生物发光成像评估的免疫反应,植入心脏组织工程(东隧)

Bioengineering

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Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., Reichenspurner, H., Robbins, R. C., Eschenhagen, T., Schrepfer, S. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. (52), e2605, doi:10.3791/2605 (2011).

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Abstract

心脏组织工程的各种技术已经在过去几十年,包括使用本机或生物人工肝的支架材料,如纤维蛋白或胶原蛋白凝胶心肌细胞塌陷1心肌细胞单层堆放的脚手架战略追求。这些概念的目的是恢复心脏功能受损(如心肌梗死后),或作为实验模型(如预测毒理学和药物筛选或疾病建模)。精确监测细胞工程心脏组织(东隧)植入后的生存现在已经成为可能使用在体内的生物发光成像技术(BLI) 2。在这里,我们描述的纤维蛋白为基础的东隧从无处不在表达萤火虫荧光素酶(罗萨/荧光素酶LEW TG; 3)的转基因鼠应变的一代。植入的到不同的大鼠株的大网膜,以评估东隧植入受体生物体的免疫反应。 BLI和酶的酶联免疫斑点技术(ELISPOT)确认的评估免疫反应的可用性,BLI产生的结果比较。

Protocol

1。东隧代和培养条件。

制造的纤维蛋白为基础的东隧,其他地方4所描述的。总之,生成纤维蛋白为基础的东隧植入的目的,主结构是包含从新生儿的ROSA /荧光素酶LEW转基因大鼠心脏,牛纤维蛋白原和基质胶细胞编制。琼脂糖压铸模具准备使用特氟隆垫片放置在6孔培养皿。琼脂糖凝固后,垫片被拆除,硅胶柱机架上培养皿放置到模具达到的职位。要生成东隧,mastermix简要地混合与凝血酶的计算量和入模吸管。纤维蛋白原聚合后,坚持的职位EHTs硅架轻轻从琼脂糖铸造模具,转移到新的6孔细胞培养皿中,并保持在37 ° C,7%的CO 2细胞培养箱培养使用定制细胞培养液中。

东隧则留在细胞培养条件下,直到一天十个。在这段时间内,新生鼠心脏细胞开始拉长,互连和硅职位之间沿磁力线对齐。在植入时,自发连贯的收缩进行了观察,偏转硅职位。

2。东隧植入

东隧植入或者免疫功能的棕色挪威(BN)大鼠,或免疫缺陷的裸鼠大鼠进行调查的异基因免疫反应。 BN和裸大鼠,体重100 - 150克,均购自德国查尔斯河(Sandhofer WEG 7,D - 97633 Sulzfeld)和常规条件下,饲喂标准鼠议员和水广告libidum内。免疫缺陷的老鼠被安置在无菌床上用品,笼子,并使用无菌水。德国的伦理审查委员会审查和批准了动物的程序。所有手术器械消毒后才能使用。

植入过程如下:

大鼠anesthesized与异氟醚使用感应室(2.5-3%)。在下沉气流表或者非循环罩,可减少人类接触到异氟醚。在手术过程中保持体温。

  1. 剃须腹部和应用眼膏,以防止在麻醉过程中干燥的眼睛。
  2. 将大鼠在它的后面,并置于它的鼻子和嘴口罩,以保持麻醉。
  3. 使用优碘,然后80%的乙醇消毒腹部。棉签清洁脏,剃光区域中心向外移动走向头发地区。
  4. 检查反射捏后脚要确保充分麻醉大鼠。
  5. 垂坠的动物和执行中线腹部切口,分离两个步骤的皮肤和肌肉,打开腹部。用于皮肤和肌肉开放之间的热珠消毒。
  6. 放置在一个温暖的生理盐水滋润无粉手套的肠子。折叠的肠子周围的手套,以防止水分流失。
  7. 取出的脂肪组织,暴露脾。
  8. 可视化和传播更大的钳大网膜。
  9. 小心剪去东隧暂停硅职位和转移的大网膜上。
  10. 周围环绕的东隧更大omentus和修复使用两个单7-0普理灵缝线(爱惜康,日本东京,德国)
  11. 下一步行动的肠子放回腹部。
  12. 与预热的无菌生理盐水冲洗腹部。
  13. 关闭的墙壁用6-0普理灵运行缝线(爱惜康,日本东京,德国)的腹部肌肉层。
  14. 使用5-0普理灵(爱惜康,日本东京,德国),运行缝合关闭皮肤。
  15. 虽然仍然是在麻醉大鼠皮下,注射5毫克/公斤卡洛芬。
  16. 为了提供这种类型的过程足够的镇痛作用,镇痛药(如安乃近)增加了对疼痛3天移植后用药的饮用水(50毫克每100毫升安乃近)。

3。东隧以下植入的生物发光成像

IVIS生物成像平台(精诺真,阿拉米达,美国加利福尼亚州)是用于非侵入性活体生物发光成像和使用IVIS生活图片(精诺真)软件包对结果进行分析。成像是每天2个小时,术后开始执行。

麻醉与异氟醚(2.5 - 3%)的大鼠,使用感应室。

  1. 消毒腹部和胸部区域广泛使用普罗沃碘,下次使用80%乙醇,重复此步骤三次。
  2. 注射D -荧光素(精诺真; 375毫克/公斤体重)IP
  3. 麻醉大鼠放入IVIS成像室(可同时分析多达4个大鼠)。
  4. 评估信号强度的LUC +内东隧细胞在光子/秒/厘米2 / steridianin的利益地区在基准率(ROI)(120分钟植入后)的单位和天1次,2,3,5,7,10,并在周2 , 3和4。请注意峰值信号(D -荧光素注射后20分钟左右出现)。

创建一个图表(Excel)中显示的信号强度随着时间的推移。

4。劳保局结果的相关性和酶联免疫斑点法

东隧移植后的细胞在体内的免疫反应,在免疫功能正常的国民和免疫缺陷的裸鼠大鼠进行了研究。收件人动物脾脏东隧移植后5天收获隔离收件人脾。 ELISPOT检测使用丝裂霉素抑制,刺激和5 × 10 6收件人脾EHTs(Sigma公司Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州,美国)作为响应者的细胞,根据制造商的协议(BD Biosciences公司)使用IFN -γ和IL - 4涂板调查TH1,和Th2反应分别。干扰素-γ-和IL - 4点显着的免疫活性,模型相比,免疫缺陷模型(IFN -γ:P = 0.001; IL - 4:P = 0.023;学生的t -检验)。

5。代表性的成果:

图1
图1。劳保局结果和酶联免疫斑点法的相关性)在免疫布朗挪威和免疫缺陷的裸鼠大鼠体内的免疫反应的细胞进行研究后,东隧植入。收件人脾东隧植入后5天收获。干扰素?和IL - 4表达ELISPOT作为响应者细胞的刺激和5x106收件人脾使用丝裂霉素抑制东隧的检测评估。 Th1和Th2反应显着高于免疫缺陷模型,IFNγ和IL - 4的产量分别在免疫功能的模型。 B)luc +的EHTs移植到更大的omentus或免疫功能正常BN大鼠或免疫缺陷的裸鼠大鼠。纵向随后由劳保局细胞存活。动物率,拒绝了移植EHTs。所有BN大鼠迅速拒绝了东隧移植的细胞,而T细胞缺陷的老鼠存活。

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Discussion

对心肌修复东隧技术的临床实施之前,根本问题,如细 ​​胞和基质成分或移植物存活的免疫原性植入后需要在活体生物发光成像实验模型进行评估。一个有用的新技术监测细胞的存活,移植后。我们成功地生成纤维蛋白为基础的东隧,含有荧光素酶(LUC)一个既定的协议4适应的心脏细胞。这些东隧植入受体鼠的大网膜。腹腔注射的特异底物(D -荧光素),产生的信号被检测到使用IVIS生物成像平台(精诺真)。在基线的信号强度(120分钟植入后)测量光子/秒/ 厘米 2 / steridian作为嫁接EHTs内的细胞数量的替代参数。每日测量允许非侵入性移植物存活的纵向assessement。在拒绝模式,信号强度随着时间的推移下降与大鼠在不同菌株的强度和急性排斥反应动力学。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

宋佳Schrepfer,莱纳德Conradi和Arne汉森收到由德意志研究联合会(DFG; SCHR992/3-1,SCHR992/4-1,二氧化碳858/1-1,医管局3423/3-1)的资金。这项工作是由来自欧盟托马斯Eschenhagen(EUGeneHeart和Angioscaff)的赠款支持。

Materials

  • LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/)
  • Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753)
  • Matrigel (BD Bioscience 356235)
  • DMEM (Biochrome F0415)
  • Horse serum (Gibco 26050)
  • Penicillin/streptomycin (Gibco 15140)
  • Insulin (Sigma-Aldrich I9278)
  • Aprotinin (Sigma Aldrich A1153)
  • d-Luciferin (Biosynth L-8220)
  • Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)

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References

  1. Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. Engineering myocardial tissue. Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).
  2. van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 87, 642-652 (2009).
  3. Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. "Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging. Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).
  4. Hansen, A., Eder, A. Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue. Circ Res. (2010).

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