الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable

Published 4/28/2011
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

ERRATUM NOTICE

Summary

ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لتسمية وتتبع مصير مجموعات صغيرة من الخلايا باستخدام الأجنة الزرد للأشعة فوق البنفسجية من uncaging فلوريسئين قفص ، يليه جبل بأكمله immunolabeling لتضخيم إشارة من فلوريسئين uncaged.

Cite this Article

Copy Citation

Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672, doi:10.3791/2672 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتتمثل المشكلة الرئيسية في البيولوجيا التطورية هو استدلال على الأصل من عدد لا يحصى من أنواع الخلايا الموجودة في الفقاريات لأنها تنشأ من السلائف غير متمايزة. الباحثون قد استخدمت أساليب مختلفة لوضع العلامات النسب ، مثل وضع العلامات الجاذبة (1) وحقن ضغط الانزيمات يمكن عزوها 2 إلى مصير الخلية التحقق في مراحل لاحقة من تطور في نظم النموذج. تم تجميع الخرائط مصير الاولى في الزرد (دانيو rerio) عن طريق الحقن iontophoretic من الأصباغ الفلورية ، مثل ديكستران رودامين ، إلى خلايا في مناطق منفصلة واحدة من الجنين وتتبع مصير الخلية المسمى على مر الزمن 3-5. في حين فعالة ، وهذه الأساليب يطالبون تقنيا وتتطلب معدات متخصصة لا توجد عادة في المختبرات الزرد. في الآونة الأخيرة ، والبروتينات الفلورية photoconvertable ، مثل إيوس Kaede الذي والذي لا رجعة فيه التبديل من الأخضر إلى الأحمر عند تعرضها مضان للأشعة فوق البنفسجية ، نشهد زيادة في استخدام الزرد 6-8. جعلت من الوضوح البصري للجنين الزرد والسهولة النسبية لهذه الأدوات transgenesis جاذبية خاصة لوضع العلامات ونسبها لمراقبة الهجرة من الخلايا في الجسم الحي 7. على الرغم من فائدتها ، وهذه البروتينات وبعض العيوب مقارنة صبغ بوساطة طرق وضع العلامات النسب. الحاسمة الأكثر صعوبة هو أننا وجدنا في الحصول على أعلى مستوى خلال 3 - D القرار خلال photoconversion من هذه البروتينات. في ضوء ذلك ، وربما أفضل مزيج من القرار ، وسهولة الاستخدام لوضع العلامات النسب في الزرد يجعل من استخدام ديكستران فلوريسئين قفص ، صبغة الفلورسنت المنضم إلى مجموعة التبريد التي أقنعة 9 في مضان. يمكن أن تكون الصبغة ثم "uncaged" (صدر من مجموعة التبريد) داخل خلية معينة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الليزر أو الزئبق ، مما يسمح للتصور ، أو مضان مناعي. خلافا لأساليب iontophoretic ، يمكن حقنه في قفص فلوريسئين مع الأجهزة القياسية وحقن uncaged مع مجهرا epifluorescence مجهزة ذات الثقب 10. بالإضافة إلى ذلك ، كشف عن الأجسام المضادة ضد فلوريسئين فقط على شكل uncaged ، وكذلك تثبيت حاتمة ينجو 11. أخيرا ، يمكن تفعيلها فلوريسئين قفص مع القرار 3 - D عالية جدا ، خصوصا إذا كان يعمل المجهر ثنائي الفوتون 12،13. يصف هذا البروتوكول وسيلة لوضع العلامات النسب التي فلوريسئين قفص uncaging والليزر. Subsequenctly ، يتم الكشف عن uncaged فلوريسئين بالتزامن مع الحواتم أخرى مثل وضع العلامات التي GFP مع الأجسام المضادة.

Protocol

1. توليف ديكستران فلوريسئين محبوس

  1. قياس خارج 3،5-4 ملغ من aminodextran وإضافة إلى أنبوب Invitrogen الموفر ملون يحتوي على 1 ملغ من CMNB SE - قفص فلوريسئين. في أيدينا هذه النسبة يعطي متوسط ​​التحميل من الجزيئات ~ 2.5 في صبغ ديكستران.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من 0.1 م نا العازلة B 2 O 7 (بورات الصوديوم) من 4 إلى الأنبوب.
  3. قبعة ودوامة لمدة 30 ثانية ليحل aminodextran وفلوريسئين مطلقة السراح.
  4. اسمحوا تتفاعل بين عشية وضحاها على خلاط vortexing.
  5. تطور قبالة إغلاق أسفل على عمود الدوران زيبا وتخفيف الغطاء. علامة نقطة على العمود بالقلم شعرت معلومات سرية. مكان العمود في أنبوب 15 مل المخروطية.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة مع النقطة التي تواجه وسط الدوار. استخدام العمود مباشرة بعد ضغط.
  7. مكان العمود ضغط في أنبوب 15 مل جديدة المخروطية.
  8. تجمع خليط التفاعل ونقل إلى مركز للسرير عمود الراتنج المضغوط. استبدال الغطاء.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة مع النقطة التي تواجه وسط الدوار. بعد زيادة ونقصان ، فإن شاطف والجزء العلوي من العمود تكون تقريبا نفس الظل أصفر اللون.
  10. نقل شاطف الأصفر (~ 350 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  11. Lyophilize إلى جفاف في speedvac. تغطية speedvac مع احباط.
  12. اعادة تعليق الناتجة ~ 2-3 ملغ من الرغوة صفراء باهتة في الماء لتركيز النهائي من 1 ٪ ث / v.
  13. هذا الحل في تخزين -20 درجة مئوية في احباط أنابيب مغطاة. انها فكرة جيدة لديكستران قسامة الحل لمنع تجميد الذوبان المتكررة.

2. حقن ديكستران فلوريسئين محبوس في اجنة اسماك الزرد

  1. مخفف 1 ٪ وزن / حجم المخزون من قفص 01:05 ديكستران فلوريسئين أو 01:10 في بوكل 0.2M.
  2. ضخ 0.5 -- 1.0nL حل فلوريسئين في قفص واحد صفار أجنة باستخدام خلايا المرحلة حاقن الضغط. حقنه مرة واحدة ، يجب أن تبقى براثن الأجنة في الظلام على 28،5 درجة مئوية للحد من uncaging غير محددة.
  3. إزالة يدويا chorions من أجنة.
  4. تخدير الأجنة في tricaine 4 ٪.
  5. يقام الأجنة في agarose 0.8 ٪ في طبق بتري 35mmx10mm ، ثم تغطى البيض مع الماء.
  6. يوازن agarose ذابت في حرارة 50 درجة مئوية لمنع ما لا يقل عن 15 دقيقة.
  7. باستخدام ماصة الزجاج ، ووضع في جنين واحد على كمية ضئيلة من المياه والإفراج عنها في agarose ملاحظة : من المهم لتبريد أنبوب agarose في يدك لمدة 30 ثانية تقريبا قبل وضع الجنين في أنبوب لتفادي قتل الجنين.
  8. ماصة الجنين من الأنبوب ، جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 50μL agarose وإخراج محتوياتها على مركز للطبق بتري.
  9. توجيه بسرعة الجنين باستخدام خيط من البلاستيك مع الخلايا لتكون uncaged مواجهة ملاحظة : agarose مع يبرد بسرعة حتى تكون متسرعة مع توجيه الجنين. يمكن أن تتلف الأجنة إذا التلاعب بعد agarose تصبح جامدة.
  10. السماح لترسيخ agarose تماما (وهذا يستغرق بضع دقائق) وملء الطبق 2 / 3 كامل مع المياه التي تحتوي على البيض tricaine 4 ٪ و 0.003 ٪ PTU.

3. الليزر Uncaging من ديكستران فلوريسئين

  1. يجب أن تستخدم لمجهر uncaging لها الغمر بالمياه 40X الهدف.
  2. نستخدم اجهزة ليزر الضوئيات مع الخلية 365 نانومتر صباغة و70 ٪ / 30 ٪ مرآة انقسام مزدوج اللون.
  3. قبل uncaging ، يجب بذل الليزر مستتب البؤرتين مع هدف والموهنة للسلطة الملائمة.
  4. لتركيز الليزر ، ووضع شريحة زجاجية معكوسة في إطار الهدف والتركيز على الهدف حتى خدوش في الشريحة مرئية.
  5. ضبط الليزر المخفف حتى ليزر يمكن أن يؤدي إلى نقطة الصفر واضحة للعيان في المرآة مع نبضة واحدة.
  6. ضبط التركيز الهدف صعودا وهبوطا. إذا كان ليزر يمكن أن يؤدي إلى نقطة الصفر عندما كان الهدف هو الخروج من التركيز وضبط تركيز الليزر ¼ بدوره صعودا أو هبوطا. أكرر حتى ليزر يمكن التسويد في المرآة فقط عندما يتركز الهدف.
  7. شنت مكان الجنين في إطار الهدف والتركيز على المنطقة المراد uncaged.
  8. لuncage ، والتركيز على خلية من الاهتمام وأنه نبض 1-20 مرات في 03/02 هرتز.
  9. بعد uncaging ، حرر الجنين عن طريق تقشير agarose بعيدا مع ملقط ووضعها في الماء البيض التي تحتوي على PTU 0.003 ٪. اسمحوا تطوير الأجنة في ضوء مربع محكم حتى يتم إصلاح عليها.

4. وضع العلامات والكشف عن الأجسام المضادة ديكستران فلوريسئين Uncaged

  1. (1X التخزين المؤقت الفوسفات بارافورمالدهيد 4 ٪ ، 0.3mM CaCl 2 ، 8 ٪ سكروز ، المالحة ، ودرجة الحموضة 7.3) إصلاح الأجنة في تثبيتي أب لمدة سنتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) ، أو بين عشية وضحاها (O / N) في 4 درجات مئوية. إبقاء الأجنة في مربع ضيق الخفيفة أو أنبوب احباط الملفوفة لجميع الخطوات التوسيم.
  2. إزالة تثبيتي ، واستبدال MeOH 100 ٪ ، وتترك لمدة 10 دقيقة على RT ، وإزالة MeOH replaم مع MeOH الطازجة بنسبة 100 ٪.
  3. متجر في MeOH عند درجة -20 لما لا يقل عن 30 دقيقة ملاحظة : يمكنك تخزينها في MeOH لمدة تصل إلى أسبوعين قبل أن تبدأ الحواتم أن تتحلل.
  4. ترطيب الأجنة مع 5 يغسل دقيقة في RT MeOH/1X للفوسفات 75 ٪ مخزنة المالحة بنسبة 0.1 ٪ توين 20 (1X PBSTw) ، ثم 50 ٪ 1XPBTw MeOH/50 ٪ ثم 25 ٪ MeOH/75 ٪ 1X PBSTw.
  5. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 1XPBSTw.
  6. إذا الأجنة> 24 ساعة من العمر ، permiabilize الأجنة مع 10 ميكروغرام / مل بروتين كاف في 1XPBSTw. الوقت Permiabilization يعتمد على خشبة المسرح. خمس دقائق في K بروتين كاف إذا الأجنة ما بين 24 و 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). قد تكون هناك حاجة الى مزيد من الوقت إذا كان لكبار السن من اليرقات. إعادة الإصلاح في تثبيتي ، أب لمدة 20 دقيقة في RT
  7. تغسل خمس مرات لمدة 5 دقائق في 1XPBSTw في RT.
  8. احتضان في حل كتلة (1XPBS ، 0.1 ٪ X100 تريتون ، و 10 ٪ مصل الأغنام والأبقار 10 ٪ مصل الزلال ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد 1 ٪) لمدة 1-2 ساعات في RT.
  9. تمييع الأضداد الابتدائي (المضادة للفلوريسئين زائد أجسام مضادة ضد خلايا من نوع علامات محددة) في عرقلة الحل.
  10. أجنة احتضان O / N عند 4 درجة مئوية في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأولية.
  11. غسل أربع مرات لمدة 20 دقيقة في 1XPhosphate التخزين المؤقت مع المؤسسة العامة لتحلية X100 تريتون 0.1 ٪ (PBSTx) في RT.
  12. تمييع fluorescently المسمى الأجسام المضادة الثانوية (1:300 عادة) في عرقلة الحل.
  13. احتضان O / N عند 4 درجة مئوية في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية.
  14. غسل أربع مرات لمدة 20 دقيقة في 1XPBSTx في RT.
  15. أجنة واضحة في 1XPBS 50 ٪ glycerol/50 ٪ لمدة ساعتين على الأقل في RT ، ثم إزالة الجلسرين / PBS الخليط ويضاف الجلسرين بنسبة 100 ٪ واسمحوا الوقوف O / N عند 4 درجات مئوية.

5. ممثل النتائج :

بعد immunolabeling ، ينبغي أن يكون هناك مساحة من تلطيخ المخصب في الخلايا التي تم uncaged (Figure.1). ليس من غير المعتاد أن نرى إشارة إلى نسبة عالية نسبيا من الضوضاء في> الزرد 48 ساعة القديمة ، ويرجع ذلك إلى uncaging عفوية من فلوريسئين.

الشكل 1
الشكل 1. وسم النسب المعقدة الزرد الصنوبرية. وقد برز uncaged GFP التعبير ، وذلك باستخدام نبضات الليزر الأشعة فوق البنفسجية A) بواسطة 48hpf ، كتلة في الجانب الايسر من الخلايا تسمى صنيبري (دائرة حمراء) من uncaged : في 24 HPF ، وهو جزء من بدأة في الصنوبرية الأمامي الذي يشار إليه بواسطة foxd3. المجال (دائرة بيضاء). B) هو أثرى Uncaged فلوريسئين إشارة في الدائرة (صنيبري الحمراء) والجهاز الصنوبرية (دائرة بيضاء)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما هو موضح ، هذا البروتوكول يتيح وضع العلامات النسب سريع نسبيا في الزرد أن الأسلوب المبني على التقنيات المستخدمة عادة من microinjection ، المجهري ، والمناعي. لقد وجدنا أن ليزر uncaging أن يكون الوسيلة الأكثر فعالية وأقل تكلفة لuncage فلوريسئين بطريقة المترجمة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية النسب مع نهايات تجريبية في وقت متأخر من 4 DPF. لكن ، وكما انقسام الخلايا ، وتركز في قفص - فلوريسئين لكل خلية انخفاضا في نهاية المطاف إلى ما بعد المستويات التي يمكن اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك تقارير uncaging عفوية غير محددة ، في فلوريسئين اليرقات الزرد 11. على هذا النحو ، والكشف عن فلوريسئين uncaged هو الأكثر فعالية في مرحلة اليرقات في وقت مبكر (48-72 HPF) أو في وقت سابق.

uncaging أسلوبنا المفضل هو عن طريق استخدام ليزر نابض النيتروجين. ويشيع استخدام هذه الخلايا لإجراء التجارب ablations ودقيقة بما فيه الكفاية لuncage الخلايا سفعة أو مجموعات صغيرة من الخلايا 11-12. ومع ذلك ، يمكن أيضا أن يتحقق uncaging باستخدام المجهر مبائر ؛ استخدمت اثنين الفوتون المجاهر مبائر لتحقيق دقيق جدا uncaging 12. على الطرف الآخر من الطيف ، إذا كان غير مطلوب الدقة ثم الليزر هو الاستغناء عنها. ويمكن استخدام مجهر epifluorescent مجهزة مجموعة لتصفية دابي uncage خلال ثقب صغير صغير 11.

لقد وجدنا أن الكشف عن فلوريسئين uncaged باستخدام الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية الضد الفلورسنت التي تنبعث في طول موجة حمراء أو حتى الحمراء (على سبيل المثال اليكسا 633) يناسب احتياجاتنا. وهذا يسمح لنا أن نميز بين فلوريسئين uncaged من GFP التي أعرب عنها التحوير (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر دان كارلين للحصول على مساعدة في صنع فلوريسئين مطلقة السراح. بالإضافة نود أن نشكر مصادر التمويل التالية : مدرسة الطب بجامعة فاندربيلت البرنامج التنموي لعلم الأحياء المنح التدريبية لJAC ، والمعاهد الوطنية للصحة JTG HD054534to.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMNB-caged fluorescein SE Invitrogen C20050
Aminodextran, 10kDa Invitrogen D1860
Zeba desalt spin columns Pierce, Thermo Scientific 89889
goat anti-fluorescein antibody Invitrogen A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody Invitrogen A21082
35mmx10mm petri dishes BD Biosciences 351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective Leica Microsystems DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU) Alfa Aesar L06690
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Proteinase K Roche Group 03115836991
Plastic thread Any Supplier
Agarose Research Products International Corp. A20090
SpeedVac Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant SPD131DDA
Vortexing mixer VWR international Vortex Genie 2
Pressure injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
  2. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
  3. Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
  4. Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. Suppl 2. 1-8 (1991).
  5. Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
  6. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
  7. Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
  8. Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
  9. Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 9th Edition, 707-711 (2002).
  10. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
  11. Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
  12. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  13. Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 05/25/2011. Citeable Link.

A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:

Ilya A. Shestopalov and James K. Chen

instead of:

Ilya Shestopalov and James Chen

Comments

1 Comment

  1. u did not wear gloves.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 24, 2011 - 4:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats