Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Neuroscience
 

Summary

Этот метод описывает генерацию органотипической мозжечка культур и действие определенных апоптоза стимулов на жизнеспособность различных типов клеток мозжечка.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hurtado de Mendoza, T., Balana, B., Slesinger, P. A., Verma, I. M. Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection. J. Vis. Exp. (51), e2564, doi:10.3791/2564 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Органотипической культурах нейронов ткани были впервые введены в 1947 году Hogue 1,2 и составили значительный прорыв в области нейронауки. С тех пор техника получила дальнейшее развитие и в настоящее время Есть много различных способов подготовить органотипической культур. Метод, представленный здесь было приспособлено от того, описывается Stoppini и соавт. Для подготовки ломтиками и от Gogolla и соавт. Для окрашивания процедура 3,4.

Уникальная особенность этого метода является то, что он позволяет изучать различные части мозга, таких как гиппокамп и мозжечок в их первоначальную структуру, обеспечивая большое преимущество перед диссоциированных культурах, в котором все клеточной организации и нейронных сетей нарушена. В случае мозжечка это даже более выгодно, поскольку позволяет изучать клеток Пуркинье, чрезвычайно трудно получить как диссоциированных первичной культуре. Этот метод может быть использован для изучения некоторых особенностей развития мозжечка в пробирке, а также для электрофизиологических и фармакологических экспериментов в обоих дикого типа и мутантных мышей.

Описанный здесь метод был разработан для изучения влияния апоптоза стимулы, такие как Fas лиганда в развивающихся мозжечка, используя TUNEL окрашивания для измерения апоптоз клеток. Если TUNEL окрашивания в сочетании с типом клеток специфических маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье, можно оценить гибель клеток в популяции клеток, определенным образом. Окрашивание кальбиндин также служит для оценки качества мозжечка культур.

Protocol

1. Органотипической мозжечка культур:

  1. Чтобы успешно генерировать органотипической мозжечка культуры используют мышей между P0-P3 или P8-P12. Для нашего эксперимента мы использовали мышей в P8-P12 диапазона, поскольку эта стадия развития является более приемлемым для нашего исследования.
  2. Подготовка вскрытие и культуральной среде:
    1. Рассечение мозга и нарезать подготовке проводятся в странах с низким натрия Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF), содержащего 1 мМ хлорида кальция, 10мм D-глюкозы, 4мм хлорид калия, хлорид магния 5 мМ, 26 мм бикарбоната натрия, 246mM сахарозы и фенол красный раствор (1:1000) , рН 7,3. Для стерилизации решение, процеживают через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° C.
    2. Мозжечка ломтиками культивируют в 75% минимально необходимого среднего Eagle (MEM), 25% тепла инактивированной лошадиной сыворотки, 25 мМ HEPES, 1 мМ глутамина, 5 мг / мл, глюкозу, пенициллин (100 ЕД / мл) и стрептомицин (100 ЕД / мл). Фильтры среды, через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение максимум двух недель.
  3. Рассеките мозга в ледяной средой ACSF ранее пузырилась с карбогена (95% кислорода и 5% углекислого газа) Отметим, что насыщение карбогена изменится рН раствора таким образом это будет переход от красного до оранжевого. Вскрытие должно проводиться в минимальный промежуток времени возможны будьте осторожны, чтобы не повредить структуру мозга.
  4. Нарежьте мозга в сагиттальной разделы 400 мкм использованием vibratome.
    1. Сделать сагиттальной вырезать бритвой в одном полушарии, пытается сократить как можно меньше мозжечка; это обеспечит ровную поверхность для резки. Кора используется только для поддержки, чтобы сделать нарезки проще, но поскольку время является важным вопросом удобнее вырезать ростральной половины коры с лезвия бритвы.
    2. Используйте цианоакрилат (суперклей), чтобы исправить положение мозга на пластине vibratome металла. Важно, чтобы охладить пластины на льду перед добавлением клея и распространить ее также с помощью иглы трубки для формирования тонкого слоя клея. Если есть превышение суперклей, он будет отключаться от пластины, когда он вступает в контакт с ACSF и образца, будут потеряны.
    3. Как только мозг подключен к vibratome плиты, добавить достаточно средств массовой информации ACSF для покрытия мозга и положить лед под пластиной, чтобы держать это холод.
    4. Вырезать 400 мкм ломтиками и передача их с пластиковой пипетки Пастера (вырезать наконечник расширить его и избежать повреждения ломтиками) до 6-и клеточных культур пластины, содержащей ACSF на льду.
    5. Отдельные мозжечка от остальной части мозга с помощью двух инсулиновые шприцы (шприцы с малым диаметром 28-иглы) при вскрытии микроскопом. Некоторые ломтиками будет суперклей прилагается к краям: это момент, чтобы попытаться удалить его, как это может повлиять на жизнеспособность срез. Важно сделать это аккуратно, не повреждая структуры мозжечка.
  5. Передача мозжечка ломтиками до 6-луночных содержащие 30 мм вставки пластины культуры с 0,4 мкм поры. Добавить 1 мл культуральной среды на лунку, которая была заранее обусловлена ​​инкубации в течение не менее 2 часов при 37 ° С и 5% СО 2 (в культуре клеток инкубатор). Место вставки на верхней части средств массовой информации убедившись, что Есть нет воздушных пузырьков под, а затем поместить мозжечка ломтиками (1-3 в вставке) в верхней части вставки убедившись, что они в полной мере расширены и что ни жидкость покрывает их. Аспирируйте избыток средств массовой информации, если это необходимо. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 меняется медиакультуры каждые 2 или 3 дня. Лучше всего заменить только часть среды (например, ½ объема) сразу, так как использовались среда содержит часть полученных трофических факторов, которые важны для выживания клеток.

2. Лечение Fas и окрашивание мозжечка фрагменты:

  1. Для эксперимента апоптоза задача, мы впервые культуры ломтики в течение 5 дней меняется СМИ в день в пробирке 3 (div3). На DIV5 культур относятся с 0,5 мкг / мл антитела Jo2 агонист Fas, добавив его непосредственно к средствам массовой информации для того, чтобы иметь чистую фоне гибели клеток с изменениями средства массовой информации может вызвать некоторые смертности в культурах. Половина скважин оставлены без рассмотрения в качестве контроля.
  2. После 24 часов удалить СМИ под вставки на всасывание. Чтобы исправить ломтиками, добавить 1 мл ледяной 4% PFA ниже и выше 1 мл вставки. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  3. Через 10 минут удалите PFA и промыть холодной кратко PBS.
  4. Следующая удалить PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставка 20% ледяной метанола в PBS и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Вымойте снова PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставить в размере 0,5% Triton-X-100 в PBS для пермеабилизации. Инкубировать минимум 12 часов при температуре 4 ° C.
  6. После пермеабилизации, блок с 20% BSA в PBS в течение минимум4 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. На данном этапе ломтиками могут храниться в блокировании решения, по крайней мере 3-х дней при температуре 4 ° C.
  7. Для того, чтобы пятно ломтики аккуратно вырезать кусок мембраны вставить прилагаемый к мозжечковой нарезать и перенести его на 24-луночных содержащие PBS.
  8. Иммуноокрашивания осуществляется последовательно, сначала с реагентом TUNEL в течение одного часа, а затем с антителами Calbidin ночь.
    1. Аспирируйте PBS и добавьте 250 мкл с TUNEL реагента в каждую лунку убедившись, что он покрывает всю поверхность среза. Инкубировать при 37 ° С в течение одного часа в темноте.
    2. Через час удалить TUNEL смесь и промыть PBS три раза в течение 10 минут.
    3. После последнего вымыть, удалить PBS и добавьте 250 мкл 1 / 1000 разведение антител кальбиндин в ФБР и инкубировать в течение ночи при 4 ° С в темноте.
    4. Удалите первичный решение антител и промыть PBS три раза в течение 10 минут.
    5. Добавьте 250 мкл вторичными антителами разбавленного 1 / 500 в PBS и выдержать в течение не менее трех часов при комнатной температуре в темноте. Комплект TUNEL мы использовали помечена красным ПМР, поэтому наши вторичные антитела для кальбиндин сопряжена с Alexa-488.
    6. Вымойте три раза в течение 10 минут с PBS и смонтировать ломтиками на предметное стекло микроскопа использованием установки средств массовой информации, которая содержит DAPI.
    7. Изображение ломтики с использованием конфокальной микроскопии 488 нм и 561 нм длине волны возбуждения для кальбиндин и TUNEL соответственно.

3. Представитель Результаты:

Основной задачей этого протокола является возможность генерировать здоровую часть мозжечка культур, тем более что наша конечная считывания будет гибель клеток. Здоровой культуры предстает как тот, где слоем клеток тела полупрозрачным и позволяет вам видеть слоеного структуры мозжечка под микроскопом (рис. 1). Через несколько дней в культуре ломтиками начать редеть и не-нервных клеток можно наблюдать миграцию от краев среза. Темные клетки круглой (скорее всего, макрофаги), которые покрывают ломтиками через несколько дней в культуре, в конечном итоге снижение числа через 10-14 дней в пробирке (рис. 2) 5. Окончательным доказательством жизнеспособности ломтиками является пятном на различных клеточных маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье. На рисунке 3 показана представитель конфокальной микроскопии изображение слоя клеток Пуркинье с несколькими TUNEL положительных ядер.

Важно учитывать, что даже если некоторые ломтики получил апоптоза стимул, они только подвергаются в течение 24 часов. Это позволило достаточно времени, чтобы наблюдать фрагментацию ДНК в умирающей клетки с окрашиванием TUNEL, но определенный слой клеток Пуркинье по-прежнему присутствует.

Рисунок 1
Рисунок 1. Здоровый мозжечка срез div2. Это изображение показывает полупрозрачный слой клеток организма и слоеного мозжечка структуры в здоровую часть.

Рисунок 2
Рисунок 2. Здоровый мозжечка срез DIV 7. На этом снимке мы все еще ​​можем наблюдать слоеного структуры мозжечка и появление темных тел клетки.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель образ Fas обработанных мозжечка срез. Конфокальной Это изображение показывает Пуркинье клеток, окрашенных кальбиндин (зеленый) и апоптоза клеток положительным для окрашивания TUNEL (красный). Клетки Пуркинье, не отображаются в одной строке, но сгруппированы формирования лепестка-подобные структуры.

Discussion

Этот метод описывает один из многих возможных применений нейронных органотипической культур, и это позволило нам изучить влияние апоптоза стимулов в дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками.

Наиболее важной частью этого опыта, чтобы иметь возможность последовательно генерировать здоровую мозжечка культур срез. Ключевыми факторами являются рассечение и нарезая технику и способность выполнять протокол хотя бы раз можно, но в то же время будьте осторожны, чтобы не повредить кусочки. Другим важным фактором является подготовка и состав питательной среды, эти культуры очень чувствительны, поэтому нам пришлось испытать несколько рецептов и марки носителей. Даже различных партий сыворотки или любые другие компоненты средств массовой информации могут повлиять на жизнеспособность ломтиками. Мы получили лучшие результаты с лошадиной сыворотки от Invitrogen Лот № 480116.

После мозжечка ломтиками генерируются можно изучать мозжечка развития, электрофизиологии, выживаемость клеток в одиночку или в ответ на раздражители апоптоза, эксайтотоксичность или кислородное голодание. Сравнительные исследования с использованием дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками был очень проницательным во многих аспектах функции мозжечка и развития.

Disclosures

Все животные работ, проводимых было сделано в соответствии с политикой, установленной IACUC. Солка Институт AAALAC аккредитованных объекта.

Acknowledgements

Это исследование было частично финансируется IPSEN Foundation. IMV является американский профессор онкологического общества молекулярной биологии, а также заведует кафедрой Ирвина и Джоан Джейкобс в Образцовый наук о жизни. Эта работа была частично поддержана грантами NIH, Leducq фонда, Фонда Meriaux, Эллисон Медицинский фонд, Ипсен / Biomeasure, Sanofi Aventis, рака простаты фонда и HN и Фрэнсис С. Бергер Foundation. PAS финансируется McKnight дарственного фонда для неврологии и Национального института по злоупотреблению наркотиками (R01 DA019022). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Шмитта. Графика была разработана Джейми Т. Симоном. Спонсорство был любезно предоставлен Invitrogen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM Invitrogen 11090
Horse Serum Invitrogen 16050
Hepes Invitrogen 15630
Glutamine Invitrogen 25030
Penicillin/ Streptomycin Invitrogen 15140
Superglue Krazy Glue
6 well / 24 well cell culture plates Corning 3506/ 3527
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) EMD Millipore PICM03050
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) BD Biosciences 554254
In situ cell death detection kit, TMR red Roche Group 12 156 792 910
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody Swant CB-38a
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody Invitrogen A-11008
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Dissecting Microscope Carl Zeiss, Inc.
Vibratome Leica Microsystems
Confocal Microscope Leica Microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
  2. Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
  3. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).

Comments

5 Comments

  1. Good afternoon, thank you for your information, I will again to do cultures, but I dont have carbogen to bubble, but I have a incubator with 5% CO², may I to sustitute this step? thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 27, 2011 - 4:44 PM
  2. The function of Carbogen is to 1) oxygenate and to ²) set the pH of the ACSF. While putting the ACSF in the incubator would help achieve aim ², the level of oxygen dissolved would be probably quite low as the incubator temperature is 37'C and it contains only ~²0% oxygen (like in the normal air). Therefore, it would be really desirable to use Carbogen to bubble the cold ACSF

    Reply
    Posted by: Bartosz B.
    July 27, 2011 - 6:32 PM
  3. I have a question with respect to organotypic slice culture. We have performed the migration study of cancer stem cell on brain xenograft model using organotypic slice culture. Also, to observe the migration of cancer stem cell, we have used to Live imaging machine. After set-up of slice culture onto the machine (37 and 5% CO²), our whole brain or our fluorescence-labelled cancer stem cell were saturated as green at 4hours after set-up. Because of this phenomenon, we can not observe cell movement. Why? Is this autofluorescence by damage of brain on preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 17, 2012 - 10:03 PM
  4. I dont have experience with live imaging of slices but it is possible that after several hours in the microscope chamber the slices are dameged and become autofluorescent.

    Reply
    Posted by: Tatiana H.
    December 20, 2012 - 3:21 PM
  5. Hi,
    Could you mention the CARBOGEN catalog number. I would like to order one?

    Thank-you,
    Regards, Naveen


    Naveen.

    Reply
    Posted by: naveen k.
    June 4, 2013 - 2:23 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics