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Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

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Biology

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Summary

Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.

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Gomes, I. C., Acquarone, M., Maciel, R. d., Erlich, R. B., Rehen, S. K. Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (46), e2344, doi:10.3791/2344 (2010).

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Abstract

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste-Phase Anfang Säugerembryonen 1 abgeleitet. Eine entscheidende Etappe in der Differenzierung von ES-Zellen ist die Bildung von Embryoidkörpern (EVG) Aggregate 2, 3. EB Bildung ist auf spontane Aggregation basiert, wenn ES-Zellen in nicht haftenden Platten kultiviert. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm 4: Dreidimensionale EB rekapituliert viele Aspekte der frühen Embryogenese von Säugetieren und in die drei Keimblätter differenzieren.

Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sind allgemein Techniken für die Detektion von Target-Proteinen und mRNA in Zellen eines Gewebes § 5, 6, 7 verwendet. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik, um qualitativ hochwertige Gefrierschnitte von Embryoidkörpern generieren. Dieser Ansatz stützt sich auf die räumliche Orientierung der EB Einbettung in OCT gefolgt von den Gefrier-Technik. Die daraus resultierenden Abschnitte können auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Populationen von Zellen, die bestimmte Proteine, RNA oder DNA zu charakterisieren. In diesem Sinne sind die Herstellung von EB Kryoschnitten (10 um) wesentliche Instrumente für die Histologie Färbung Analyse (zB Hämatoxilin und Eosin, DAPI), Immunfluoreszenz (zB Oct4, Nestin) oder in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann auch dazu beitragen, Aspekte der Embryogenese in Bezug auf die Aufrechterhaltung des dreidimensionalen sphärischen Struktur des EBs zu verstehen.

Protocol

1. Fixation und Kryokonservierung

Pluripotenten Stammzellen wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) mit Mitomycin C inaktiviert und gepflegt in DMEM/F12 ergänzt mit 20% Knockout Serumersatz (KSR) und 8ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2) kultiviert. Um EB induzieren H9-Zellen wurden auf nicht-haftenden Schalen überführt und kultiviert für 7 Tage, in DMEM/F12 mit 15% KSR 8 ergänzt gepflegt.

Hinweis (!): Diese Technik kann für EBs aus allen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet werden.

  1. Sammeln Sie die EBs aus der Kulturschale mit einer Pipette.
  2. Transfer-EBs in ein 15 ml konischen Rohr und warten, bis das Material sinkt auf den Boden des Röhrchens.
  3. Nehmen Sie mittel-und fix EBs mit 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    Hinweis (!): Für in-situ-Hybridisierung Antigen Erholung sollte getan werden, um Cross-Link-Reaktion mit Antikörpern durch den Einsatz von PFA 6,7 zu vermeiden.
  4. Entfernen PFA-Lösung und Waschen mit PBS für 5 min.
  5. EBs sollte in Verdünnungsreihe PBS-gepufferte Saccharose-Lösungen (10, 20 und 30%, in Folge) bei 25-28 ° C gelegt, jede Lösung muss alle 30 min ersetzt werden. Das Material kann dann in der 30% Saccharose-Lösung bei 4 ° C, bis die Einbettung Schritt mit OCT gelagert werden.

2. Tissue Embedding, Ausrichtungs-und Gefrieren

  1. Sorgfältig sammeln EBs aus der Tube. Discharge so viel Saccharose-Lösung wie möglich.

    Hinweis (!): Es ist wichtig, an der inneren Wand der Spitze mit Saccharose-Lösung vor dem Sammeln der EBs nass. Dieser Vorgang kann zu vermeiden EB an der Spitze befestigt werden.
  2. Legen Sie EBs in der Form und Beseitigung fortbestehender Saccharose-Lösung mit Filterpapier.

    Hinweis (!): Es ist wichtig, nicht die Form mit EBs zu füllen, um Überschneidungen zu vermeiden.
  3. Fill Form mit OCT langsam, dabei nicht zu resuspendieren EBs. Danach legen alle EB in der Mitte der Form und entfernen Sie Luftblasen mit der Pipette.
  4. Mild für 15 Minuten rühren.
  5. Surround die Form mit zerkleinertem Trockeneis, um die Probe einfrieren. Oktober sollte komplett eingefroren werden. An dieser Stelle Blöcke können bei -70 ° C gelagert werden, für mindestens 1 Jahr.

3. Kryoschneiden Technik

  1. Entfernen Sie den gefrorenen Block von -70 ° C und am Kryostaten zuvor bei einer Temperatur zwischen -18 und -21 ° C abgekühlt

    Hinweis (!): Temperaturen außerhalb dieses Bereichs kann Schwierigkeiten Abschnitte Eisstockschießen, Schmelz-oder Rissbildung.
  2. Trennen Sie das OAT-Block aus der Form und legen Sie sie in den Kryostaten Unterstützung durch Hinzufügen weiterer Oktober
  3. Es ist wichtig zur Orientierung der Block richtig aufstellen und parallel zum Rand des Blattes.

    Hinweis (!): Wie EBs kleiner als andere Gewebeproben, ist dieser Schritt sehr wichtig, um den Verlust von Material zu minimieren.
  4. Oktober Blöcke sollten im Schnitt nur oberflächlich, bis die Oberfläche Ebene erhalten. Dünne Schnitte (10 um) der Gewebeprobe zu achten und montiert werden auf Glas-Objektträger zuvor mit 200 mg / mL Poly-L Lysin (10 l pro Folie) 9,10 beschichtet.

    Hinweis (!): Um torned Abschnitte zu vermeiden achten Sie auf eventuelle Schäden an der Klinge.
  5. Alle Abschnitte sollten luftgetrocknet werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend verwendet oder bei -70 ° C bis zur Verwendung.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode bietet eine einfach zu folgen Protokoll PFA fixiert dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern nützlich für Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung Assays zu erhalten. Die daraus resultierende Kryoschnitten erlauben die Untersuchung von zellulären und molekularen Aspekten der menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung unter Wahrung ihrer Struktur und Organisation als Aggregate.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Fundação de Amparo unterstützte eine Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und dem Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Wir sind dankbar, Bruna S. Paulsen und Aline M. Fernandes für die EB Bilder.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D (+) Sucrose Reagent Vetec 228
Paraformaldehyde Reagent Rieden-de Haën 16005
PBS solution Reagent LGC Biotecnology 13-30259.05
Poly-L-lysine hydrobromide Reagent Sigma-Aldrich P2636 200mg/mL in water
Tissue-Tek O.C.T. Compound Reagent Sakura Finetek P2636
Sucrose Solution Reagent 10% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution Reagent 20% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution Reagent 30% Sucrose Solution in PBS w/v
Conic Tube Tool Techno Plastic Products 91015 15mL conic tube
Plate shaker Tool Biomixer
Cryostat Tool Leica Microsystems CM 1850
Mold for OCT platform Tool Plastic mold plataform

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References

  1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
  2. Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
  3. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
  4. Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
  5. Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
  6. Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
  7. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588-5103 (2010).
  8. Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
  9. Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
  10. Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).

Comments

10 Comments

  1. Dear sir,

    I read the abstract of the paper, it's very interesting and I would like to read the full paper. could you please able to send this paper.
    Thanks a lot,
    Regards,
    Ranga

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2011 - 10:22 AM
  2. Dear Ranga,

    I would be glad to send you a pdf version of the article if you could give me your email.

    Best regards,

    Renata

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 31, 2011 - 3:27 PM
  3. Dear Renata,

    Thanks for your reply.

    here, I am giving my email ID details:
    rangarajan.sambathkumar@student.kuleuven.be
    or
    ranga.1987@hotmail.com

    Thank you so much.

    Kind Regards,
    Ranga.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 31, 2011 - 5:27 PM
  4. Dear Dr,

    I read the abstract of this paper, it's very interesting. I'm working on embryonic stem cell differentiation into cardiomyocytes using formation of embryoid bodies. I would like to do cryosection of embryoid bodies in few weeks using OCT and I would like to read the full paper if it's possible and maybe see the video. could you please able to send this paper and video.
    Thanks you very much,

    Sincerely,

    Christophe.

    ps: could you please contact me using these email : christophe.fadainia@umontreal.ca

    aiolia²0@hotmail.com thank you very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 12:29 PM
  5. Dear Dr,

    I read the abstract of this paper, it's very interesting.
    I'm working on embryonic stem cell differentiation into hematopoietic stem cells using formation of embryoid bodies. I would like to do cryosection of embryoid bodies, so I want to read the full paper.
    Could you please able to send this paper? (pdf version)
    Thanks you very much.

    Sincerely,

    ji-hye jung

    (could you please contact me using this email : jhtree08@hanmail.net , jhtree08@korea.ac.kr)




    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2011 - 4:14 AM
  6. Dear Dr:

    I am working on ES cells differentiating into viseral yolk sac stracture embryo bodies. I have read the abstract of your video, it is very interesting. At the moment I am very stucked by the cryosection of EBs. Although I have tried several times, I still could not get any result from it. Could you please send this video or paper or both to me? My Email address is jamie5188@live.cn.

    Thank you very much.

    Congshan Sun

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2011 - 5:53 AM
  7. Dr. Renata de Moraes Maciel

    Could you please send me a copy of this artile?
    I am also working on mouse ES cell differentiation to mesederm-type cells. I hope I can use this tech. in my research.

    Piyan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 25, 2011 - 5:26 PM
  8. Dr. Renata de Moraes Maciel


    Could you please send me a copy of this artile?

    I am also working on mouse ES cell differentiation to mesederm-type cells. I hope I can use this tech. in my research.


    Piyan

    My Email: zhang.piyan@mayo.edu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 25, 2011 - 5:27 PM
  9. Dear Dr,

    I am having major difficulties in fixing my EB's for cryosections. It would be most helpful to be assisted by your paper. Would it be possible for you to send it to my email account? it is meital_gabay@urmc.rochester.edu

    Also, I can't gain access to this movie through our library, is it possible to send that as well?

    Thank you,

    Meital

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2011 - 12:41 PM
  10. Dear Dr,
    I'm actually working on induced pluripotent stem cells and more specifically, the differentiation into mesoderm-derived cells using formation of embryoid bodies. That's why I am very interested in reading your article. Is it possible that you send me a pdf version ? My Email address is : jbrault@chu-grenoble.fr.
    Thank you in advance.
    Sincerely,
    Julie Brault

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 11:33 AM

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