen te leveren aan CA3 Schaffer onderpand (SC) vezels. Het gebruik van platina iridium draad en difasisch pulsen kunnen helpen geminimaliseerd elektrode polarisatie. Lagere een registratie-elektrode in de CA1 stratum radiatum, maar het breken van de oppervlakte van de slice. Onze registratie-elektrode is een Ag / AgCl draad in een ACSF gevuld glas micropipet (tip weerstand van ~ 7 MΩ). Draai de uitgang van de stimulator tot een matig niveau (we onze stimulans isolator tot ~ 150 uA) en beginnen toedienen stimulans peulvruchten en het verwerven van activiteit met behulp van aanschaf software, zoals Clampex van Axon Instruments, Inc langzaam lager de elektrode in kleine intervallen tot een stimulus artificact is opgenomen in CA1. Vervolgens langzaam blijven verlagen zowel de stimulerende en registrerende elektroden in intervallen, terwijl het verwerven van CA1 reacties totdat de vezel volley (FV) en de prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP) amplitudes bereiken hun maximale niveaus (zie Figuur 4B).
  4. Stel een synaptische kracht curve en te onderzoeken synaptische plasticiteit. Voor het genereren van een synaptische kracht curve, leveren stimulans pulsen om SC op steeds hogere intensiteiten en opnemen van ee desbetreffende activiteit in CA1. Het bereik en het aantal gebruikte stimulus intensiteit niveaus kan variëren, maar moet voldoende zijn om een ​​sigmoïdale curve genereren wanneer uitgezet tegen zowel FV of EPSP waarden (figuur 5). De FV amplitude zorgt voor een betrouwbare schatting van het aandeel van geactiveerde presynaptische vezels, terwijl de EPSP helling biedt een ongerepte maat voor monosynaptic CA3-CA1 stromen. Het plotten van de EPSP helling tegen de FV over stimulus intensiteitsniveaus weerspiegelt dan ook de grootte van het EPSP per aantal geactiveerde afferentia en biedt een uitstekende schatting van CA3-CA1 synaptische sterkte. Meestal worden synaptische sterkte niveaus aanzienlijk verminderd in het gebied CA1 van oude ratten en muizen APP/PS1, dan bij jonge ratten en leeftijd gematchte wild-type muizen zie bijvoorbeeld 4,14.
  5. Schijfjes die tekenen van slechte gezondheid (dat wil zeggen een maximale EPSP amplitude <1 mV) of hyperexcitabiliteit (dwz de verschijning van twee of meer inwoners spikes) laten zien tijdens de synaptische kracht curve zijn uitgesloten van de statistische analyse (zie Figuur 4C). We hebben gevonden dat deze schijfjes zelden stabiel reacties vertonen in een 60 minuten periode en / of vertonen een zeer variabel reacties na de inductie van synaptische plasticiteit. Het verdient op te merken dat "ongezond plakken" make-up slechts ongeveer 10-20% van alle segmenten overgebracht naar de opname kamer. Bovendien is in onze ervaring, de frequentie van het identificeren van een ongezonde slice is zeer vergelijkbaar in leeftijd, soort en genotype.
  6. Veroorzaken op lange termijn potentiatie (LTP) of lange termijn depressie (LTD) in plakjes. LTP en LTD zijn blijvende stijgingen (LTP) en neemt af (LTD) in de synaptische functie in reactie op de verschillende patronen van synaptische activatie. Beide processen wordt algemeen aangenomen dat kritische mechanismen voor het leren en memory15 reflecteren en nuttig resultaat maatregelen voorzien voor het onderzoeken van cellulaire mechanismen van neurale disfunctie en / of voor het beoordelen van farmacologische strategieën voor het verbeteren van het geheugen tekorten en neurodegeneratie 16.
    Voor de synaptische plasticiteit experimenten, reset de stimulus intensiteit voor alle plakjes van 1 mV * en beginnen baseline stimulatie bij een frequentie van 0.033 Hz. EPSP helling waarden moeten stabiel te zijn gedurende tenminste 20 minuten voor de inductie van LTP en LTD. Nauwlettend te volgen EPSPS in deze tijd en reset van de stimulus intensiteit als de helling fluctueert meer dan 10% en start een nieuwe baseline. Veroorzaken LTP met behulp van een een tweede trein van 100 Hz stimulatie of meerdere korte stoten (~ 10 pulsen) van 100 Hz stimulatie gegeven om de 200 ms. Voor LTD inductie, leveren 900 stimulus pulsen met een snelheid van 1 Hz. Na inductie van LTP of LTD, verzamel synaptic antwoorden voor een extra 60 minuten of meer. EPSP helling waarden verkregen voor en 60 min na hoge / lage frequentie stimulatie worden vergeleken met de aanwezigheid van LTP en LTD te bepalen.
    Leeftijd van ratten en muizen APP/PS1 hebben de neiging om een tekort LTP en LTD verbeterd (zie figuur 5) laten zien, en deze wijzigingen zijn voorgesteld om tot een verminderde cognitie bij te dragen in deze dierlijke modellen 6,16. Echter, in tegenstelling tot APP/PS1 muizen, veranderingen in de LTP / LTD in oude ratten zijn variabel over de labs. Oude ratten vertonen over het algemeen vergelijkbaar LTP niveau in vergelijking met volwassenen in reactie op "intense" (dwz 100 Hz) stimulatie, maar vertonen tekorten bij het ​​mildere stimulatie parameters worden gebruikt (dat wil zeggen een lagere stimulus frequenties of minder stimulus pulsen) (voor review zie 4,6, 16). Ook hebben sommige labo's, waaronder de onze, waargenomen verhoogde gevoeligheid voor LTD inductie in oude ratten 2,17-19, terwijl andere groepen vonden geen verschil of een verminderde gevoeligheid in hun oude dieren. Zoals besproken hieronder kort (zie Overleg), kunnen subtiele maar kritische verschillen in experimentele protocol account voor deze verschillen.
    * De stimulatie-intensiteit en de EPSP amplitude van invloed kunnen zijn LTP inductie en kan een belangrijke oorzaak van de afwijkende resultaten in de literatuur. Dit zal verder worden overwogen in de discussie sectie.

6. Representatieve resultaten

Ons werk, en werk van andere groepen, suggereert dat veranderingen in de astrocyten op basis van inflammatoire signalering kunnen veroorzaken en / of bespoedigen neurologische dysfunctie bij het ​​ouder worden en AD 13,20,21. Onlangs hebben we gebruik gemaakt synaptische kracht, LTP en LTD als eindpunt maatregelen om de effectiviteit en werkingsmechanismen van verschillende nieuwe anti-inflammatoire reagentia in het midden-leeftijd APP/PS1 muizen (zie 22 voor een beschrijving van dit model) te onderzoeken en de leeftijd Fischer 344 ratten. De resultaten hieronder zijn verkregen met behulp van de protocollen beschreven in dit artikel.

Een van de nieuwe anti-inflammatoire adeno-geassocieerde virale (AAV) reagentia ontwikkeld door ons laboratorium is aangetoond in pilot-studies aanzienlijk te vergroten synaptische sterkte (p <0,05) en LTP tekorten (p <0,05) te voorkomen in het midden-leeftijd (16 -maanden-oud) APP/PS1 muizen (n = 4-6 sneetjes per behandeling aandoening). Vertegenwoordiger van synaptische sterkte bochten en LTP experimenten van twee verschillende schijven, collected van dezelfde 16-maanden-oude APP/PS1 muis, zijn weergegeven in figuur 5A-C. Een plakje was uit het halfrond die behandeld worden met onze nieuwe AAV (reagens A), terwijl de andere plak werd behandeld met een controle AAV reagens (Control). LTP werd geïnduceerd in beide plakken met behulp van twee 1 sec treinen van 100 Hz stimulatie (10 sec intertrain interval). Merk op dat de synaptische kracht curve voor de Reagens A-behandelde slice is verschoven naar de linkerkant van de controle-slice, indicatief voor een grotere synaptische sterkte. Merk ook op dat, typisch voor de mid-leeftijd APP/PS1 muizen, LTP snel vervallen tot baseline in de controle-slice (bijv. 23). Omgekeerd LTP vervallen weinig in de slice die behandeld worden met onze nieuwe reagens.

In een tweede recente studie, zagen we grote LTD in het voertuig behandelde oude ratten (85% van de pre-LTD baseline, p <0,05). In tegenstelling, was er geen LTD waargenomen in de leeftijd van ratten behandeld met nieuwe anti-inflammatoire "Drug A" (97% van de pre-LTD baseline, niet significant). Geen medicijn effecten op de synaptische sterkte waargenomen. Vertegenwoordiger LTD experimenten uit deze dataset (n = 8-10 ratten per groep) worden geïllustreerd in figuur 5D-F.

Figuur 1
Figuur 1. Gereedschappen en materialen die worden gebruikt voor de hersenen dissectie. A, een papieren handdoek. B, scalpel. C, Beebee schaar. D-, bot-rongeurs (voor ratten). E-, bot-rongeurs (voor muizen / ratten). F, plastic lepel. G, plastic transferpipet. H, hippocampus tool. Ik, spatel. J, chirurgische schaar. K, glazen petrischaal.

Figuur 2
Figuur 2. Aangepaste hersenen slice holding kamer. A, macrochamber. B, deksel. C, H 2 O reservoir met geperforeerde silicone. D, microchamber. E, ACSF levering buis (polyethyleen). F, O 2 aflevering buis. G, de haven voor de temperatuurregeling. H, gesaldeerd microchamber te voegen.

Figuur 3
Figuur 3. RC22 onderdompeling kamer. A, Opname kamer. B, Ground elektrode. C, aspiratie naald.

Figuur 4
Figuur 4. Hippocampus slice illustratie en extracellulaire golfvormen. A, Cartoon van een dwarse hippocampus groep die gebruikt zijn in de elektrofysiologie experimenten. CA = Cornu Ammonis. DG = dentate gyrus. SC = Schaffer collateralen. S radiatum = stratum radiatum. B, Elektrische stimulatie van de SC (een CA3 axon-darmkanaal), een stimulus artefact uitlokt, bijna onmiddellijk gevolgd door een presynaptische bevolking piek, of glasvezel volley (FV). De amplitude van FV is recht evenredig met het aantal geactiveerde SC vezels. De helling van de negatieve lopende fase van het veld prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP) komt overeen rechtstreeks aan de activering van depolariserende synaptische stromingen in de CA1 piramidale neuronen in reactie op de release van SC terminals glutamaat. C, Overlappende vertegenwoordiger extracellulaire golfvormen opgenomen in CA1 stratum radiatum in reactie op negen verschillende stimulus intensiteit niveaus (30 tot 500 uA) in een "gezonde" (linker paneel), "ongezond", en "hyperexciteerbare" slice. Vijf golfvormen werden gemiddeld per niveau. Gezonde schijfjes dynamisch in te spelen over deze stimulans serie en vertonen een positieve lopend populatie spike (als gevolg van CA1 neuronale ontladen) bij de hogere stimulus niveaus. In de RC22 onderdompeling kamer, maximale EPSPS meestal liggen tussen 1,5 en 3 mV in amplitude. Ongezonde plakjes (middelste paneel) vertonen vaak een grote FV, maar een kleine maximale EPSP (<1 mV) en meestal een slechte plasticiteit. Hyperexciteerbare plakken (rechter paneel) tonen twee of meer regeneratieve bevolking pieken in de opgaande onderdeel van de EPSP. Reacties in hyperexciteerbare schijfjes zijn vaak labiel en zijn variabel beïnvloed door LTD / LTP stimulatie.

Figuur 5
Figuur 5. Vertegenwoordiger elektrofysiologie experimenten uitgevoerd op acute plakjes van half-jaar (16 mnd) APP/PS1 muizen en ouder (22 MOS) Fisher 344 ratten. Panels AB show data verzameld van APP/PS1 muizen behandeld met een controle adeno-geassocieerde (AAV) virale construct (Control) of een roman AAV reagens (reagens A) die is ontwikkeld door ons lab groep. Ten opzichte van de controle-slice, de slice behandeld met Reagens A vertoont een duidelijke verschuiving naar links in de EPSP: FV curve (A) indicatie van een grotere synaptische sterkte. Het reagens-A-behandelde slice toont ook robuust en stabiel LTP (B) na de levering van twee 1 sec, 100 Hz stimulus treinen, terwijl de controlegroep slice vertoont een tekort LTP, typerend voor dit diermodel. Panelen DF show data verzameld van twee individuele oude ratten die chronisch (4 week) intrahippocampal perfusie van het voertuig of van een nieuwe anti-inflammatoire middelen (Drug A) ontvangen. Basale synaptische kracht werd relatief weinig beïnvloed door behandeling met geneesmiddelen(D). Echter, Drug A werd zeer effectief bij het voorkomen van de inductie van LTD (E). Panelen C en F tonen vertegenwoordiger EPSP golfvormen opgenomen van afzonderlijke segmenten voor (pre) en 60 min na (post) de levering van LTP / LTD stimulatie. Merk op dat stimulus artefacten niet worden weergegeven.

Discussion

De stappen in dit protocol zal helpen verzekeren dat de hersenen ontledingen worden uitgevoerd ten minste zo snel en efficiënt in leeftijd, zoals bij jonge volwassen ratten. We bieden ook voldoende detail voor de beginner tot het opzetten van hun eigen stukje studies over LTP en LTD. Als verdere exploratie van het ouder worden en AD veranderingen in de synaptische plasticiteit en functie is een van je doelen, zijn er ten minste twee andere methodologische kwesties, zinspeelde hierboven, dat er meer aandacht verdienen. Eerste, een aantal laboratoria hebben aangetoond dat de Ca 2 +: Mg2 +-verhouding in de opname ACSF kan een duidelijk effect op de inductie synaptische plasticiteit hebben in de hippocampus plakken 2,10,24,25. In zoogdieren CSF, de Ca 2 +: Mg2 +-ratio is ongeveer een (zie bijvoorbeeld 26). Echter, ACSF Ca 2 +: Mg2 + ratio's dichter bij de twee worden vaak gebruikt in slice studies van synaptische plasticiteit en functie. In het begin van studies, deze praktijk waarschijnlijk was aangepast aan de inductie van LTP te optimaliseren, en vervolgens werd routine voor alle plasticiteit onderzoeken. Dit kan echter de praktijk problematisch zijn bij veroudering en AD studies omwille van goed gekarakteriseerde verschillen in neuronale Ca 2 +-regeling. In het bijzonder, Ca 2 + influx en / of Ca 2 +-geïnduceerde Ca 2 +-release is verhoogd in oude ratten-en / of AD model muizen tijdens neuronale activering 3,27-31. Inductie van LTD is bijzonder gevoelig voor subtiele veranderingen in ACSF Ca 2 + levels. Ons protocol, dat 2 mM Ca 2 + en 2 mM Mg2 +, resulteert gewoonlijk in LTD voor de leeftijd, maar geen jonge volwassen dieren 2, terwijl studies met behulp van een Ca 2 + maakt gebruik van: Mg2 +-verhouding dichter bij de twee, hebben waargenomen robuuste LTD bij volwassenen in de afwezigheid van een verschil in leeftijd 2,10 of in combinatie met verminderde LTD in oude ratten 32. Deze observaties onderstrepen de noodzaak om zorgvuldig te overwegen ACSF Ca 2 + en Mg2 + niveau bij het ​​vergelijken van Ca 2 +-afhankelijke plasticiteit in leeftijd en jonge volwassen dieren.

Het tweede methodologische kwestie betreft de sterke afhankelijkheid van LTP op postsynaptische depolarisatie 33 en de mogelijke veroudering / genotype verschillen in de synaptische sterkte. In een typisch experiment LTP, baseline en LTP stimulatie-intensiteit is over het algemeen aangepast aan een half maximale (of drie kwart maximaal) EPSP amplitude te produceren. Het potentieel probleem is dat oude ratten en muizen APP/PS1 meestal tonen synaptische sterkte in vergelijking met hun jongere en / of het wild type tegenhangers verminderd, wat betekent dat baseline EPSP waarden ook zullen kleiner zijn in de leeftijd van ratten en muizen APP/PS1. Kleinere EPSPS kan vertalen naar minder depolarisatie tijdens de LTP stimulatie, wat resulteert in een verminderde kans voor het induceren van LTP 33. Omwille van dit potentieel te beschamen, is het moeilijk om te bepalen of deze dieren een throughput tekort, een tekort of beide plasticiteit vertonen. Dat wil zeggen dat LTP inductie mechanismen in leeftijd en / of APP/PS1 muizen worden functioneel intact (geen plasticiteit tekort), maar onvoldoende gestimuleerd (throughput tekort) onder deze omstandigheden. Dit onderscheid is van cruciaal belang, zoals mechanismen voor de doorvoer en de mechanismen voor plasticiteit kan heel verschillend reageren op een specifieke farmacologische behandeling. We proberen het effect van verlaagde doorstroming op LTP inductie te minimaliseren door het normaliseren van de EPSP amplitude op hetzelfde niveau (bijv. 1 mV) over alle segmenten voorafgaand aan de LTP stimulatie. Andere strategieën effectief kan zijn als ook (bijvoorbeeld gebruik van spanning of stroom klem om de membraanpotentiaal gelijk in groepen tijdens LTP stimulatie), en moet worden beschouwd bij het onderzoeken van LTP in deze dierlijke modellen.

Disclosures

De productie van deze video-artikel werd gesponsord door Leica Microsystems.

Acknowledgements

Werk ondersteund door de NIH subsidie ​​AG027297, een prijs van de Kentucky Spinal Cord en Head Injury Research Trust, en een geschenk van de Kleberg Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Fisher Scientific BP366-500
KH2PO4 (monobasic) Sigma-Aldrich P5379-100G
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643-500G
CaCl2 (dihydrate) Sigma-Aldrich C3306-250G
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500
C6H12O6 (dextrose) Fisher Scientific BP350-1
Table 1. Reagents required
Erlenmeyer Flasks Fisher Scientific FB-500-2000 FB-500-1000
Aquarium Bubbler Used for oxygenating media. Available at most pet stores
50 mL Glass beaker Fisher Scientific 02-540G For brain storarge in ACSF
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Small Animal Guillotine World Precision Instruments, Inc. DCAP-M
Flat paper towel
#11 Feather surgical blade Fisher Scientific 08-916-5B
Beebee bone scissors Fine Science Tools 16044-10
Lempert Rongeurs Roboz Surgical Instruments Co. RS-8321 Use for rats
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16020-14 Use for mice or rats
Hippocampus tool Fine Science Tools 10099-15
Spoon A plastic teaspoon will do
Spatula Fisher Scientific 21-401-25A Spatula
Surgical iris scissors Fine Science Tools 14058-09
plastic transfer pipets Fisher Scientific 13-711-43
110mm Whatman filter paper Fisher Scientific 09-805E Whatman cat. 1001-110
Glass petri dish Fisher Scientific
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome Vibratome VT1000P
0.1mm FA-10 Feather S blade Ted Pella, Inc. 121-9 0.1mm FA-10 Feather S blade
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) Fisher Scientific 13-678-20A For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening
35 mm Polysterine Culture dish Corning 430588 Used for collecting slices after dissection
Table 2. Tools and materials for dissection
Holding chamber Custom Made
P-97 Horizontal Pipette Puller Sutter Instrument Co.
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corp.
Faraday cage Custom Made
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm Corning 1220-1L
Gravity-contolled IV set with regulator Baxter Internationl Inc. 2C8891
Central Vacuum Line Available in most modern labs
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix Scott-Gross Co.
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery Fisher Scientific Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes.
Eclipse E600FN Microscope Nikon Instruments with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters
Cool Snap ES Digital Camera Photometrics Cool Snap ES Digital Camera
X-Cite Fluorescent Illuminator EXFO X-Cite Fluorescent Illuminator
Microscope Platform Siskiyou, Inc. Custom assembled
RC-22 Submersible recording chamber Warner Instruments 64-0228 Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner)
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller Cell Microcontrols
4 Axis Manual Miniature manipulator Siskiyou, Inc.
Platinum Iridium Wire (0.002 in) World Precision Instruments, Inc. PTT0203
A365 Stimulus Isolator World Precision Instruments, Inc. A365 Stimulus Isolator
Multiclamp 700b Amplifier Axon Instruments
Digidata 1322A A/D converter Axon Instruments
PClamp software Axon Instruments
Personal Computer (Pentium 4) Dell
Table 3. Electrophysiology equipment and materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
  2. Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
  3. Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
  4. Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
  5. Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
  6. Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
  7. Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
  8. Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
  9. Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
  10. Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
  11. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  12. Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
  13. Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
  14. Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
  15. Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
  16. Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
  17. Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
  18. Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
  19. Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
  20. Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
  21. Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
  22. Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
  23. Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
  24. Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
  25. Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
  26. Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
  27. Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
  28. Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
  29. Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
  30. Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
  31. Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
  32. Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
  33. McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).

Comments

30 Comments

  1. A great protocol and discussion. What kind of stimulating electrode do you use?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 12:16 PM
  2. Thank you Louise. We use platinum iridium wire to make a bipolar electrode. The last time we purchased this wire we used World Precision Instruments (cat # ptt050²). Let me know if you need any other info

    Reply
    Posted by: chris n.
    May 3, 2011 - 12:54 PM
  3. Great protocol. However, I have got a problem. I can observe huge fiber volleys but with small or no EPSPs. Do you know what could be the problem? Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:57 AM
  4. Hi Olivier. Thanks for the kind words. In re to huge FVs and small EPSPs...Sometimes the fix can be as simple as tweaking the placement of your stimulating and recording electrodes (e.g. adjusting the depth and distance between trodes). However, if you've tried this and are still having problems there are a few possibilities. It could be that the tissue is being damaged and/or mishandled during the dissection/slicing procedure. As we mentioned in the protocol above, tissue from old animals and amyloidogenic animals tends to be a little more vulnerable to damage caused by the slicing procedure. If you haven't already, you may try dissecting a young adult mouse/rat (31 C). EPSPs are generally smaller at colder temperatures. 3)Make sure the pH of the incubation/recording medium is between 7.35 and 7.45. In the past, I've found that slices tend to exhibit big FVs and small EPSPs when they're sitting in media with a low pH (<7.3). 4) Make sure the slices are getting oxygenated efficiently DURING incubation, else they will die :). Usually, if oxygenation is good during incubation, but poor during the recording, the slices start off looking good but then become hyperexcitable as the experiment progresses. I hope this info helps. If you've tried all these fixes with no luck, feel free to email me.

    Best,

    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 11, 2011 - 12:52 PM
  5. Hi Chris,

    Thank you very much for your response but I think still need to bother you again. Indeed, it dŒs not seem to be related to the age of the animals. I think my slice are ok even if I use a McIlwain slicer. Indded, I had some responses last week (from 0.² to ² mV with immerged slices). Artefacts and fiber volleys were small compared to the responses. Now I can't see anymore proper responses (or very rarely) and as I said before, the amplitude of the fiber volley is huge (0.5-² mV) even for small stimulations. Moreover, it has two components a positive and a negative one. The artefact of stimulation became incredibly huge e.g 35 mV for a 100 us stimulation at 500 uA. Would you have any suggestion? I will test my headstage with the model cell. Thank you very much.

    Best regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 2:42 PM
  6. Hi Olivier, sorry for the late response. If you wanted to send me a picture of your EPSP waveforms to my email address (should be listed somewhere above or on the .pdf), I'd be happy to take a look at them. If you send this to me, please include information on the type of stimulator unit and electrodes your using as well as your ACSF composition.
    Best,
    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 18, 2011 - 12:12 PM
  7. Dear Chris,

    I have finally found the solution. Everything is working perfectly now. It was an issue with the glue I used for my holding chamber. Thank you again for your precious help.

    Kind regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 19, 2011 - 5:18 AM
  8. Dear Olivier,
    I am having the exact same problem as you. Would you please be more specific about how you were able to correct it? It would be so helpful!
    Best regards,
    Cristiane

    Reply
    Posted by: Cristiane T.
    July 12, 2012 - 11:58 AM
  9. Dear Cristiane,

    As explained in me previous message my problem of poor viability and small responses was related to the holding chamber to keep the slices at 35°C before experimenting. However, low viability can be due to many other reasons. You should work fast, in presence of AMPA and or NMDA blocker (or low sodium solution). You should avoid to fold the hippocampal tissues etc....

    Hope it will help.

    Reply
    Posted by: Olivier P.
    July 16, 2012 - 4:12 AM
  10. Hi every body, i was really so glad when i see your web site, and i want offer my thanks for your great site.
    i am from shefa neuroscience research center in iran where managed by proff. ALI GORJI who one of the first person worked on spreading depression in the world.
    i am working on Spreading Depression too and use LTP technique.
    please contact with me by e-mail for Future cooperation.
    Best Regard
    ahmad ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2011 - 10:56 AM
  11. Hi, I got a problem with my hippocampal slice recording. When I just transferred my slices from that incubation beaker into recording chamber, a large fEPSP response can be recorded, but after sitting in that chamber for a while, the response tended to become smaller even disapper compared with that when slices were just put in chamber. I have tried to adjusted the rate of oxygenation and temperature to ensure sufficient oxygen supply and correct temperature. I can garantee that oxygen supply has no problem and temperature is in normal range (²6 -30 C). But the problem is still there. Somebody told me that is cause by a "heat shock" when slices are transferred to a warmer enviornment. Can you help to resolve this problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2012 - 7:03 PM
  12. hi, you should put your slice in chamber(²8- 30c) for 1 hour after you get slice. And after that you should transfer your slice to second chamber( LTP chamber) in 3²c.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 3, 2012 - 11:48 AM
  13. Hi,

    I suppose you can't record at 35°C, don't you? May be the problem is that your slice moves slightly during the recording. Did you try to change the position of your recording electrode to see if you can recover a response with the initial amplitude?

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 1:21 PM
  14. Yes, I did. I move the recording electrode to several different positions trying to elicite a good amplitude. But the problem is still there. I have noticed that after sitting in the recording chamber for a while, the slices tended to lost activity. No matter where you put the recording electrode, you cannot recover a good amplitude as the initial one. I suspected that was caused by a slow flow rate, which is 1.5-² ml/min in my chamer. My chamer is different from others, because I currently use a blind method to record fEPSPs and eEPSCs. So my chamber is bigger than others with approximately 1-² ml volume for fluid exchange. I am trying to increase that flow rate to ².5-3 ml/min to see what will happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 3:26 PM
  15. Hi, sorry to hear about the problems you're having. Are your slices submerged in the recording chamber or at an interface with the air? Is your stimulus artifact changing, or just the synaptic response? What about the fiber volley, dŒs it die too? How do you know that the oxygen levels in your media are adequate? If your recording chamber is wide and your bath shallow, that would provide quite a bit of surface area for the oxygen to escape. Testing the bath pH with a micro pH meter would help determine if O² levels are stable. If you're worried about heat shocking the slice when you transfer it to the recording chamber, you could try slowly bringing the temperature of the media in your holding chamber up to recording temperature during the incubation period (maybe raising it 1 or ² degrees every 10-15 min).

    Reply
    Posted by: chris n.
    January 17, 2012 - 3:56 PM
  16. Hello again, I want to know the distance between stimulating electrode and recording one in your experiments. Some people put them in a very short distance (²00-300 micrometers). In my experiments, I usually put the stimulating electrodes at the initial part of the schaffer collateral fibers in CA1 area, and put that recording ones at a site as far as possible to avoid the large artifacts, but sometimes I was unable to get a stable LTP after HFS. I believe the reasons for that might be that many neural circuits are activated during HFS including inhibitory ones, because more circuits can be activated simultaneously with the increased distance. Is that correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 5:03 PM
  17. I need more detail, since I am still facing some problem.

    Reply
    Posted by: Zaman K.
    February 9, 2012 - 2:38 AM
  18. Finally, I found out the problem that leads to loss of viability of the hippocampal neurons in my experiment. It was caused by my chamber, which is so different from others. It has a very large volume, with a large surface. So I was assuming that my problem was caused by the anoxia resulted by rapid diffusion of ACSF into the large shallow surface. I already increase the flow rate to ².5 ml/min in my previous chamber, but still had that problem. So I made a polycarbonate slice chamber according to Warner company's criteria. Now I can get a pretty stable response throughout my experiment.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:02 PM
  19. What is the significance of air interface vs. submerged slices, is one better than the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:38 PM
  20. BTW, the criteria to judge the anoxia is the production of bubble in the chamber. If you see the bubble present in the chamber, that means the ACSF is oxygen-saturated. Heating makes the extra oxygen escape from the solution. If not, the ACSF is not saturated by oxygen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 3:10 PM
  21. Good for morale to read that I'm not the only one having problems with acute slices. Due to the comments above I'm going to try a few new things with my set-up. It MIGHT just be the oxygen-saturation, since I pre-heat the ACSF to 4² Celsius, trying to record at ~34 Celsius AND have a relative large chamber. Temperatures are experimental variables of the design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 28, 2012 - 11:15 AM
  22. Increasing the perfusion rate to 4 ml/min and changing to a bath that is diamond shaped and has a far lower volume were the solution. Getting a decent signal is still something of a black magic. =/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 7:14 AM
  23. Thank you for sharing your protocol - excellent video.

    Is there an advantage to dissecting out the hippocampus before slicing, as opposed to slicing the whole brain (or one hemisphere of the brain)?

    If I am not mistaken, you cite "netting" in the bottom of the recording chamber. DŒs that mean that the slice is suspended off of the bottom of the chamber?

    Is the resistance of the recording pipette a critical factor?

    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2012 - 5:33 AM
  24. Hi Chris, sorry for the late reply. For rats, whole hemisphere slices are fairly large and can be a bit of a problem if you have small recording and holding chambers. Also, the hippocampus in an adult rat is fairly easy to dissect away. For mice, on the other hand, the hippocampus is very small and a little trickier to dissect out (though it can certainly be done effectively). You can therefore save time by simply slicing the whole mouse hemisphere into sections. And unlike the rat, whole hemisphere mouse slices aren't so big that they are difficult to work with and store. In re to netting: yes we do use netting, which raises the slice off of the bottom of the dish. In re to the recording pipette resistance: we typically use smaller tip diameters to minimize damage to the recording region of the slice.

    Reply
    Posted by: chris n.
    June 19, 2012 - 4:36 PM
  25. Hi, Prof. Norris:
    Great protocol to follow and precious comments to refer to. As a beginner to this tech, I have a few questions in my mind.
    1. Some papers claimed that they used sucrose-ACSF(0 Na 0 Ca) as the dissection medium, some even put AMPAR/NMDAR blocker(i.e. Kynurenic acid) and/or ascorbic acid in. According to your experiences, is there any difference btw sACSF and normal ACSF to the slice health? Is postsynaptic blocker and/or ascorbic acid necessary?
    ². In some literatures, they used different ways of anesthetization, such as barbiturates, TCA, ether, isoflurane, halothane etc. DŒs anesthetizing method affect the slice quality and the electrophysiological results? In this paper, you used CO², were there any possibility that the brain might get some anoxia-like influence or damage?
    3. For holding and recording temperatures, I found variable ways in different papers, is there any general principle of how to set the proper temperatures? In your paper, after slicing all the brain sections(put in ice cold 0Ca ACSF temporally), and tranfering them to ²7degree and gradually elevating temperature, is my understanding correct? Could you please tell me how much time will each step take(i mean, "cutting"->"temporally storage"->"recovery solution")?
    4. What are the proper cutting speed (mm/min) and vibrating frequency for hippocampal slices?
    5. what cutting direction is proper? longitudinally from CA3 corner to DG corner or the opposite, or laterally across hippo? or it dŒsn't matter?
    Thanks so much!
    sincerely,
    Hang

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:13 PM
  26. I have another question:
    6. In re to literatures, some used bipolar twisted electrodes and some used concentric electorde, do you have some comments to these two types?

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:21 PM
  27. i am very interesting the custom brain slice holdiing chamber, would you mind sharing the supplier?
    Thank you.

    Reply
    Posted by: CHIA S.
    March 26, 2013 - 3:23 AM
  28. Hi,

    I was very excited when I came across this video/article today, since my Masters project is going to be entirely based on recording after LTP induction on adult mouse hippocampi in vitro.

    I have just started trying to obtain decent slices, and have only gotten so far as extracting the brain from the mouse with acceptable quality. All that comes after has been a little bit frustrating so far. So, I have a few questions regarding the slicing step itself (we have the very same vibratome at our lab, which makes things easier, I guess!):

    - Every time I try to slice the brain, the blade actually pushes the brain away instead of cutting through it! This leads to either a completely useless slice or not even that, as the blade will only cut the last few milimiters of the brain and yield something not even worth calling a slice! The blades are brand new, but I bought them at a drugstore and they were intended to be shaving blades. Might that be the issue, a blade not sharp enaugh?

    - I haven't yet tried separating the hemispheres. Maybe I should do that!

    - I see you use this little block onto which you glue the brain (hippocampus, in your case). I've been using a sort of plate attached to the vibratome, which gŒs in the same place as the block. Do you reckon the block is a better call?

    - Do you have a better method for drying the cutting chamber after using it than letting the ice thaw and then sucking it up with vacum?

    If there are any remarks you should think of that haven't been shown in the video regarding the actual slicing step, I'd apreciate if you could share!

    Best regards,

    Thomaz Dias
    UFMG - Brazil

    Reply
    Posted by: Thomaz L.
    March 28, 2013 - 5:16 PM
  29. Great information here. I have a quick question about the aCSF containing bottle; would you keep it at room temperature or in a water bath at 34 degrees C?

    I will be recording at 34 degrees with a recording chamber heater and was wondering what would be the best way to hold the aCSF that is coming into the chamber?.

    I know there is an inverse relationship with dissolved oxygen and temperature in water, but would it be better to have it constant in the bottle and chamber or best to have it room temperature in the bottle and warm upto 24 degrees in the chamber?

    Any advice would be much appreciated.

    Minos

    Reply
    Posted by: Minos K.
    July 12, 2013 - 11:50 AM
  30. Hi
    Your projects are amazing. Oh here I can’t help sharing some experience of fabrication after designs done.
    We are working with a OverMolding vendor in China the name is Zetar Industry (http://www.zetarmold.com), Located in Shanghai China (a very big modern city). They are really good.Moving fast and very professional. They helped me with my new design. I asked them to do the injection mold, then Injection Moldingmass production. I was surprised by their rich experience in Insert Molding
    and punched lead time. Guys in Zetar deserve every good word just as you are.

    Reply
    Posted by: info z.
    September 2, 2013 - 11:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats