Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

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Biology

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Summary

Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano

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Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (49), e2452, doi:10.3791/2452 (2011).

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Abstract

As mitocôndrias são organelas controlar a vida ea morte da célula. Eles participam nos principais reações metabólicas, sintetizar a maior parte do ATP, e regular uma série de cascatas de sinalização 2,3. Pesquisadores passadas e actuais, mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos tecidos como fígado, cérebro e coração 4,5. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram em estudar a função mitocondrial dos músculos esqueléticos.

Aqui, descrevemos um método que temos utilizado com sucesso para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético 6. Nosso procedimento requer que todos os tampões e reagentes são feitas fresco e precisa de cerca de 250-500 mg de músculo esquelético. Foram estudadas mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos gastrocnêmio e diafragma e os músculos extra-oculares de ratos. Concentração de proteína mitocondrial é medido com o ensaio de Bradford. É importante que as amostras mitocondrial ser mantida gelada durante a preparação e que estudos funcionais ser realizada dentro de um prazo relativamente curto (~ 1 hr). Respiração mitocondrial é medida usando polarografia com um eletrodo do tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. Calibração do eletrodo de oxigênio é um passo fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente. Mitocôndrias isoladas (150 mg) são adicionados a 0,5 ml de tampão experimental (EB). Estado respiração 2 começa com adição de glutamato (5mM) e malato (2,5 mM). Então, difosfato de adenosina (ADP) (150 mM) é adicionado para começar estado 3. Oligomicina (1 mM), um bloqueador sintase ATPase, é usado para estimar o estado 4. Por último, carbonil cianeto de p-[trifluoromethoxy]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 mM) é adicionado à measurestate 5, ou não atrelados a respiração 6. A relação de controle respiratório (RCR), a relação entre o estado 3 para o estado 4, é calculado depois de cada experimento. Um RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis.

Em resumo, apresentamos um método para o isolamento de mitocôndrias viáveis ​​a partir de músculos esqueléticos que podem ser usadas em bioquímica (por exemplo, atividade enzimática, imunodetecção, proteômica) estudos e funcionais (respiração mitocondrial).

Protocol

1. Preparação de Buffers

  1. Ligue 5804R centrífuga e definir a 4 ° C. Ligue Isotemp banho de água 3006D e definida para 37 ° C.
  2. Preparar as soluções seguintes antes de isolamento muscular:
    • PBS: Dissolver tampão fosfato salino (PBS) comprimidos em água destilada (5 comprimidos / litro). Misture bem.
    • PBS acrescido de 10 mM EDTA: Para preparar uma solução de 100 ml, adicionar 2 ml de 500 mM EDTA a 98 ml de PBS.
    • Buffer de mitocôndrias 8X: 10,28 g de sacarose para uma concentração final de 0,6 M, 400 mg de ácido graxo livre-albumina sérica bovina (BSA) para uma concentração final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para uma concentração final de 160 mM, pH para 7,4 e QS de 50 ml com água destilada.
    • Tampão de isolamento 1 (IB1): Adicione 200 mL de 500 mM EDTA para uma concentração final de 10 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mM, 1,25 ml de 8X mitocôndrias tampão pH, para 7,4 e QS a 10 ml com água destilada.
    • Tampão de isolamento 2 (IB2): Adicionar 60 mL de 500 mM EGTA para uma concentração final de 3 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mM, 1,25 ml de 8X mitocôndrias tampão pH, para 7,4 e QS a 10 ml com água destilada.
    • Tampão Experimental (EB): Adicionar 100 l de 500 mM MgCl 2 para uma concentração final de 5 mM, 0,392 g de D-manitol para uma concentração final de 215 mm, 25 mL de 2,5 mM KH 2 PO 4 para uma concentração final de 6,25 mM, 2 l de 100 mM EGTA para uma concentração final de 20 mM, 1,25 ml de tampão mitocondrial, pH de 7,4 e QS a 10 ml com água destilada.

2. Isolamento muscular

  1. Em um balde de gelo, colocar três copos de 10 ml, moedores Potter-Elvehjem tecido e todos os outros instrumentos necessários / supplies no gelo. Tudo deve ficar gelada durante todo o experimento.
  2. Lugar IB1 e IB2 em balde de gelo e EB em banho de água quente quando terminar.
  3. Nos três copos 10 ml, as seguintes soluções devem ser adicionadas:
    • Copo 1: 10 ml de PBS
    • Copo 2: 10 ml de PBS / EDTA
    • Copo de 3: 3 ml de IB1
  4. Matar um rato humanamente aprovado pelo seu Animal Care locais Institucional e Comitê de uso.
  5. Isolar rapidamente 250-500 mg de músculo esquelético, lavar em uma taça, e transferir para Beaker 2.

3. Homogeneização / isolamento mitocondrial

  1. Transferência de músculo para copo de 3 e finamente picada do músculo com uma tesoura.
  2. Transferir a solução para o homogeneizador Potter-Elvehjem. Homogeneizar o músculo usando um pilão motorizado (uma imprensa de broca irá fazer o trabalho) 10 vezes mantendo o tubo no gelo em todos os momentos.
  3. Transferência de homogenato de pré-refrigerados tubos de microcentrífuga 2 ml e centrifugar a 700 g por 10 minutos a 4 ° C.
  4. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados. Descartar pellet.
  5. Centrifugar o sobrenadante do 10.500 g por 10 minutos a 4 ° C.
  6. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados e SN1 etiqueta (número sobrenadante 1) e tipo de músculo.
  7. Re-suspender pellet em 500 mL de IB2.
  8. Centrifugar a 10.500 g por 10 minutos a 4 ° C.
  9. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo pré-refrigerados e SN2 etiqueta (número sobrenadante 2) e tipo de músculo.
  10. Suspender finais mitocondrial pellet em 100 ml de IB2.
  11. Re spin-finais suspensão mitocondrial em minifuge por alguns segundos. Se houver um pellet, transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-refrigerados e descartar o pellet.
  12. Determinar a concentração de proteína utilizando o ensaio de Bradford 8.

4. Calibração do eletrodo

NOTA: calibração do eletrodo Completa durante o isolamento mitocondrial.

  1. Adicione 100 ml de água destilada para 250 ml. Mexa vigorosamente por 20 minutos para equilibrar a água com gás atmosférico.
  2. Adicione algumas gotas de 50% KCl no eletrodo Oxygraph.
  3. Coloque um pequeno pedaço de papel de Blue Rizla rolando em cima do eletrodo.
  4. Coloque um pedaço de membrana PTFE em cima do papel para enrolar.
  5. Aplicar o anel interno utilizando o aplicador de anel e, em seguida, coloque o anel externo na ranhura do eletrodo.
  6. Conectar eletrodos e montar o resto do equipamento: base maior anel de plástico, câmara mitocondrial, e mangueiras de água.
  7. Ligar caixas de Oxygraph e começar software Oxygraph.
  8. Adicione a água equilibrada para a câmara mitocondrial.
  9. Adicionar agitar bar e ligue a uma velocidade de 60.
  10. Começar uma nova experiência.
  11. Clique em calibrar e, em seguida, a calibração de fase líquida para Box 1. Mudança de temperatura para 37 ° C e clique em "OK" duas vezes.
  12. Quando "Substituir" muda para "OK" clique nele e abrir o tanque de gás nitrogênio.
  13. Ponta lugar conectadopara o tanque de nitrogênio na câmara e estabelecer oxigênio zero. Clique em "OK" quando se muda de "Ignorar".
  14. Aspirar água e adicionar 500 mL de tampão EB às câmaras mitocondrial.
  15. Vedação de câmara com êmbolo.
  16. Se estiver usando várias caixas, repita os passos 11-15 para calibração de Caixa 2.

5. A respiração mitocondrial

  1. Iniciar uma nova experiência; deixá-lo correr por cerca de 1 minuto para estabilizar sinal.
  2. Adicionar o volume necessário da suspensão mitocondrial (passo 3.11) para 150 mg em cada câmara, o evento marca, e deixá-lo correr por 1 minuto.
  3. Adicionar 10 ml de morno 250 mM/125 mM glutamato / malato para uma concentração final de 5 mM mM/2.5. Marca e deixar correr por 1 minuto. Esta é definida como estado 2.
  4. Adicionar 7,5 mL de 10 mM ADP para uma concentração final de 150 mM, marca, e deixar correr por 30 segundos. Isto é definido como Estado 3.
  5. Adicionar outro mL 7,5 mM ADP, de 10, marca, e deixar correr para 1,5 minutos.
  6. Adicionar 0,5 mL de oligomicina mM frio 10 para uma concentração final de 1 mM, marca, e deixar correr por 3 minutos. Isto é definido como Estado 4.
  7. Adicionar 1 ml de frio 0,1 mM FCCP para uma concentração final de 0,2 mM, marca, e deixar correr por 3 minutos. Isto é definido como Estado 5.
  8. Quando terminar, final experimentar e salvar.
  9. Adquirir taxas de respiração usando software Oxygraph.
  10. Digite fator de normalização: se a adição de 150 mg de proteína mitocondrial, o fator de normalização será 0,15.
  11. Calcular as taxas de respiração normalizada para os estados de respiração diferente.
  12. Calcular a Razão de Controle Respiratório (RCR) dividindo-se 3 por Estado Estado 4.

6. Resultados representativos:

Figura 1
Figura 1. Mostra um representante rastreamento do consumo de oxigênio pelo músculo esquelético mitocôndrias. Após o sinal de eletrodo é estabilizado, a amostra mitocôndria é adicionado à câmara Oxygraph. Estado respiração 2 começa com adição de glutamato e malato. Adição de ADP aumenta o consumo de oxigênio, que define a respiração estado 3. ATP sintase é bloqueada pela adição de oligomicina para obter a respiração estado 4. Finalmente, FCCP é adicionado ao desacoplar respiração mitocondrial (estado 5). Tabela 1 mostra as taxas de consumo de oxigênio representante para os estados 2, 3, 4 e 5. A relação de controle respiratório (RCR) é calculado para cada experimento. RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis.

Estados

Preços normalizado

Estado 2

34,74

Estado 3

153,40

Estado 4

16,49

Estado 5

143,70

RCR

9,30

Tabela 1. Taxas de respiração mitocondrial. Taxas de consumo Representativeoxygen do músculo esquelético mitocôndrias. Os valores são normalizados para a quantidade de mitocôndrias adicionado à câmara. A relação de controle respiratório (RCR) é determinado pela divisão do estado 3 por estado 4. Um RCR ≥ 4 representa uma preparação viável mitocôndrias.

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Discussion

Nós apresentamos um protocolo para isolar mitocôndrias viáveis ​​do músculo esquelético. Se o rendimento é um problema, o protocolo pode ser modificada, incubando o músculo isolado em 5 ml de tripsina EDTA/0.01 PBS/10mM% por 30 minutos em gelo. Para assegurar a digestão muscular completo com tripsina, o músculo precisa ser totalmente picada. Após a incubação de 30 minutos, a solução de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% deve ser completamente substituído com 3 ml de isolamento tampão 1 (IB1). Além disso, o uso de tripsina pode interferir com alguns substratos mitocondrial durante o protocolo de respiração. Todos os substratos utilizados neste resultado protocolo em boas preparações mitocondriais ao utilizar de tripsina.

Para os músculos esqueléticos do rato, o melhor é combinar os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, ou usar o diafragma todo. Para os músculos esqueléticos de ratos, uma pequena seção do gastrocnêmio ou diafragma é suficiente. Massa muscular em excesso pode complicar o processo de isolamento e resultar em rendimentos mais baixos. Para o isolamento de músculos muito pequenos, como os músculos extra-oculares, é necessário para os músculos piscina de mais de 1 animal para obter a massa muscular necessária.

Este protocolo se refere a dois sobrenadantes diferentes: SN1 e SN2. Estes sobrenadantes são o resultado de centrifugação diferencial e contêm proteínas não-mitocondrial. Proteínas a partir desses sobrenadantes e da final pellet mitocondrial pode ser utilizado em western blots para verificar a pureza da preparação mitocondrial. Western blots utilizando anticorpos mitocondrial e citoplasmática confirmam a pureza de sua preparação mitocondrial no pellet final.

Limpeza do equipamento de respiração mitocondrial é essencial para uma experiência de sucesso. Após cada experimento, as câmaras devem ser limpas da seguinte maneira: lavar câmaras cinco vezes com água destilada, lavar uma vez com etanol 70% para remover o etanol solúvel em substratos, lave com uma solução saturada de PBS / BSA para cerca de 5 minutos, finalmente, lavar câmaras 5 vezes com água destilada. Clark tipo eletrodos devem ser limpos após cada uso, enxaguando várias vezes com água destilada e suavemente limpo com uma escova de dentes. Então, eles devem estar completamente secos com emprestou sem wipes e armazenados em um dessecador. Uma vez por semana, os eletrodos devem ser polidas usando o kit de polimento Oxygraph.

Substratos mitocondrial são preparadas como soluções estoque, aliquotado e armazenado a -20 o C. Não recomendamos a reutilização de substratos. Em nossa experiência, a maioria dos substratos são estáveis ​​a -20 º C durante vários meses, exceto para oligomicina que deve ser substituído a cada dois meses ou assim. Sempre consultar as especificações do fabricante para obter mais detalhes.

Finalmente, este protocolo também pode ser usado para isolar mitocôndrias do coração. Como para outros músculos, o tamanho do animal (rato vs mouse) irá determinar qual é a fração do órgão é necessária para obter a mitocôndria suficiente.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY12998) para FH Andrade.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95% CO2 / 5% O2 mix Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Blue Rizla Paper Hansatech 890101
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Centrifuge 5804R Eppendorf
Compressed nitrogen Local Gas Supplier
D-mannitol Sigma-Aldrich M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio-Rad 161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806
Glutamic acid Sigma-Aldrich G5889
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7006
Isotemp 3006D Fisher Scientific
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Male Sprague Dawley Rats Harlan Laboratories 300-500g
Malic acid Sigma-Aldrich M9138
Minifuge ISC Bioexpress C1301P
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxygen electrode disc Hansatech S1
Oxygraph Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software Hansatech
pH-meter Mettler Toledo 1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P8416
Potter-Elvehjem homogenizers Fisher Scientific 08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane Hansatech S4
SKIL 3320 drill press Hardware store
Sucrose Sigma-Aldrich S5016

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References

  1. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
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  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Comments

1 Comment

  1. I'm sorry, I don't typically feel the need to interject, but I feel that the information in this protocol is lacking and at times inaccurate. While the buffers and general protocol are by and large correct, following the procedures shown in the video will yield low State 3 rates and the absence of a true "State 4," without the addition of oligomycin. While it is true that State 4 rates in the literature are generally reported in the presence of oligomycin, the absence of a progression to State 4 as described by Chance and Williams in 1955 indicates swollen, broken, leaky mitochondria and a poor preparation. Furthermore, State 5 here is described as after FCCP addition, which is in reality a modified State 3, sometimes called as "State 3U", or State 3 Uncoupled, as described in a letter by John Lemasters. State 5 is actually characterized by the absence of oxygen in the reaction chamber, and therefor a very low oxygen consumption rate.

    Reply
    Posted by: Dieter K.
    March 6, 2013 - 8:08 PM

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