Биолюминесценция изображений для оценки иммунного ответа после вживления Engineered ткани сердца (EHT)

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует использование

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., Reichenspurner, H., Robbins, R. C., Eschenhagen, T., Schrepfer, S. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. (52), e2605, doi:10.3791/2605 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Различные методы сердечных тканевой инженерии были, проводимой в последние десятилетия, в том числе леса стратегии с использованием либо родным или bioartificial эшафот материалов, захвата кардиомиоцитов в гидрогели, такие как фибрин и коллаген и укладки монослоев миоцитов 1. Эти концепции направлены на восстановление под угрозу сердечной функции (например, после инфаркта миокарда) или в качестве экспериментальных моделей (например, интеллектуального токсикологии и вещества экранирование или болезни моделирование). Точные данные мониторинга о выживаемости клеток после имплантации инженерии тканей сердца (EHT), а теперь возможно с использованием в естественных условиях биолюминесценции томография (BLI) методы 2. Здесь мы описываем процессы генерации фибрин основе EHT от трансгенных линия крыс с повсеместным выражение люциферазы светляков (ROSA / люциферазы-LEW Tg, 3). Имплантация проводится в большого сальника различных штаммов крыс для оценки иммунного ответа из организма-реципиента следующие EHT имплантации. Сравнение результатов, полученных BLI и фермента иммуноферментный Пятно Техника (ELISPOT) подтверждают удобство BLI для оценки иммунного ответа.

Protocol

1. EHT поколения и культуры Условия

Производство фибрина основе EHT осуществляли, как описано в другом месте 4. Короче говоря, для генерации фибрин основе EHT для имплантации целей, мастер микс был подготовлен содержащих клетки, выделенные из новорожденных ROSA / люциферазы-LEW трансгенных крыс сердца, бычьего фибриногена и Матригель. Агарозном литейных форм были приготовлены с использованием тефлоновой прокладки помещены в 6-и блюда культуры. После застывания агарозы, прокладки были сняты, а стойки силиконовые сообщение были размещены на культуру блюда с сообщения идущие в пресс-форм. Для создания EHT, Mastermix был на короткое время смешивается с расчетного количества тромбина и пипеткой в ​​форму. После полимеризации фибриногена, силиконовые стойки с EHTs придерживаясь должности были аккуратно удалены из литья агарозном пресс-форм, передается новым 6-а блюда культуре клеток и поддерживается в 37 ° C, 7% CO 2 в культуре клеток инкубатор использованием заказных среду клеточной культуры.

EHT хранились в условиях культуры клеток, пока день десять. В течение этого промежутка времени, неонатальной клетки сердца крысы стали удлиненные, соединения и выровнять вдоль силовых линий между силиконовой сообщений. Во время имплантации, спонтанное когерентное сокращений не наблюдалось, отклоняя силиконовые сообщений.

2. EHT Имплантация

EHT имплантация была выполнена в любом иммунокомпетентных Браун Норвегия (BN) крыс, или иммунодефицитных крыс обнаженной для расследования аллогенного иммунного ответа. Б. Н. и обнаженные крыс весом 100 - 150 г были приобретены у реки Чарльз Германии (Sandhofer Weg 7, Д-97633 Sulzfeld) и размещаются в обычных условиях, кормили стандартной крыс кормом и водой объявление libidum. Иммунодефицитом, крыс размещены в стерильных постельные принадлежности, клетки, и стерилизовать вода. Немецкий комитет по этике рассмотрены и одобрены животных процедур. Все хирургические инструменты стерилизуются перед использованием.

Процедуры имплантации проводятся следующим образом:

Крысы являются anesthesized с изофлуран (2,5-3%) с помощью индукции камеры. Воздействие на человека, чтобы изофлуран может быть уменьшена за счет работы в таблице нисходящего потока или не рециркуляции капот. Температура тела сохраняется во время хирургической операции.

  1. Бритье области живота и применять глазную мазь, чтобы предотвратить глаз от высыхания во время анестезии.
  2. Место крысу на спину и положите маску на нос и рот, чтобы не отставать анестезии.
  3. Лечить брюшной области с помощью Бетадин, а затем 80% этанола. Тампон из чистого к грязному, от центра бритой области перемещаются наружу в сторону волосами области.
  4. Проверить рефлексы щипать задние ноги, чтобы быть уверенным, что крысы достаточно анестезии.
  5. Пелерина животных и выполняют средней линии разреза брюшной полости разделения кожи и мышц в два этапа, чтобы открыть живот. Горячие стерилизации шарик используется между кожей и мышечной открытия.
  6. Место в кишечнике нагревается солевой увлажненной неопудренные перчатки. Сложите перчатка вокруг кишечника, чтобы предотвратить потерю влаги.
  7. Удаление жировой ткани и выставить селезенки.
  8. Визуализация и распространение большого сальника щипцами.
  9. Аккуратно вырежьте EHT от приостановления силиконовые сообщений и передачи на большого сальника.
  10. Оберните больше omentus вокруг EHT и исправить с помощью двух единый 7-0 проленовой швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия)
  11. Следующий шаг назад кишечника в брюшную полость.
  12. Флеш живота с нагретого стерильного физиологического раствора.
  13. Закрыть мышечного слоя брюшной стенки использованием 6-0 проленовой работает швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия).
  14. Используйте 5-0 проленовой (Ethicon, Нордерштедт, Германия), работающих швы, чтобы закрыть кожи.
  15. Хотя крысы все еще находится в анестезии, вводят 5 мг / кг Carprofen подкожно.
  16. Для обеспечения достаточного обезболивания для этого типа процедуры, обезболивающее (например, Метамизол) добавляется к питьевой воде (50 мг Метамизол на 100 мл) в течение обезболивающее в течение 3 дней после трансплантации.

3. Биолюминесценция Визуализация EHT После имплантации

Платформа ИВИС bioimaging (Xenogen, Аламеда, штат Калифорния, США) используется для неинвазивной визуализации биолюминесценции в естественных условиях, а результаты анализировались с помощью изображения ИВИС мебель (Xenogen) пакета программного обеспечения. Изображений осуществляется ежедневно, начиная с 2 часов после операции.

Обезболить крысы с изофлуран (2,5 - 3%) с помощью индукции камеры.

  1. Лечить брюшной и грудной области широко используя Прово-йод, следующего использования 80% этанола, повторите этот шаг в три раза.
  2. Inject г-люциферин (Xenogen, 375 мг / кг массы тела) ф
  3. Место анестезии крыс в ИВИС изображения камеры (до 4 крысы могут быть проанализированы в то же время).
  4. Оценка интенсивности сигнала лUC + клеток внутри EHT в единицах фотонов / сек / см 2 / steridianin области интереса (ROI) в начале исследования (120 минут после имплантации) и в дни 1, 2, 3, 5, 7, 10, и в то недели 2, 3 и 4. Заметим, пик сигнала (появляется около 20 минут после того, г-люциферин инъекции).

Создайте график (Excel), показывающий интенсивность сигнала с течением времени.

4. Корреляция результатов BLI и ELISPOT

Сотовых в естественных иммунных реакций в иммунокомпетентных БН и иммунодефицитных обнаженной крыс исследовали после EHT трансплантации. Селезенки получателя животных было собрано 5 дней после трансплантации EHT изолировать получателя спленоцитов. ELISpot анализов использованием митомицин-тормозится EHTs (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве стимулятора и 5 х 10 6 спленоцитов получатель как ответчик клетки были выполнены в соответствии с протоколом производителя (BD Biosciences) с использованием ИФН-γ и ИЛ-4 покрытием пластины для расследования TH1-и ТН2 ответ, соответственно. IFN-γ и ИЛ-4 пятна были значительно выше в иммунокомпетентных, модель по сравнению с иммунодефицитом моделью (IFN-γ: р = 0,001; IL-4: р = 0,023; Стьюдента-тест).

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Корреляция результатов BLI и ELISPOT) сотовых в естественных иммунных реакций в иммунокомпетентных Браун Норвегии и иммунодефицитных обнаженной крыс исследовали после EHT имплантации. Получатель спленоцитов было собрано 5 дней после EHT имплантации. ИФН? и ИЛ-4 выражении оценивался ELISpot анализов использованием митомицин-тормозится EHT как стимуляторы и 5x106 спленоцитов получателю в виде ячеек ответчик. Th1 и Th2 реакции были значительно выше в иммунокомпетентных модель по сравнению с иммунодефицитом модель, о чем свидетельствует IFNγ и IL-4 производства соответственно. б) Люк + EHTs были пересажены в большей omentus либо иммунокомпетентных крыс БН или иммунодефицитных обнаженной крыс. Выживаемость клеток была продольно следуют BLI. Скорость животных, которым отказано в пересаженных EHTs представлена. Все БН крысы быстро отклонили EHT пересадки, тогда как клетки выжили в Т-клеток недостаточно крыс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Перед клинической реализации EHT технологии для сердечной ремонт, фундаментальные вопросы, такие как иммуногенность и клеточном и матрица компонентов или выживаемость трансплантата после имплантации должны быть оценены в экспериментальных моделях. В естественных условиях биолюминесценции визуализации представляет полезную новую технику для мониторинга выживания клеток после трансплантации . Мы успешно генерируются фибрина основе EHT содержащие люциферазы положительным (Luc +) клетки сердца по адаптации установленным протоколом 4. Эти EHT были имплантированы в большого сальника получателя крыс. Внутрибрюшинного введения специфического субстрата (D-люциферин) генерирует сигналы, которые были обнаружены с помощью платформы ИВИС bioimaging (Xenogen). Интенсивность сигнала в начале исследования (120 минут после имплантации), измеряемый в фотон / сек / см 2 / steridian служил в качестве суррогатного параметра количество клеток внутри привитых EHTs. Ежедневные измерения позволили неинвазивным продольной assessement трансплантата выживания. В отказе модель, снижение интенсивности сигнала в течение долгого времени было связано с интенсивностью и кинетики острого отторжения в различных штаммов крысы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Соня Schrepfer, Ленард Конради и Арне Хансен получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Работа была поддержана грантами от Европейского Союза Томас Eschenhagen (EUGeneHeart и Angioscaff).

Materials

  • LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/)
  • Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753)
  • Matrigel (BD Bioscience 356235)
  • DMEM (Biochrome F0415)
  • Horse serum (Gibco 26050)
  • Penicillin/streptomycin (Gibco 15140)
  • Insulin (Sigma-Aldrich I9278)
  • Aprotinin (Sigma Aldrich A1153)
  • d-Luciferin (Biosynth L-8220)
  • Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. Engineering myocardial tissue. Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).
  2. van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 87, 642-652 (2009).
  3. Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. "Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging. Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).
  4. Hansen, A., Eder, A. Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue. Circ Res. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics