फेफड़े इंजीनियरिंग के लिए प्रक्रिया

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Published 3/08/2011
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Bioengineering
 

Summary

हम decellularized फेफड़ों के बाह्य मैट्रिक्स और उपन्यास biomimetic bioreactor है कि कार्यात्मक फेफड़े के ऊतकों में उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है. मैट्रिक्स और bioreactor में संवर्धन में कोशिकाओं बोने से, हम है कि प्रभावी गैस विनिमय दर्शाता है जब समय का संक्षिप्त अवधि के लिए vivo में प्रतिरोपित ऊतक उत्पन्न करते हैं.

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Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651, doi:10.3791/2651 (2011).

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Abstract

फेफड़े ऊतक, फेफड़ों के कैंसर और क्रोनिक प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग के रूप में पुरानी फेफड़ों के रोगों, कुछ 280.000 मौतों के लिए सालाना संचयी खाते सहित, क्रोनिक प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका 1 में मृत्यु का चौथा प्रमुख कारण है. इस मृत्यु दर में योगदान तथ्य यह है कि फेफड़ों आम तौर पर या नहीं मरम्मत सूक्ष्म, सेलुलर स्तर से परे पुनर्जन्म है. इसलिए, अध: पतन या संक्रमण, या resected है कि शल्य चिकित्सा फेफड़े के ऊतकों से क्षतिग्रस्त है फेफड़े के ऊतकों है कि कार्यात्मक vivo में जगह नहीं है . का पता लगाने के लिए कि फेफड़े के ऊतकों में इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता है है, हम एक प्रक्रिया है कि सेलुलर घटकों को हटा एक अकोशिकीय फेफड़ों के बाह्य मैट्रिक्स पाड़ उत्पादन का उपयोग वयस्क चूहों से फेफड़ों का इलाज. इस पाड़ वायुमार्ग और vasculature की पदानुक्रमित शाखाओं में बंटी संरचनाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक बड़े पैमाने पर बरकरार तहखाने झिल्ली, जो कोलेजन चतुर्थ, laminin, और fibronectin शामिल बरकरार रखती है. पाड़ एक नकारात्मक दबाव वेंटिलेशन और काँपने के गुणवाला संवहनी छिड़काव के रूप में फेफड़ों के शरीर क्रिया विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं की नकल करने के लिए डिज़ाइन bioreactor में मुहिम शुरू की है. संवर्धन फेफड़े उपकला और bioreactor घुड़सवार पाड़ के भीतर संवहनी endothelium करके, हम फेफड़े के ऊतकों कि phenotypically देशी फेफड़े के ऊतकों के लिए तुलनीय है और कहा कि कम समय अंतराल (45-120 मिनट) के लिए गैस बदले में भाग लेने के लिए सक्षम है उत्पन्न करने में सक्षम हैं. ये परिणाम उत्साहजनक हैं और सुझाव है कि फेफड़ों मैट्रिक्स के repopulation फेफड़ों के उत्थान के लिए एक व्यवहार्य रणनीति है. इस संभावना को न केवल प्रत्यारोपण के लिए फेफड़े के ऊतकों की आपूर्ति में वृद्धि की ओर काम करने के लिए है, लेकिन यह भी लंबे समय अवधि के लिए और एक और अधिक सटीक तुलना में पहले संभव हो गया है microenvironment में सांस और इन विट्रो में सेल और आण्विक जीव विज्ञान का अध्ययन करने का अवसर प्रस्तुत करता है.

Protocol

1. Bioreactor विधानसभा

Bioreactor डिजाइन और दोनों decellularization और संस्कृति के लिए विधानसभा का विस्तृत आंकड़ा (ओं) आंकड़े 1 और 2 में प्रदान की जाती हैं क्रमशः. सभी घटकों bioreactor की विधानसभा के लिए पहले निष्फल होना चाहिए. निम्नलिखित विशिष्ट बिंदुओं को नोट कर रहे हैं:

कनेक्शन:

  1. धमनी प्रवेशनी एक luer ताला टयूबिंग की एक छोटी खंड द्वारा एक वाई - फाड़नेवाला से जुड़े फिटिंग के होते हैं. संबंधक luer ताला छिड़काव टयूबिंग से जुड़ा हुआ है, और वाई के खंड है कि फुफ्फुसीय धमनी नहीं sutured है एक वाल्व एक तरह से जुड़ा हुआ है. वाल्व एक तरह से ऐसी है कि तरल पदार्थ टयूबिंग (छिड़काव के रूप में विपरीत दिशा में) में तैयार कर सकते हैं उन्मुख है, लेकिन अंग छिड़काव के दौरान सभी मध्यम फेफड़ों में बहती है.
  2. tracheal प्रवेशनी भी एक luer ताला टयूबिंग के साथ एक वाई - फाड़नेवाला से जुड़े संबंधक के होते हैं. luer ताला ट्रेकिआ जलाशय और मुख्य कक्ष के बीच एक श्वास पाश को जोड़ता है. वाई संबंधक कि ट्रेकिआ के लिए नहीं sutured है के खंड भी एक वाल्व एक तरह से जुड़ा हुआ है. एक तरह से वाल्व धमनी प्रवेशनी के रूप में एक ही फैशन में उन्मुख है.

कार्य:

  1. धमनी और tracheal cannulae में एक तरह से वाल्व टयूबिंग में टयूबिंग में प्रवाह के उलट सक्षम और इसलिए हवाई बुलबुले को हटाया जा अनुमति से हवाई बुलबुले स्पष्ट का उपयोग कर रहे हैं.
  2. "श्वास पाश" दो एक तरह से वाल्व, तैनात ऐसी है कि मध्यम में और फेफड़ों से बाहर एक अलग पथ का अनुसरण शामिल हैं. हमारी प्रयोगशाला 2 से एक पूर्व प्रकाशन में इस सुविधा का एक अधिक विस्तृत विवरण प्रदान की जाती है.
  3. संवहनी छिड़काव एक रोलर पंप का उपयोग करने के लिए प्रदान की जाती है. मध्यम फुफ्फुसीय धमनी में संलग्न प्रवेशनी के माध्यम से perfused है, फेफड़ों के vasculature के माध्यम से, और मुख्य bioreactor, जहां मध्यम छिड़काव के लिए तैयार है में फेफड़े के सीधे नस बाहर बहती है.

2. अंग हार्वेस्ट

  1. वयस्क (3-6 महीने पुराने) फिशर सोडियम pentobarbital अधिक मात्रा द्वारा 344 चूहों पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन (60 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार, euthanize. नोट: pentobarbital समाधान शामिल एंटिकोगुलेशन के लिए 100 इकाइयों / मिलीलीटर में हेपरिन है.
  2. स्प्रे या और इथेनॉल 70% के साथ सीने और पेट पोछ लो.
  3. वक्ष गुहा खोलें, हृदय और फेफड़ों को उजागर, ध्यान लेने के फेफड़ों को नुकसान नहीं है. ध्यान डायाफ्राम के माध्यम से एक छोटी सी खिड़की वक्ष गुहा में, फेफड़ों को वापस लेना करने के लिए कारण है, और तब इस चीरा क्षैतिज विस्तार करने के लिए फेफड़ों के अड्डों को बेनकाब. पसलियों के माध्यम से खड़ी दो चीरों बनाओ, और सीने पिंजरे वापस लेना करने के लिए दिल और फेफड़े का पर्दाफाश.
  4. एक गुरुत्व छिड़काव प्रणाली तैयार, यानी गोताख़ोर के साथ एक सिरिंज हटाया, एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी, और ~ टयूबिंग की एक 1.5inch, 21 गेज सुई के साथ 20cm का उपयोग. ~ 20cm एक अंगूठी जानवर का उपयोग कर खड़े ऊपर सिरिंज बनाए रखें. सुनिश्चित करें कि सभी हवा छिड़काव टयूबिंग से हटा दिया है.
  5. सही atrium के लिए रक्त नाली कट, यह फेफड़ों के लिए लौटने से रोकने. बाएं आलिंद काटना फेफड़ों से रक्त और perfusate की आसान जल निकासी की अनुमति के लिए भी मददगार हो सकता है, लेकिन आवश्यक नहीं है.
  6. सही वेंट्रिकल के आधार में सुई डालें और पानी निकलने की टोंटी को खोलने के लिए पीबीएस में हेपरिन और सोडियम nitroprusside (50U/ml और 1ug/ml, क्रमशः) के एक समाधान के साथ फेफड़ों perfuse. पुष्टि करें कि फुफ्फुसीय धमनी छिड़काव तरल पदार्थ के साथ भरता है, और है कि रक्त फेफड़ों से साफ़ हो रहा है. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त तरल पदार्थ के साथ छिड़काव सिरिंज फिर से भरना. आमतौर पर केवल ~ 10ml की आवश्यकता है.
  7. छिड़काव जारी रखें जब तक फेफड़ों में खून की स्पष्ट कर रहे हैं, तो रोक छिड़काव.
  8. ट्रेकिआ काटना मुक्त, के रूप में दूर संभव के रूप में गर्दन में. सुनिश्चित करें ट्रेकिआ घुटकी से अलग है. दिल, फेफड़े और ट्रेकिआ के लिए सभी शेष कनेक्शन काटना, और सामूहिक हटायें.
  9. एक स्केलपेल या तेज कैंची का प्रयोग, बंद दिल के शीर्ष में कटौती, सही है और छोड़ दिया निलय उजागर.
  10. सही वेंट्रिकल, जगह में और सिवनी के माध्यम से फेफड़े ट्रंक Cannulate. किसी भी अतिरिक्त बाएं निलय ऊतक निकालें.
  11. और जगह में ट्रेकिआ सीवन Cannulate. सुनिश्चित करें कि दोनों tracheal और फुफ्फुसीय धमनी cannulae ऐसी है कि ट्रेकिआ, फेफड़े, या महान वाहिकाओं (चित्रा 1) पर कोई टोर्शनल तनाव है तैनात हैं.
  12. सुनिश्चित करें कि वहाँ धमनी प्रवेशनी में कोई हवाई बुलबुले हैं, के बाद से सिस्टम में फंस हवा बुलबुले अंग के माध्यम से के निरंतर प्रवाह को रोकने सकता है. कुछ मामलों में, एक हवाई बुलबुले पूरी तरह पड़ाव द्रव flow.To यह पूरा कर सकते हैं, पीबीएस युक्त जार में गुट / दिल फेफड़ों जगह है. सुई के साथ एक सिरिंज का प्रयोग करने के लिए दिल प्रवेशनी में पीबीएस की एक छोटी राशि इंजेक्षन करने के लिए किसी भी बुलबुले को निष्कासित.
  13. पीबीएस 4-5 बार के साथ वायुमार्ग Lavage, संभव के रूप में के रूप में ज्यादा हवा फेफड़ों से निकालने.
  14. Lavage कदम के बादएस पूरा कर रहे हैं, पीबीएस 1ug/ml युक्त सोडियम nitroprusside (SNP) के साथ फेफड़ों फुलाना. Tracheal प्रवेशनी पर एक डाट रखो, तो समाधान फेफड़ों में रहता है. फेफड़ों 30 मिनट के लिए सेते, के रूप में एक ही समाधान फुफ्फुसीय धमनी के माध्यम से vasculature के माध्यम से बहती है, vasodilation की अनुमति दें.
  15. एक bioreactor टोपी luer ताला वाई के आकार cannulae, ऊपर "bioreactor विधानसभा" में वर्णित जुड़े कनेक्शन का उपयोग करने के लिए दिल / फेफड़ों कनेक्ट. (चित्रा 1).

3. अंग Decellularization

  1. Decellularization तंत्र टोपी (फेफड़ों संलग्न के साथ) (चित्रा 1) कनेक्ट. फुफ्फुसीय धमनी प्रवेशनी छिड़काव लाइन से कनेक्ट करना चाहिए, और tracheal प्रवेशनी मुक्त फ्लोट चाहिए. सभी लाइनों हवा का स्पष्ट कर रहे हैं सुनिश्चित करें. जैसा कि ऊपर वर्णित है, लाइनों में हवा गरीब decellularization के एक स्रोत decllularization तरल पदार्थ का प्रवाह रोकने के द्वारा किया जा सकता है. सिस्टम में फंस एयर संस्कृति के समय में भी जारी रहती है तो कर सकते हैं, जब यह सेल 3 अस्तित्व पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है.
  2. पीबीएस / SNP साथ फेफड़ों फुलाना है जब तक फेफड़ों पूरा कर रहे हैं, पर फुलाया नहीं बल्कि. तुरंत tracheal प्रवेशनी टोपी इतना है कि फेफड़ों फुलाया रहता है.
  3. Perfuse पीबीएस / SNP साथ ~ mmHg 15 (20cm एच 2 हे दबाव) पर कम से कम 15 मिनट के लिए फेफड़ों. 15min या उससे अधिक समय के बाद, tracheal प्रवेशनी से डाट हटाने के लिए फेफड़ों खंडन करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. 30min के लिए पीबीएस / SNP साथ छिड़काव जारी रखें. यदि आवश्यक हो, यह सुनिश्चित करने के लिए फिर से भरना पीबीएस / SNP छिड़काव दबाव 10-15 mmHg पर बनाए रखा है.
  5. छिड़काव decellularization समाधान (8mm chaps, 1M NaCl, 1X पीबीएस में 25mm EDTA) के साथ शुरू करो. ध्यान रखना सुनिश्चित करने के सभी लाइनों हवा का स्पष्ट कर रहे हैं. एक निर्वात प्रणाली चूषण प्रदान करने के लिए सहायक हो सकता है.

Decellularization समाधान के साथ Perfuse तक समाधान का 500ml फेफड़ों के माध्यम से perfused है. इष्टतम दबाव <15 mmHg (~ 20 सेमी एच 2 हे). यह आम तौर पर 2.5 घंटे की आवश्यकता होगी. प्रवाह की दर आम तौर पर कर रहे हैं बहुत धीमी गति से (0.2-0.5ml/minute) शुरू में, और दूसरे घंटे के दौरान लगभग 1ml/minute या अधिक से अधिक तेजी से वृद्धि. समय समय पर, bioreactor से इस्तेमाल किया decellularization तरल पदार्थ को हटाने के लिए, पर्याप्त तरल पदार्थ सुनिश्चित करने के फेफड़ों और tracheal प्रवेशनी का समर्थन रहता है.

4. Rinsing के अंग और बंध्याकरण

  1. एक टिशू कल्चर हुड के लिए फेफड़ों और bioreactor स्थानांतरण. 500ml जार है कि decellularization तरल पदार्थ होता है को हटाने और एक बाँझ 1L बाँझ पीबीएस युक्त जार के साथ जगह बाँझ पीबीएस के साथ rinsing शुरू करो. वैक्यूम चूषण का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें लाइनों हवा का स्पष्ट कर रहे हैं.
  2. 10-15 mmHg में vasculature के माध्यम से Perfuse decellularization के लिए के रूप में एक ही तरीके से, Pbs. समय समय पर, bioreactor से बर्बाद पीबीएस को हटाने और और / या फिर से भरना ताजा, बाँझ पीबीएस साथ पीबीएस जार की जगह. यह सलाह दी जाती है बाँझ तकनीक का उपयोग.
  3. Rinsing जारी रखें जब तक बाँझ पीबीएस के कम से कम 2.5 एल फेफड़ों perfused है.
  4. एक नया, बाँझ bioreactor ताजा पीबीएस युक्त प्रणाली के लिए फेफड़ों के स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि दोनों पूरे छिड़काव पाश और पूरे airway लाइनों तरल पदार्थ के साथ भर रहे हैं. सभी बाद के चरणों का एक काँपने के गुणवाला पंप का उपयोग 5ml/min पर फेफड़ों perfuse जाएगा.
  5. पाड़ जीवाणुरहित, या तो पीबीएस में 0.1% peracetic एसिड के साथ पीबीएस + 10% FBS 10 +% कलम strep समाधान के साथ या 3 घंटे के लिए रात में छिड़काव के माध्यम से. बाद कई घंटे से अधिक 3 250ml पीबीएस के परिवर्तन के साथ फेफड़ों rinsing के अवशिष्ट एसिड हटाने की आवश्यकता होगी. प्रत्येक कुल्ला के लिए, फेफड़ों के रूप में अच्छी तरह के रूप में करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक के सभी भागों को अच्छी तरह से rinsed हैं perfused हवादार होना चाहिए.
  6. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और perfuse पीबीएस के साथ कि 10% FBS और 10% पेनिसिलिन / 1hr ~ स्ट्रेप्टोमाइसिन या जब तक तापमान equilibrated benzonase उपचार के लिए तैयारी में है, फेफड़ों के स्थानांतरण.
  7. Benzonase साथ फेफड़ों का इलाज करने के लिए शेष डीएनए निकाल:
    1. 37 सी. सेंटीग्रेड benzonase बफर (अभिकर्मकों तालिका देखें) गर्म
    2. प्रत्येक फेफड़ों के लिए, benzonase केवल बफर बफर में 90U/ml benzonase के साथ और एक 10ml सिरिंज के साथ एक 10ml सिरिंज को भरने.
    3. फेफड़ों के छिड़काव बंद करो.
    4. Benzonase बफर के साथ airway बढ़.
    5. फेफड़ों खंडन करने की अनुमति दें (~ 1 मिनट के लिए). फिर, benzonase समाधान के साथ फेफड़ों फुलाना. Benzonase बफर और benzonase के साथ मुद्रास्फीति के दौरान, फेफड़ों में किसी भी हवा इंजेक्शन से बचने की कोशिश करो.
    6. फेफड़ों के छिड़काव या वेंटिलेशन के बिना 37 ° C पर बैठने के लिए benzonase साथ inflating के बाद 1 घंटे के लिए अनुमति दें.
  8. पीबीएस + 10% FBS, 10% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन है कि bioreactor में पहले से ही है, और रात भर जारी रखने के साथ छिड़काव पुनरारंभ. अगले दिन, फेफड़ों या तो 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस (अप करने के लिए 3 महीने के लिए) या सेल बोने के लिए तैयार है.
  9. सेलुलर repopulation के लिए पाड़ तैयार करने के लिए, पीबीएस / FBS / ~ 250ml मध्यम संस्कृति के साथ benzonase समाधान की जगह. कम से कम एक घंटे के लिए Perfuse पहले कोशिकाओं को पेश कर रहे हैं,एन डी सीधे बोने कोशिकाओं से पहले ताजा मध्यम संस्कृति के साथ की जगह.

5. Recellularization

अंग reseeding के लिए सेल के स्रोत की पसंद अलग - अलग जांचकर्ताओं को छोड़ दिया है. कई सेल सूत्रों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आबादी, हौसले से अलग नवजात या भ्रूण के फेफड़े कोशिकाओं, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल स्रोतों सहित उपयोग कर सकते हैं. इन सेल आबादी के लिए विशिष्ट अलगाव प्रोटोकॉल 4,5,6 कहीं और पाया जा सकता है . यहाँ, हम बीज के लिए कैसे दोनों endothelial और उपकला कोशिका आबादी पर निर्देश प्रदान करते हैं.

Endothelial बोने:

  1. वांछित endothelial सेल की आबादी का एक निलंबन उचित संस्कृति के माध्यम में, तैयार करें. 40um सेल सेल clumps को हटाने झरनी के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन. हमारी प्रयोगशाला में एक ठेठ endothelial बोने मध्यम संस्कृति के 60ml में लगभग 30 लाख चूहे फेफड़ों microvascular endothelial कोशिकाओं का उपयोग होगा.
  2. एक छोटे से अस्थायी रूप से bioreactor के छिड़काव पाश (चित्रा 2) में शामिल जलाशय में सेल निलंबन बग़ैर. सुनिश्चित करें कि इस जलाशय और पूरे छिड़काव पाश से टयूबिंग हवा के बुलबुले के स्पष्ट है.
  3. एक रोलर पंप का उपयोग 3ml/min पर फुफ्फुसीय धमनी में कोशिकाओं दिखे.
  4. सेल जलसेक के बाद, इच्छित दर पर मुख्य bioreactor से recirculated मध्यम के साथ छिड़काव जारी है.
  5. एक दैनिक आधार पर यह सुनिश्चित करेगा कि छिड़काव टयूबिंग हवा के बुलबुले के स्पष्ट है.
  6. मध्यम ताजा माध्यम के साथ नियमित रूप से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए है, इस बार हर 3-4 दिनों में किया जाता है.

उपकला बोने:

  1. वांछित उपकला कोशिका की आबादी का एक सेल निलंबन तैयार. हमारी प्रयोगशाला में, यह आमतौर पर लगभग 5-10 लाख नवजात चूहे कोशिकाओं फेफड़े के होते हैं. फ़िल्टर 40um सेल झरनी के माध्यम से जनसंख्या और संस्कृति के माध्यम से 15ml में एक सिरिंज में निलंबित. संस्कृति के माध्यम से 80ml के साथ airway जलाशय भरें.
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में bioreactor प्लेस, और वेंटीलेशन के लिए सिरिंज पंप कनेक्ट. सभी लाइनों वेंटिलेशन हवा का स्पष्ट कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
    1. बीज tracheal प्रवेशनी में एक ही सांस के रूप में सेल निलंबन के 15ml इंजेक्शन लगाने के द्वारा फेफड़ों में कोशिकाओं.
    2. तुरंत एक एकल, धीमी गति से सांस सिरिंज पंप का उपयोग शुरू. यह सांस 3ml/minute पर मुख्य bioreactor से हवा के 60ml वापस लेने के द्वारा प्रशासित किया जाता है, इस प्रकार लगभग 20 मिनट तक. सुनिश्चित करें मुख्य bioreactor पर हवा फिल्टर सेल निलंबन इंजेक्शन लगाने के तुरंत बाद और धीमी गति से सांस शुरुआत से पहले बंद छाया हुआ है.
  3. फेफड़ों statically के लिए 18hrs लगभग बैठने के लिए, और फिर धीमी नाड़ी छिड़काव शुरू (लगभग 0.5 मिलीग्राम / मिनट) की अनुमति दें.

6. अंग संस्कृति

हालांकि छिड़काव और वेंटिलेशन का ब्यौरा प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे, निम्नलिखित बातों को नोट कर रहे हैं:

  1. Endothelial संस्कृति के दौरान, छिड़काव आमतौर पर 1-3 मिलीग्राम / मिनट एक रोलर पंप का उपयोग किया जाता है. उपकला संस्कृति के दौरान, वेंटिलेशन आम तौर पर एक सिरिंज पंप का उपयोग कर प्रति मिनट 1 सांस की एक निरंतर दर पर प्रदान की जाती है. मुख्य bioreactor से हवा के 5 10ml की निकासी आम तौर पर एक सामान्य ज्वार मात्रा में फेफड़ों वेंटिलेशन प्रभाव के लिए आवश्यक है. वेंटिलेशन के दौरान bioreactor airtight बनाए रखने की जरूरत के कारण, वेंटिलेशन दैनिक रोक दिया चाहिए और मुख्य कक्ष में हवा का आदान - प्रदान होना चाहिए. सभी प्रणाली में हवा कमरे में हवा है, जो लगभग 21% आंशिक दबाव से ऑक्सीजन है. 5-10ml वापसी bioreactor (जो फेफड़ों द्वारा 5 10ml तरल पदार्थ की प्रेरणा लाती) से हवा के फेफड़ों के आकार पर आधारित है और कितने lobes संवर्धित किया जा रहा है (lobes विश्लेषण के लिए बंद हो बांध कर सकते हैं, जबकि शेष lobes संस्कृति में जारी). सिरिंज पंप से वापस ले लिया हवा की मात्रा लगभग सुसंस्कृत फेफड़ों के ज्वार मात्रा "के लिए चुना है.
  2. मध्यम लगभग बदला जा हर 3-4 दिनों चाहिए और संस्कृति के दौरान.
  3. दोनों उपकला और endothelium, हमारी प्रयोगशाला आमतौर पर पहली बीज 4-8 दिन, जो समय के दौरान इंजीनियर ऊतक हवादार है के लिए उपकला में प्रयोगों के सह संस्कृति के दौरान. endothelium तो छिड़काव के माध्यम से वरीयता दी गई है, जिसके बाद ऊतक दोनों perfused और हवादार है.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

Decellularization

जब प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है, हौसले से निकाला फेफड़ों लीक बिना हवा धारण करना चाहिए. उन्हें हवा के साथ बढ़ाना जबकि तरल पदार्थ में डूबे हुए इस जांच कर सकते हैं - वहाँ किसी भी बुलबुले हवा लीक संकेत नहीं होना चाहिए. 3 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस, और PBS अंततः के बारे में / एमएल मिनट 10 फेफड़ों के माध्यम से प्रवाह करने में सक्षम होना चाहिए (बाद decellularization ~ decellularization द्रव का प्रवाह करने के लिए 500ml 2.5 के पाठ्यक्रम से अधिक फेफड़ों के माध्यम से अनुमति चाहिए~ के तहत 15 मिमी हीड्रास्टाटिक दबाव के अंत में) पारा rinsing. 0.1% peracetic एसिड और benzonase के साथ इलाज के बाद फेफड़ों के लिए 3 महीने के लिए लिए 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है, और अभी भी recellularization के लिए उपयुक्त रहते हैं.

अंतिम decellularized बाह्य मैट्रिक्स पूरी तरह सेलुलर सामग्री से रहित होना चाहिए, और देशी फेफड़ों की सकल, सूक्ष्म और ultrastructural विशेषताओं को बनाए रखने. अपर्याप्त decellularization या rinsing शेष डीएनए पाड़, जो एक मानक hematoxylin और eosin के साथ कल्पना दाग तुलना के लिए (चित्रा 3 देखें) "चिपका" में परिणाम सकता है.

अकोशिकीय मैट्रिक्स और फेफड़े के ऊतकों की संस्कृति के Repopulation

यदि कोशिकाओं को हौसले से 7 दिन पुराने नवजात चूहे पिल्ले के रूप में ऑनलाइन पूरक में वर्णित पीटरसन और चार सहयोगियों द्वारा साथ काम से अलग कर रहे हैं, एक 120-150 प्रति 10 पिल्ले के कूड़े लाखों कोशिकाओं के एक सेल उपज की उम्मीद कर सकते हैं ( बस पर 10 लाख नवजात शिशु प्रति कोशिकाओं).

सेल बोने और bioreactor में फेफड़ों के बाद संस्कृति के लिए इष्टतम स्थितियों फेफड़ों के सभी 5 lobes के भीतर अच्छी तरह से वितरित कोशिकाओं उपज चाहिए और बाह्य मैट्रिक्स पाड़ (चित्रा 3) के लगभग 70% कवरेज प्रदान करनी चाहिए. सभ्य सेल जनसंख्या प्रमुख समर्थक स्रावी (एसपीसी) प्रोटीन सी, क्लारा सेल स्रावी प्रोटीन (CCSP), और aquaporin 5 (AQP), रिश्तेदार बहुतायत के क्रम में (चित्रा 4) के रूप में श्वसन सेल मार्कर के लिए सकारात्मक हो जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 Cannulae पदों और decellularization bioreactor

चित्रा 2
चित्रा 2. Bioreactor और इंजीनियर फेफड़े के ऊतकों के बोने और संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया

चित्रा 3
चित्रा 3 देशी decellularized, प्रोटोकॉल, और repopulated फेफड़ों.

चित्रा 4
चित्रा 4 कुंजी फेफड़ों के लिए मार्करों immunofluorescence धुंधला .

Discussion

प्रणाली का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं यहाँ बाँझपन के रखरखाव और तैयारी और पाड़ और संवर्धन repopulated फेफड़ों बोने की प्रक्रिया के दौरान संवहनी बिस्तर पर लागू दबाव के करीबी निगरानी शामिल करने के लिए प्रस्तुत. बाँझपन सबसे अच्छा सभी सामग्री पहले autoclaving उपयोग करने के लिए, और explant के बाद शीघ्र ही एक बंद व्यवस्था में फेफड़ों के बढ़ते और इस बाधा के बाद उल्लंघन से बचने के द्वारा बनाए रखा है. Decellularized मैट्रिक्स के बाद अच्छी तरह से rinsed है और संस्कृति के लिए एक बाँझ bioreactor स्थानांतरित, सिलिकॉन, टोपी और अन्य जवानों और कनेक्शन हो या परेशान नहीं हटाया जाना चाहिए. जांच में दबाव रखने के लिए, गुरुत्वाकर्षण द्वारा संचालित प्रवाह बेहतर है जब भी संभव हो. जब एक पंप तरल पदार्थ की पुनःपरिसंचरण के लिए आवश्यक है, संस्कृति के दौरान पीबीएस और जारी रखने के साथ rinsing के बाद शुरुआत में, हम सीधे बस से पहले दबाव तरल पदार्थ एक दबाव transducer के साथ फुफ्फुसीय धमनी में प्रवेश करती है को मापने की सलाह देते हैं. लागू दबाव की भयावहता 15 मिमी Hg अधिक नहीं होनी चाहिए.

Recellularized फेफड़ों अलग समय अवधि, आमतौर पर 4 दिनों से 3 सप्ताह तक लेकर के लिए सभ्य हो सकता है है. संवहनी छिड़काव आम तौर पर 1-3 / endothelial संस्कृति दौरान मिलीलीटर मिनट में पूरा किया है, जबकि वेंटिलेशन उपकला संस्कृति के दौरान आम तौर पर सांस 1 / मिनट की दर से लागू है. संयुक्त संस्कृति अवधि के दौरान, एक साथ वेंटिलेशन और छिड़काव के लिए उपयुक्त है. वेंटिलेशन या तो तरल माध्यम या हवा के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है.

पिछले कई दशकों के दौरान, कई समूहों महत्वपूर्ण ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो में फेफड़ों के उपकला फर्क और फेफड़ों microanatomy 7,8,9, 10 के कई पहलुओं की नकल की व्यवहार्यता दिखा काम किया है. हालांकि, हाल ही में जब तक, इन फेफड़े के ऊतकों इंजीनियर के प्रयास के 4,5 कोई नहीं है कि रक्त और airway डिब्बों के बीच अलगाव को बनाए रखने के लिए और है कि गैस विनिमय में भाग लेने के सकता करने में सक्षम था एक implantable अंग में हुई थी. इसलिए, हालांकि वर्णित विधियों केवल कार्यात्मक फेफड़े के ऊतकों पैदा करने की दीर्घकालिक लक्ष्य की ओर एक शुरुआती कदम है, इस काम फेफड़ों ऊतक प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध की राशि बढ़ाने की संभावना की ओर एक उत्साहजनक कदम है. इसके अलावा, इस काम Ott एट अल. UYGUN और 11,12 सहयोगियों द्वारा किए गए कार्य बताते हैं, ऊतक इंजीनियरिंग जटिल तीन आयामी संरचना के लिए एक पाड़ के रूप में एक decellularized बाह्य मैट्रिक्स की प्रभावकारिता का प्रदर्शन और विकास और कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के अस्तित्व का समर्थन . यह काम भी श्वसन सेल और आण्विक जीव के armamentarium के लिए अपने योगदान के लिए महत्वपूर्ण है. एक अनूठा, तीन आयामी वातावरण भी है कि उपयुक्त यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान कर सकते हैं और है कि तेजी से डी - भेदभाव के परिचर खतरा नहीं बांटता है कि एक मुठभेड़ हो सकता है जब और अधिक परंपरागत तरीकों 13 के साथ प्रयोगशाला में संवर्धन कृंतक उपकला, वैज्ञानिकों का इस्तेमाल कर सकते हैं प्रदान करके हमारी प्रणाली सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत है कि सेल भेदभाव और समारोह में एक भूमिका निभा में नए अंतर्दृष्टि लाभ. इस ज्ञान विशेष रूप से शक्तिशाली हो अगर लाभ उठाने के रूप में इस्तेमाल करने के लिए विभिन्न स्टेम सेल आबादियों के भाग्य गाइड, Cortiella समूह के रूप में प्रारंभिक 14 अध्ययन में प्रदर्शन किया है हो सकता है.

Disclosures

LEN Humacyte, एक पुनर्योजी दवा कंपनी में शेयर धारण. Humacyte इन अध्ययनों निधि नहीं था, और था, वर्णित प्रयोगों या विधियों के किसी भी के डिजाइन, व्याख्या या रिपोर्टिंग प्रभावित नहीं है. लेखकों (LEN, THP, ईएसी) और येल विश्वविद्यालय फेफड़ों के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए संबंधित एक पेटेंट आवेदन दायर की है.

Acknowledgements

हम Maegan बी Colehour bioreactor विकास के साथ मदद के लिए धन्यवाद. इन अध्ययनों से संज्ञाहरण के येल विश्वविद्यालय विभाग द्वारा और NIH अनुदान HL ०९८२२० (LEN के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया. THP एनआईएच T32 GM007171 के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthanasia
Heparin Sigma-Aldrich H4784
Sodium nitroprusside Fluka 71778
Euthasol euthanasia solution Virbac Animal Health 710101 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration
Decell Solution
CHAPS Sigma-Aldrich C3023
NaCl American Bioanalytical AB01915
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaOH JT Baker 3722-01
1X PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Bioreactor Components
480 ml jar Cole-Parmer EW-3460560
Silicone stopper, size 14 Cole-Parmer EW-06298-26
Y-connectors Cole-Parmer ED-30614-08 Used for arterial and tracheal cannulae
Silicone tubing Masterflex (Cole Palmer) 96420-14; 16 L/S 14; 16
Pressure Transducers Edwards Lifesciences PX-212
Check valve Cole-Parmer EW-98553-20 One-way valve
4-way stopcocks Edwards Lifesciences 594WSC
Syringe filter Cole-Parmer 2915-08 PTFE, 0.2μm
Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor)
500 and 1000 ml glass bottles Corning 1395-500; -1L Used for decell and rinsing by gravity
Benzonase Treatment
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140122
FBS Hyclone SH30071.03
Tris-HCl American Bioanalytical AB14043 1M, pH 8.0
MgCl2 JT Baker 2444-01
BSA Sigma-Aldrich A9647
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix

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References

  1. American Lung Association. Lung Disease Data. (2008).
  2. Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. (2010).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
  4. Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
  5. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
  6. Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
  7. Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
  8. Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
  9. Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
  10. Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. (2010).
  11. Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  12. Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  13. Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
  14. Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. (2010).

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