엔지니어링된 심장 조직 이식 다음과 같은 면역 반응의 평가 (EHT)에 대한 Bioluminescence 이미징

Bioengineering

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Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., Reichenspurner, H., Robbins, R. C., Eschenhagen, T., Schrepfer, S. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. (52), e2605, doi:10.3791/2605 (2011).

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Abstract

심장 조직 공학의 다양한 기법을 기본 또는 bioartificial 중 발판 재료, 같은 섬유소 또는 콜라겐 등 hydrogels에 심장 myocytes의 함정 수사와 myocyte monolayers 1 스택을 사용하여 비계 전략을 포함하여 지난 수십 년간 추진하고 있습니다. 이러한 개념은 손상된 심장 기능 (예 : 심근 경색 후)의 복원 또는 실험 모델 (예 : 예측 독성학 및 약물 검사 또는 질병 모델링)로 목표로하고 있습니다. 설계 심장 조직 (EHT)의 주입 후 세포 생존의 정확한 모니터링 이제 bioluminescence 이미징 (BLI) 기법 2 - 생체내에서 사용 가능한되었다. 여기 반딧불 루시페라제 (; 3 로사 / 루시페라제 - 루 TG)의 유비 쿼터스 표현과 유전자 변형 쥐 긴장에서 섬유소 기반 EHT의 생성에 대해 설명합니다. 주입은 주입 EHT 다음받는 유기체의 면역 반응을 평가하기 다른 쥐 종자의 큰 omentum으로 수행됩니다. BLI와 효소 링크된 단백질 스팟 기법 (ELISPOT) 면역 반응의 평가 BLI의 가용성을 확인에 의해 생성된 결과의 비교.

Protocol

1. EHT 생성 및 문화 약관

섬유소 기반 EHT의 제조는 다른 설명된대로 수행되었다. 간단히, 주입 목적으로 섬유소 기반 EHT를 생성하는, 마스터 믹스는 신생아 로사 / 루시페라제 - 루 형질 전환 쥐의 마음 소 피브리노겐 및 Matrigel에서 분리된 세포를 포함하는 준비되었다. 아가로 오스 캐스팅 금형은 6 잘 문화 요리에 위치 테플론 스페이서를 사용하여 준비되었습니다. 아가로 오스의 응고 후, 스페이서가 제거되었으며 실리콘 포스트 랙에은 금형에 도달 게시물 문화 요리에 배치했다. EHT를 생성하려면, mastermix는 간략하게 트롬빈의 계산된 금액과 혼합하여 몰드에 pipetted되었습니다. 섬유소의 polymerisation 후 게시물을 준수 EHTs와 실리콘 랙에은 부드럽게 주문 제작을 사용하여 새 6 - 웰 세포 배양 접시에 전송하고 37 ° C, 7% CO 2 세포 문화 인큐베이터 유지 아가로 오스 주조 금형에서 제거되었습니다 세포 배양 매체.

EHT는 일 열까​​지 세포 배양 조건 하에서 유지되었습니다. 이 기간 동안 신생아 쥐의 심장 세포는 길쭉한, 인터커넥트 시작 실리콘 게시물 사이에 강제로 라인을 따라 정렬합니다. 이식 당시, 자발적인 일관된 수축은 실리콘 게시물을 왜곡하고,​​ 관찰되었다.

2. EHT 주입

EHT 주입은 allogeneic 면역 반응을 조사하기 위해 면역 적격 브라운 노르웨이 (BN) 쥐, 또는 immunodeficient 누드 쥐 중 하나에서 수행되었다. 100 무게 BN와 누드 쥐 - 150g 찰스 강 독일 (Sandhofer 웨그 7 D - 97633 Sulzfeld)에서 구입하여 기존의 조건, 공급 표준 쥐 차우와 물 광고 libidum 아래에서 지내게되었습니다. Immunodeficient 쥐는 무균 침구, 버팀대 및 소독 물 사용에 보관되어 있습니다. 독일 윤리 심사위원회는 검토와 동물 절차를 승인했다. 모든 수술기구는 사용하기 전에 소독을하고 있습니다.

주입 절차는 다음과 같이 수행됩니다 :

랫은 유도 챔버를 사용하여 (2.5-3 %) isoflurane과 anesthesized 있습니다. isoflurane으로 인간의 노출은 downdraft 테이블이나 이외의 순환 모자에서 작업으로 줄일 수있다. 체온은 수술하는 동안 유지됩니다.

  1. 복부 영역을 면도하고 마취 동안 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
  2. 의 뒷면에있는 쥐를 삽입하고 마취를 유지하기 위해 코와 입을 통해 안면을 넣으십시오.
  3. Betadine 그리고 80 % 에탄올을 사용하여 복부 지역을 소독. 면도 지역의 중심에서 깨끗한에서 더러운로 면봉은 머리 지역 향해 바깥쪽으로 이동.
  4. 쥐가 충분히 anesthetized되었는지 확인하는 뒷다리 곤란하게 반사를 확인합니다.
  5. 동물을 드레이프와 복부를 열려면 두 단계의 피부와 근육을 분리 정중선 복부 절개를 수행합니다. 핫 비드 살균은 피부와 근육 사이에 개방하는 데 사용됩니다.
  6. 예열 생리 moisturized 분말 무료로 글러브에 장내를 놓습니다. 수분의 손실을 방지하기 위해 내장 주변의 장갑을 접으십시오.
  7. 지방 조직을 제거하고 비장을 폭로.
  8. 포셉로 큰 omentum을 시각화 및 확산.
  9. 조심스럽게 큰 omentum에 실리콘 게시물 및 전송을 중단에서 EHT 잘라.
  10. EHT 주변의 큰 omentus를 싸서 (Ethicon, Norderstedt, 독일) 2 싱글 7-0 prolene의 봉합을 사용하여 수정
  11. 다음 복부에 다시​​ 장내를 이동합니다.
  12. prewarmed 무균 식염수에 복부를 플러쉬.
  13. 6-0 prolene 실행 봉합 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용하여 복벽의 근육 레이어를 닫습니다.
  14. 피부를 닫습니다 봉합을 실행 5-0 prolene을 (Ethicon, Norderstedt, 독일)를 사용합니다.
  15. 쥐가 마취 여전히 있지만, subcutaneously 5 MG / kg Carprofen를 삽입.
  16. 절차의이 유형, 진통제 (예 : Metamizol 등) 3 일간 게시 이식을위한 진통제에 대한 식수 (100 ML 당 50 MG Metamizol)에 추가됩니다 충분한 진통제를 제공합니다.

3. EHT 다음 이식의 Bioluminescence 이미징

IVIS의 bioimaging 플랫폼 (Xenogen 알라 메다, CA, 미국) 생체내에서 비침습 bioluminescence 이미징에 사용되며 결과는 IVIS 생활 이미지 (Xenogen) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하고 있습니다. 이미징은 매일 이시간 postoperatively 시작 수행됩니다.

유도 챔버를 사용하여 - (3 % 2.5) isoflurane 함께 쥐를 마취.

  1. 널리 프로보 - 요오드, 다음 사용하는 80 % 에탄올을이 단계를 세 번 반복을 사용하여 복부 및 흉부 영역을 소독.
  2. IP, D - Luciferin (375 MG / kg 체중 Xenogen)을 주사
  3. IVIS 이미징 챔버 (최대 4 쥐가 동시에 분석할 수)에 anaesthetized 쥐를 놓습니다.
  4. 리터의 신호 강도를 평가UC + 광자 / 초 / cm 2 / steridianin 기준에의 관심 영역 (ROI) (이식 후 120분)의 단위와 일 1, 2, 3, 5, 7, 10, 그리고 주 2 EHT 내부 세포, 3 4. 정상 신호 (D - Luciferin 분사 이후 20 분 정도가 나타납니다) 참고.

시간이 지남에 따라 신호 강도를 보여주는 그래프를 (엑셀)를 만듭니다.

4. BLI 결과의 상관 관계와 ELISPOT

면역 적격 BN 및 immunodeficient 누드 쥐의 세포로 생체내 면역 - 응답 EHT 이식 후 공부했다. 받는 동물의 비장이 EHT 이식받는 splenocytes를 분리 5 일 후에 수확했다. 응답 세포가 IFN - γ와 IL - 4 코팅을 사용하여 제조 업체의 프로토콜 (BD Biosciences)에 따라 수행 것처럼 Elispot의 assays 사용 자극기 5 X10 6받는 splenocytes로 EHTs을 (시그마 알드리치, 세인트 루이스, MO, 미국) mitomycin을 저해 조사 접시 TH1을하고, TH2 반응, 각각. IFN - γ 및 IL - 4 명소 immunodeficient 모델에 비해 면역 적격, 모델 상당히 높은되었습니다 (IFN - γ : P = 0.001, IL - 4 : P = 0.023; 학생의 T - 테스트).

5. 대표 결과 :

그림 1
그림 1. BLI 결과와 ELISPOT의 상관 관계) 면역 적격 브라운 노르웨이와 immunodeficient 누드 쥐의 생체내 면역 반응의 세포는 이식 후 EHT 공부했다. 받는 사람 splenocytes은 오일 EHT 주입 후에 수확했다. IFN? 및 IL - 4 표현식은 응답 세포로 stimulators 및 5x106받는 splenocytes으로 mitomycin - 저해 EHT를 사용하여 ELISpot의 assays에 의해 평가되었다. Th1과 Th2 반응은 각각 IFNγ와 IL - 4 생산에 의해 입증으로 immunodeficient 모델에 비해 면역 적격 모델에서 상당히 높은되었습니다. B) 룩 + EHTs는 면역 적격 BN의 쥐 또는 immunodeficient 누드 쥐 하나의 큰 omentus로 이식되었다. 세포 생존은 길이 방향 BLI 다음되었다. 이식 EHTs을 거부 동물의 요금이 제공됩니다. 세포가 T 세포 결함 쥐에서 살아남은 반면 모든 BN의 쥐가 빠르게, EHT 이식을 거부했다.

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Discussion

심장 수리를 위해 EHT 기술의 임상 구현하기 전에, 이러한 이식 후 세포와 매트릭스 구성 요소 또는 이식 생존 모두 immunogenicity 같은 근본적인 질문은 실험 모델로 평가해야합니다. 인 - 생체내 bioluminescence 이미징은 이식 후 모니터링 세포 생존에 유용한 새로운 기술을 나타냅니다 . 우리는 성공적으로 들어있는 섬유소 기반 EHT를 생성 긍정 루시페라제 (루크 +) 설립 프로토콜 4 적응에 의해 심장 세포. 이러한 EHT는받는 사람 쥐의 큰 omentum에 심어했다. 특정 기판 (D - Luciferin)의 Intraperitoneal 분사는 IVIS의 bioimaging 플랫폼 (Xenogen)를 사용하여 감지되었습니다 신호를 생성합니다. 기준에서 신호 강도 (이식 후 120분가) / 초 / cm 2 / steridian는 이식할 EHTs 내부 세포의 숫자에 대한 대리 변수 역할을 광자 단위로 측정. 매일 측정 이식편 생존의 비침습 세로 assessement 허용. 거절 모델에서 시간이 지남에 따라 신호 강도의 감소는 다른 쥐 종자의 강도와 급성 거부 반응의 속도론과 상관했다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

소냐 Schrepfer, 레나드 콘라디 및 아르네 한센 독일 Forschungsgemeinschaft (; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1 DFG)로부터 자금을 받았습니다. 작품은 또한 유럽 연합 (EU)에서 토마스 Eschenhagen (EUGeneHeart 및 Angioscaff)에 보조금 지원했다.

Materials

  • LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/)
  • Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753)
  • Matrigel (BD Bioscience 356235)
  • DMEM (Biochrome F0415)
  • Horse serum (Gibco 26050)
  • Penicillin/streptomycin (Gibco 15140)
  • Insulin (Sigma-Aldrich I9278)
  • Aprotinin (Sigma Aldrich A1153)
  • d-Luciferin (Biosynth L-8220)
  • Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)

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References

  1. Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. Engineering myocardial tissue. Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).
  2. van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 87, 642-652 (2009).
  3. Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. "Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging. Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).
  4. Hansen, A., Eder, A. Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue. Circ Res. (2010).

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