Procedure voor Lung Techniek

* These authors contributed equally
Published 3/08/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

We hebben een gedecellulariseerde long extracellulaire matrix en nieuwe biomimetische bioreactor die kunnen worden gebruikt om functionele longweefsel te genereren. Door zaaien cellen in de matrix en het kweken in de bioreactor, genereren wij weefsel dat effectieve gasuitwisseling laat zien wanneer transplanted in vivo voor een korte periode van tijd.

Cite this Article

Copy Citation

Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for Lung Engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651, doi:10.3791/2651 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Longweefsel, met inbegrip van longkanker en chronische longaandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte, cumulatief goed zijn voor ongeveer 280.000 sterfgevallen per jaar; chronische obstructieve longziekte is momenteel de vierde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten 1. Bijdragen aan deze sterfte is het feit dat de longen het algemeen niet repareren of regenereren buiten de microscopische, cellulair niveau. Daarom wordt longweefsel dat is beschadigd door degeneratie of infectie, of longweefsel dat operatief wordt gereseceerd niet functioneel vervangen in vivo. Om te onderzoeken of het longweefsel kunnen worden gegenereerd in vitro, hebben we behandeld longen van volwassen ratten met behulp van een procedure die cellulaire componenten verwijdert het produceren van een acellulair long extracellulaire matrix schavot. Deze steiger behoudt de hiërarchische structuren van de vertakkende luchtwegen en bloedvaten, evenals een grotendeels intact basale membraan, die collageen IV, laminine en fibronectine omvat. De steiger is gemonteerd in een bioreactor ontworpen om kritieke aspecten van de long-fysiologie, zoals negatieve druk ventilatie en pulserende vasculaire perfusie na te bootsen. Door het kweken van longepitheel en vasculaire endotheel in de bioreactor gemonteerde steiger, we zijn in staat om longweefsel dat is fenotypisch vergelijkbaar met inheemse longweefsel en dat in staat is om deel te nemen in ruil voor gas korte tijdsintervallen (45 tot 120 minuten) te genereren. Deze resultaten zijn bemoedigend, en suggereren dat herbevolking van long-matrix is ​​een levensvatbare strategie voor long regeneratie. Deze mogelijkheid biedt een kans om niet alleen te werken in de richting van het aanbod van longweefsel voor transplantatie, maar ook voor de ademhalingswegen cel-en moleculaire biologie in vitro onderzoek naar langere perioden en in een meer nauwkeurige micro-omgeving dan tot voorheen mogelijk was.

Protocol

1. Bioreactor Montage

Gedetailleerde cijfer (s) van de bioreactor ontwerp en de assemblage voor zowel decellularisatie en cultuur worden gegeven in de figuren 1 en 2, respectievelijk. Alle componenten dient vooraf te worden gesteriliseerd assemblage van de bioreactor. De volgende specifieke punten worden genoteerd:

AANSLUITINGEN:

  1. De arteriële canule bestaat uit een luer-lock montage is aangesloten op een Y-splitter door een korte segment van de buis. De luer-lock connector is bevestigd aan de perfusieslang, en het segment van de Y, die niet wordt gehecht aan de longslagader aangesloten is op een een-weg klep. De een-weg klep is zodanig georiënteerd dat vloeistof kan worden opgesteld in de slang (in de tegenovergestelde richting als perfusie), maar tijdens orgaanperfusie alle medium stroomt in de longen.
  2. De tracheale canule bestaat eveneens uit een luer-lock connector gekoppeld aan een Y-splitter met buizen. De luer-lock verbinding maakt met een ademhaling lus tussen de luchtpijp reservoir en de belangrijkste kamer. Het segment van de Y-connector die niet wordt gehecht aan de luchtpijp is ook verbonden met een een-weg klep. De one-way klep is gericht op dezelfde manier als de arteriële canule.

FUNCTIES:

  1. De one-way kleppen in de arteriële en tracheale canules worden gebruikt om luchtbellen duidelijk in de slang doordat omkering van stroming in de slang en dus toelaat luchtbellen worden verwijderd.
  2. De "ademende loop" omvat twee een-weg kleppen, geplaatst zodanig dat medium volgt een ander pad in en uit de longen. Een meer gedetailleerde beschrijving van deze functie is voorzien in een voorafgaande bekendmaking van ons laboratorium 2.
  3. Vasculaire perfusie wordt verstrekt met behulp van een roller pomp. Medium is doorbloed in de longslagader via de bijgevoegde canule, stroomt door de longen vaatstelsel en de longen ader direct in de grote bioreactor, waar medium is opgesteld voor perfusie.

2. Organ Harvest

  1. Euthanaseren volwassenen (3-6 maanden oud) Fischer 344 ratten door natriumpentobarbital overdosis, volgens de richtlijnen opgesteld door de American Veterinary Medical Association (60 mg / kg IP) in te stellen. Let op: de pentobarbital oplossing bevat heparine bij 100 eenheden / ml voor antistolling.
  2. Spray of veeg de borst en buik met 70% ethanol.
  3. Open de borstholte, waardoor de hart en longen, en zorg ervoor dat geen schade aan de longen. Maak voorzichtig een klein venster door het diafragma in de borstholte, waardoor de longen terug te trekken, en daarna horizontaal uit te breiden deze incisie aan de bases van de longen bloot te leggen. Maak twee incisies verticaal door de ribben, en duw de borst kooi om het hart en de longen bloot te leggen.
  4. Bereid een zwaartekracht perfusie-systeem, dat wil zeggen met behulp van een spuit met zuiger verwijderd, een 3-weg kraan, en ~ 20cm van de buis met een 1.5inch, 21-gauge naald. Handhaving van de spuit op ~ 20 cm boven het dier met behulp van een ring staan. Zorg ervoor dat alle lucht is verwijderd van de perfusie slang.
  5. Snijd de rechterboezem om bloed afvoer, waardoor deze terug te keren naar de longen. Het snijden van de linker atrium om gemakkelijke drainage van bloed en perfusievloeistof toestaan ​​van de longen kan ook nuttig zijn, maar is niet noodzakelijk.
  6. Steek de naald in de basis van de rechter ventrikel en open de kraan naar de longen perfuseren met een oplossing van heparine en natrium nitroprusside (50U/ml en 1ug/ml, respectievelijk) in PBS. Controleer of de longslagader vult met perfusie vloeistof, en dat bloed is opruimen van de longen. Indien nodig, bijvullen van de perfusie spuit met extra vocht. Meestal slechts ~ 10 ml nodig is.
  7. Ga door perfusie totdat de longen vrij zijn van bloed, dan stoppen perfusie.
  8. Ontleden de luchtpijp vrij, tot in de nek zo ver mogelijk. Zorg ervoor dat de luchtpijp is gescheiden van de slokdarm. Ontleden alle resterende verbindingen naar het hart, longen en luchtpijp, en verwijderen en bloc.
  9. Met behulp van een scalpel of een scherpe schaar, sneed de apex van het hart, het blootstellen van de rechter en linker ventrikel.
  10. Canule de pulmonale stam via de rechter ventrikel, en hechtdraad op zijn plaats. Verwijder eventuele overtollige linker ventrikel weefsel.
  11. Canule de luchtpijp en de hechting op zijn plaats. Zorg ervoor dat zowel de tracheale en pulmonale arteriële canules zijn geplaatst dat er geen torsie op de luchtpijp, longen of grote vaten (figuur 1).
  12. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de arteriële canule, omdat luchtbelletjes gevangen in het systeem kan een constante stroom van te voorkomen door het orgel. In sommige gevallen, een luchtbel kan volledig stoppen vocht flow.To dit te bereiken, zet u de hart / long blok in een pot met PBS. Gebruik een spuit met naald om een ​​kleine hoeveelheid PBS te injecteren in het hart canule om het even welke bellen te verdrijven.
  13. Spoelen van de luchtwegen met PBS 4-5 keer, om zo veel lucht te verwijderen als mogelijk uit de longen.
  14. Na lavage staps compleet zijn, opblazen van de longen met PBS met natrium-nitroprusside (SNP) in 1ug/ml. Zet een stop op het tracheale canule, dus de oplossing achterblijft in de longen. Laat de longen te incuberen tot maximaal 30 minuten, als het dezelfde oplossing stroomt door de bloedvaten via de longslagader, met vasodilatatie toe te staan.
  15. Sluit de hart / longen naar een bioreactor cap met behulp van de luer-lock verbinding gekoppeld aan het Y-vormige canules, beschreven in "Bioreactor Assembly" hierboven. (Figuur 1).

3. Orgel decellularisatie

  1. Sluit de dop (met longen bevestigd) aan decellularisatie apparaat (figuur 1). De longslagader canule moet aansluiten op de perfusie lijn, en de tracheale canule moet zweven vrij. Zorg ervoor dat alle lijnen zijn duidelijk van de lucht. Zoals hierboven beschreven, kunnen een bron van slechte decellularisatie lucht in de leidingen worden door te voorkomen dat stroming van decllularization vloeistof. Lucht in het systeem kan ook blijven bestaan ​​in cultuur de tijd, als het kan een negatief effect hebben op overleving van de cel drie hebben.
  2. Blaas de long met PBS / SNP tot de longen vol zijn, maar niet opgeblazen. Onmiddellijk cap de tracheale canule, zodat de longen blijft opgeblazen.
  3. Perfuseren long met PBS / SNP gedurende minstens 15 min bij ~ 15 mm Hg (20 cm H 2 O druk). Na 15min of langer, verwijder de stop uit de tracheale canule, zodat de longen te laten leeglopen.
  4. Ga door perfusie met PBS / SNP voor 30min. Indien nodig, bij te vullen PBS / SNP zorgen perfusiedruk in stand wordt gehouden op 10-15 mmHg.
  5. Begin perfusie met decellularisatie oplossing (8mm CHAPS, 1 M NaCl, 25mm EDTA in 1X PBS). Zorg ervoor dat alle lijnen zijn duidelijk van de lucht. Een vacuüm systeem kan nuttig zijn om zuiging te geven.

Perfuseren met decellularisatie oplossing tot 500 ml van de oplossing is doorbloed door de long. Optimale druk is <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Dit typisch vereist 2,5 uur. Debieten zijn meestal erg traag (0.2-0.5ml/minute) in eerste instantie, en snel tijdens het tweede uur te verhogen tot ongeveer 1ml/minute of hoger. Van tijd tot tijd, gebruikte decellularisatie vocht te verwijderen uit bioreactor, zodat voldoende vocht blijft de ondersteuning van de longen en tracheale canule.

4. Orgel spoelen en sterilisatie

  1. Overdracht long en bioreactor naar een weefselkweek kap. Begin spoelen met steriel PBS door het verwijderen van de 500ml potje dat de decellularisatie vloeistof bevatte en te vervangen met een steriel potje met maximaal 1 liter steriele PBS. Gebruik een stofzuiger om ervoor te zorgen lijnen zijn duidelijk van de lucht.
  2. Perfuseren PBS door het vaatstelsel bij 10-15 mmHg, op dezelfde wijze als bij decellularisatie. Periodiek, verwijderen afval PBS van de bioreactor en vervangen en / of vul het PBS pot met verse, steriele PBS. Het is raadzaam om gebruik steriele techniek.
  3. Ga verder spoelen tot ten minste 2,5 L van steriele PBS hebben doorbloed de long.
  4. Overdracht long aan een nieuwe, steriele bioreactor systeem met verse PBS. Zorg ervoor dat zowel de gehele perfusie loop en de hele luchtweg lijnen zijn gevuld met vloeistof. Alle volgende stappen zullen gebruik maken van een pulserende pomp naar de longen perfuseren op 5ml/min.
  5. Steriliseer het schavot, hetzij via 's nachts perfusie met PBS + 10% + 10% FBS pen-strep oplossing of voor 3 uur met 0,1% perazijnzuur in PBS. Dit laatste vereist het spoelen van de long met 3 veranderingen van 250ml PBS gedurende een aantal uren om de resterende zuur te verwijderen. Voor elke spoeling moet de longen worden geventileerd en perfusie om ervoor te zorgen dat alle onderdelen van het weefsel goed gespoeld zijn.
  6. Overdracht van de long naar een 37 ° C incubator en perfuseren met PBS dat 10% FBS en 10% penicilline / streptomycine voor ~ 1 uur of totdat de temperatuur wordt in evenwicht gebracht, ter voorbereiding van benzonase behandeling.
  7. Behandel long met benzonase te overblijfsel DNA te verwijderen:
    1. Verwarm de benzonase buffer (zie tabel van de reagentia), tot 37 ° C.
    2. Voor elke long, vul een 10 ml spuit met benzonase buffer alleen en een 10 ml spuit met 90U/ml benzonase in buffer.
    3. Stop perfusie van de long.
    4. Blaas de luchtweg met benzonase buffer.
    5. Laat de longen te laten leeglopen (voor ~ 1 minuut). Dan, opblazen van de longen met de benzonase oplossing. Tijdens de inflatie met benzonase buffer & benzonase, probeer dan te voorkomen dat het injecteren van een lucht in de longen.
    6. Laat de longen om zonder perfusie of ventilatie te zitten bij 37 ° C gedurende 1 uur na het oppompen met benzonase.
  8. Hervatten perfusie met de PBS + 10% FBS, 10% penicilline / streptomycine dat al in de bioreactor, en ga 's nachts. De volgende dag, kan de long ofwel worden bewaard bij 4 ° C (maximaal 3 maanden) of vervaardigd voor cel zaaien.
  9. Ter voorbereiding op het schavot voor cellulaire repopulatie, vervang dan de PBS / FBS / benzonase oplossing met ~ 250 ml van het kweekmedium. Perfuseren voor ten minste een uur voor de cellen worden geïntroduceerd, eennd vervangen met vers kweekmedium direct voor het zaaien cellen.

5. Recellularization

De keuze van de cel bron voor orgel inzaaiing is overgelaten aan individuele onderzoekers. Veel mobiele bronnen kunnen worden gebruikt, met inbegrip van de handel verkrijgbare populaties, vers geïsoleerde neonatale of foetale long cellen, embryonale stamcellen, of in de handel verkrijgbaar cel bronnen. Specifieke isolatie protocollen voor deze celpopulaties elders 4,5,6 te vinden. Hier hebben we instructies geven over hoe om zaad zowel endotheel-en epitheelcellen populaties.

Endotheel zaaien:

  1. Bereid een suspensie van de gewenste endotheliale cellen bevolking, in het juiste kweekmedium. Filter celsuspensie door middel van een zeef 40um cel naar cel klonten te verwijderen. Een typische endotheel zaaien in ons laboratorium zou gebruik maken van ongeveer 30 miljoen ratten long microvasculaire endotheelcellen in 60 ml van de cultuur medium.
  2. Doseer celsuspensie in een klein reservoir tijdelijk opgenomen in de perfusie lus van de bioreactor (figuur 2). Zorg ervoor dat de slang uit dit reservoir en de hele perfusie lus is vrij van luchtbellen.
  3. Infundeer cellen in de longslagader in 3ml/min met behulp van een roller pomp.
  4. Na de cel infusie, gaat u verder perfusie met medium recirculatie van de belangrijkste bioreactor op de gewenste snelheid.
  5. Op dagelijkse basis, ervoor zorgen dat de perfusieslang vrij is van luchtbellen.
  6. Medium moet worden vervangen door vers medium regelmatig, dit wordt vaak gedaan om de 3-4 dagen.

Epitheliale zaaien:

  1. Bereid een celsuspensie van de gewenste epitheelcellen bevolking. In ons laboratorium, dit bestaat meestal uit ongeveer 50-100 miljoen neonatale rat pulmonale cellen. Filter de bevolking door 40um cel zeef en schorten in 15 ml van de cultuur medium in een spuit. Vul het reservoir met luchtweg 80 ml van de cultuur medium.
  2. Plaats de bioreactor in een 37 ° C weefselkweek incubator, en sluit de spuit pomp voor ventilatie. Zorg ervoor dat alle ventilatie-lijnen zijn duidelijk van de lucht.
    1. Zaad van de cellen in de longen door het injecteren van 15 ml celsuspensie als een bolus in de tracheale canule.
    2. Direct beginnen met een enkele, trage ademhaling met behulp van de injectiepomp. Deze ademhaling wordt beheerd door intrekking van 60ml van de lucht van de belangrijkste bioreactor op 3ml/minute, dus duren ongeveer 20 minuten. Zorg ervoor dat de luchtfilters op de belangrijkste bioreactor worden afgedekt onmiddellijk na het injecteren van de celsuspensie en voor het begin van de langzame ademhaling.
  3. Laat de longen te statisch te zitten voor ongeveer 18u, en dan langzaam vasculaire perfusie te beginnen (ongeveer 0,5 ml / min).

6. Orgelcultuur

Hoewel de details van perfusie en ventilatie zal variëren op basis van experimenteel design, worden de volgende punten opgemerkt:

  1. Tijdens de endotheliale cultuur, is perfusie typisch uitgevoerd bij 1-3 ml / min met behulp van een roller pomp. Tijdens de epitheliale cultuur, is ventilatie meestal aangeboden in een continue snelheid van een adem per minuut met een spuit pomp. Intrekking van 5-10ml van lucht uit de belangrijkste bioreactor is normaal nodig is om longventilatie effect op een normale tidal volume. Als gevolg van de noodzaak om de bioreactor luchtdicht te houden tijdens ventilatie, dient ventilatie dagelijks worden gepauzeerd en de lucht in de grote kamer moet worden uitgewisseld. Alle lucht in het systeem is ruimte lucht, dat is ongeveer 21% zuurstof door gedeeltelijke druk. De 5-10ml terugtrekking van lucht uit de bioreactor (die leidt tot een 5-10ml inspiratie van vocht door de longen) is gebaseerd op de grootte van de long en hoeveel lobben worden gekweekt (lobben kan worden afgebonden voor analyse, terwijl de resterende lobben verder in de cultuur). De hoeveelheid lucht ingetrokken door de spuit pomp is gekozen om onderlinge aanpassing van de "tidal volume 'van de gekweekte long.
  2. Medium moet ongeveer worden veranderd om de 3-4 dagen tijdens cultuur.
  3. Tijdens de co-cultuur van zowel epitheel en endotheel, experimenten in ons laboratorium meestal eerst zaad het epitheel voor 4-8 dagen, gedurende welke tijd de kunstmatige weefsel wordt geventileerd. Het endotheel wordt vervolgens gezaaid via perfusie, waarna het weefsel is zowel doorbloed en geventileerd.

7. Representatieve resultaten:

Decellularisatie

Wanneer het protocol correct wordt uitgevoerd, moet de vers afgezogen longen te houden lucht zonder lekken. Oppompen ze met lucht, terwijl ondergedompeld in een vloeistof kunt dit controleren - er mogen geen luchtbellen geven luchtlekken. De daaropvolgende decellularisatie moet ~ 500ml decellularisatie vloeistof te stromen toestaan ​​via de longen in de loop van 2,5 - 3 uur bij 37 ° C, en PBS moet uiteindelijk in staat zijn om via de longen stromen op ongeveer 10 ml / min (in ~ 15 mm Hg van de hydrostatische druk) op het einde van de spoelen. Na behandeling met 0,1% perazijnzuur en benzonase, kunnen de longen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden, en nog steeds geschikt blijven voor recellularization.

De laatste gedecellulariseerde extracellulaire matrix moet volledig vrij van cellulaire materialen, en behouden van de grove, microscopische en ultrastructurele kenmerken van inheemse long. Onvoldoende decellularisatie of spoelen kan resulteren in DNA-overblijfsel "plakken" aan de steiger, die kan worden gevisualiseerd met een standaard hematoxyline en eosine vlek (zie figuur 3 voor vergelijking).

Herbevolking van de acellulaire matrix en de cultuur van het longweefsel

Als cellen worden geïsoleerd uit vers 7 dagen oud neonatale rat pups, zoals beschreven in de online-supplement bij het ​​werk van Petersen en zijn collega's 4, kan men verwachten dat een cel opbrengst van 120 tot 150 miljoen cellen per nest van 10 pups (iets meer dan 10 miljoen cellen per pasgeborene).

Optimale condities voor cel zaaien en vervolgens de cultuur van de long in de bioreactor moet opleveren goed verspreid cellen binnen alle vijf lobben van de long, en moet de dekking van ongeveer 70% van de extracellulaire matrix steiger (figuur 3) te geven. De gekweekte cellen bevolking zal positief zijn voor de belangrijkste luchtwegen cel markers, zoals pro-secretorische proteïne-C (SPC), Clara cel secretorische proteïne (CCSP), en aquaporine-5 (AQP), in volgorde van relatieve overvloed (figuur 4).

Figuur 1
Figuur 1. Canules posities en decellularisatie bioreactor

Figuur 2
Figuur 2. Bioreactor worden gebruikt voor het zaaien en de cultuur van technisch longweefsel

Figuur 3
Figuur 3. Histologie van inheemse, gedecellulariseerde, en opnieuw bevolkt long

Figuur 4
Figuur 4. Immunofluorescentiekleuring voor de belangrijkste long markers

Discussion

De meest kritische aspecten van het systeem hier gepresenteerde onder meer het onderhoud van de steriliteit en de nauwgezette controle van de druk toegepast op de vasculaire bed gedurende het gehele proces van voorbereiding en zaaien het schavot en het kweken van de opnieuw bevolkt long. Steriliteit is het best onderhouden door autoclaveren alle materialen voorafgaand aan het gebruik, alsmede door de montage van de long in een gesloten systeem kort na Explantatie en het vermijden van verdere schending van deze barrière. Nadat de gedecellulariseerde matrix is ​​grondig gespoeld en overgebracht naar een steriele bioreactor voor cultuur, moeten de siliconen dop en andere afdichtingen en aansluitingen niet worden verstoord of verwijderd. Om de druk in bedwang, flow gedreven door de zwaartekracht heeft de voorkeur indien mogelijk. Wanneer een pomp nodig is voor recirculatie van vocht, te beginnen na het spoelen met PBS en verder tijdens de cultuur, raden wij u direct meten van de druk net voordat de vloeistof de longslagader met een druk transducer komt. De omvang van de uitgeoefende druk mag niet meer dan 15 mm Hg.

Recellularized longen kunnen worden gekweekt voor verschillende perioden, meestal variërend van 4 dagen tot maximaal 3 weken. Vasculaire perfusie is meestal bereikt bij 1-3 ml / min tijdens de endotheliale cultuur, terwijl ventilatie wordt meestal toegepast met een snelheid van 1 adem / min tijdens de epitheliale cultuur. Tijdens een gecombineerde cultuur periodes, gelijktijdige ventilatie en perfusie geschikt is. Ventilatie kan worden uitgevoerd met een vloeibaar medium of lucht.

In de loop van de afgelopen decennia hebben verschillende groepen gedaan belangrijke tissue engineering werk toont de haalbaarheid van differentiatie long epitheel in vitro en van repliceren verschillende aspecten van de long microanatomy 7,8,9, 10. Echter, tot voor kort had 4,5 geen van deze pogingen om het longweefsel ingenieur resulteerde in een implanteerbare orgaan dat in staat was om scheiding tussen het bloed en luchtwegen compartimenten te onderhouden en dat kan deelnemen aan de gasuitwisseling. Daarom, hoewel de beschreven methoden zijn slechts een eerste stap in de richting van de lange-termijn doel van het genereren van functionele longweefsel, dit werk is een bemoedigende stap in de richting van de mogelijkheid van een verhoging van het bedrag van het longweefsel beschikbaar zijn voor transplantatie. Bovendien, dit werk dieper werk van Ott et al.. Uygun en en collega's 11,12, het aantonen van de werkzaamheid van een gedecellulariseerde extracellulaire matrix als een steiger voor tissue engineering complexe drie-dimensionale structuren en het ondersteunen van de groei en overleving van de verschillende typen cellen . Dit werk is ook belangrijk voor haar bijdrage aan het instrumentarium van de luchtwegen cel-en moleculair biologen. Door het verstrekken van een unieke, driedimensionale omgeving die ook kunnen zorgen voor de nodige mechanische stimuli, en dat is het niet met de daarmee gepaard gaande gevaar van de snelle de-differentiatie, dat men zou kunnen tegenkomen bij het ​​kweken van knaagdieren epitheel in het laboratorium met meer traditionele methoden 13, wetenschappers kunnen gebruiken ons systeem om nieuwe inzicht te krijgen in cel-cel en cel-matrix interacties die een rol spelen in cel differentiatie en functie. Deze kennis kan in het bijzonder sterk als het gebruikt als hefboom om het lot van verschillende stamcelpopulaties gids, zoals Cortiella's groep heeft aangetoond in de eerste studies 14.

Disclosures

LEN houdt voorraad in Humacyte, een regeneratieve geneeskunde bedrijf. Humacyte niet financieren deze studies, en had geen invloed op het ontwerp, de interpretatie, of rapportage van een van de experimenten of methoden beschreven. De auteurs (LEN, THP, EAC) en de universiteit van Yale hebben een patentaanvraag ingediend die verband houden met tissue engineering van de longen.

Acknowledgements

Wij danken Maegan B. Colehour voor hulp bij bioreactor ontwikkeling. Deze studies werden gefinancierd door Yale University Department of Anesthesie en door het NIH subsidie ​​HL 098220 (tot LEN). THP werd ondersteund door NIH T32 GM007171.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthanasia
Heparin Sigma-Aldrich H4784
Sodium nitroprusside Fluka 71778
Euthasol euthanasia solution Virbac Animal Health 710101 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration
Decell Solution
CHAPS Sigma-Aldrich C3023
NaCl American Bioanalytical AB01915
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaOH JT Baker 3722-01
1X PBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Bioreactor Components
480 ml jar Cole-Parmer EW-3460560
Silicone stopper, size 14 Cole-Parmer EW-06298-26
Y-connectors Cole-Parmer ED-30614-08 Used for arterial and tracheal cannulae
Silicone tubing Masterflex (Cole Palmer) 96420-14; 16 L/S 14; 16
Pressure Transducers Edwards Lifesciences PX-212
Check valve Cole-Parmer EW-98553-20 One-way valve
4-way stopcocks Edwards Lifesciences 594WSC
Syringe filter Cole-Parmer 2915-08 PTFE, 0.2μm
Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor)
500 and 1000 ml glass bottles Corning 1395-500; -1L Used for decell and rinsing by gravity
Benzonase Treatment
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140122
FBS Hyclone SH30071.03
Tris-HCl American Bioanalytical AB14043 1M, pH 8.0
MgCl2 JT Baker 2444-01
BSA Sigma-Aldrich A9647
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Lung Association. Lung Disease Data. (2008).
  2. Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. (2010).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
  4. Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
  5. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
  6. Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
  7. Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
  8. Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
  9. Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
  10. Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. (2010).
  11. Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  12. Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  13. Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
  14. Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats