वंश Zebrafish कक्ष लेजर Uncagable fluorescein Dextran के साथ लेबल

Published 4/28/2011
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Biology

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ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल लेबल और बंदी fluorescein के uncaging यूवी, पूरे uncaged fluorescein से संकेत बढ़ाना immunolabeling माउंट द्वारा पीछा का उपयोग कोशिकाओं zebrafish भ्रूण के छोटे समूहों के भाग्य का पता लगाने के लिए रास्ता रूपरेखा बनाती है.

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Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672, doi:10.3791/2672 (2011).

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Abstract

Protocol

1. बंदी fluorescein Dextran के संश्लेषण

  1. बाहर 3.5 उपाय - aminodextran के 4 मिलीग्राम और Invitrogen की आपूर्ति रंगा हुआ CMNB - बंदी fluorescein एसई के 1 मिलीग्राम से युक्त ट्यूब में जोड़ें. हमारे हाथ में इस अनुपात ~ dextran 2.5 प्रतिशत डाई अणु के एक औसत लोड हो रहा है देता है.
  2. ट्यूब 0.1 एम ना 2 बी 4 7 हे (सोडियम borate) बफर के 500 μL जोड़ें.
  3. कैप और 30 सेकंड के aminodextran और बंदी fluorescein भंग के लिए भंवर.
  4. चलो एक vortexing मिक्सर पर रातोंरात प्रतिक्रिया.
  5. Zeba स्पिन स्तंभ पर नीचे बंद ट्विस्ट और टोपी ढीला. मार्क एक महसूस की नोक कलम के साथ स्तंभ पर एक डॉट. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें स्तंभ.
  6. रोटर के केंद्र का सामना करना पड़ रहा डॉट के साथ 2 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र. Compacting के तुरंत बाद स्तंभ का उपयोग करें.
  7. एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जमा स्तंभ रखें.
  8. पूल प्रतिक्रिया मिश्रण और जमा स्तंभ राल बिस्तर के केंद्र के लिए स्थानांतरण. टोपी बदलें.
  9. रोटर के केंद्र का सामना करना पड़ रहा डॉट के साथ 2 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र. स्पिन के बाद, eluent और स्तंभ के ऊपर मोटे तौर पर रंग में पीले रंग की ही छाया हो जाएगा.
  10. Microcentrifuge 1.5 एमएल ट्यूब पीले eluent (~ 350 μL) स्थानांतरण.
  11. Speedvac में सूखापन Lyophilize. कवर पन्नी के साथ speedvac.
  12. पुनः निलंबित परिणामस्वरूप ~ 2-3 हल्के पीले फोम के पानी में 1% w / वी. के अंतिम एकाग्रता के लिए मिलीग्राम
  13. -20 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी कवर ट्यूबों में इस समाधान स्टोर. यह विभाज्य करने के लिए एक अच्छा विचार dextran के दोहराव फ्रीज विगलन को रोकने के लिए समाधान है.

2. बंदी fluorescein Dextran के Zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन

  1. 0.2M KCl में 1% बंदी fluorescein dextran 1:05 या 1:10 स्टॉक w / ध् पतला.
  2. 0.5 सुई - 1.0nL एक सेल चरण भ्रूण का उपयोग कर एक दबाव सुई लगानेवाला की जर्दी में बंदी fluorescein समाधान की. एक बार इंजेक्शन, भ्रूण के चंगुल 28.5 पर अंधेरे में रखा जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस गैर विशिष्ट uncaging कम.
  3. भ्रूण से मैन्युअली chorions हटा दें.
  4. 4% tricaine में भ्रूण anesthetize.
  5. भ्रूण 35mmx10mm पेट्री डिश में 0.8% agarose में बढ़ जाएगा, तो अंडे पानी के साथ कवर किया.
  6. 50 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में कम से कम 15 मिनट के लिए पिघल agarose संतुलित करना.
  7. एक गिलास पिपेट का उपयोग, पानी की एक न्यूनतम राशि में एक भ्रूण आकर्षित और यह agarose नोट में जारी: यह महत्वपूर्ण है अपने हाथ में agarose के लगभग 30 सेकंड के लिए ट्यूब ट्यूब में डाल भ्रूण से बचने के लिए शांत पहले भ्रूण हत्या.
  8. ट्यूब से भ्रूण पिपेट, और 50μL लगभग agarose के साथ पेट्री डिश के केंद्र पर सामग्री बेदखल करना.
  9. जल्दी भ्रूण सामना करना पड़ रहा uncaged कोशिकाओं के साथ एक प्लास्टिक के धागे का उपयोग पूरबी नोट: के साथ इतनी जल्दी शांत भ्रूण orienting के साथ जल्दबाजी में हो agarose. भ्रूण अगर छेड़छाड़ के बाद agarose कठोर हो जाता है क्षतिग्रस्त किया जा सकता है है.
  10. Agarose पूरी तरह से जमना (यह एक कुछ मिनट लगते हैं) और डिश दो तिहाई अंडे 4% tricaine और 0.003% PTU युक्त पानी के साथ पूर्ण भरने की अनुमति दें.

3. Fluorescein Dextran के लेजर Uncaging

  1. uncaging के लिए इस्तेमाल किया खुर्दबीन एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य होना चाहिए.
  2. हम 365 एनएम डाई सेल और 70% / 30% विभाजन dichroic दर्पण के साथ एक फोटोनिक्स उपकरण लेजर का उपयोग करें.
  3. पहले uncaging, लेजर उद्देश्य और उचित सत्ता में तनु के साथ parfocal किया जाना चाहिए.
  4. लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए, उद्देश्य के तहत एक नजर आता है गिलास स्लाइड जगह है और ध्यान केंद्रित उद्देश्य जब तक स्लाइड में खरोंच दिखाई दे रहे हैं.
  5. लेजर attenuator समायोजित करें जब तक लेजर एक नाड़ी के साथ दर्पण में एक स्पष्ट रूप से दिखाई खरोंच का उत्पादन कर सकते हैं.
  6. उद्देश्य ध्यान केंद्रित समायोजित और नीचे. यदि लेजर एक खरोंच का उत्पादन जब उद्देश्य ध्यान से बाहर है, लेजर फोकस समायोजित ¼ ऊपर या नीचे बारी. दोहराएँ जब तक कि लेजर दर्पण उद्देश्य केवल जब ध्यान केंद्रित है खरोंच कर सकते हैं.
  7. प्लेस उद्देश्य और uncaged क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित के तहत भ्रूण मुहिम शुरू की.
  8. रिहा कर देना करने के लिए, ब्याज की एक सेल पर ध्यान केंद्रित करने और यह 2-3 हर्ट्ज पर 10-20 बार नाड़ी.
  9. Uncaging के बाद, agarose संदंश के साथ दूर छीलने उन्हें अंडे पानी में डाल 0.003% PTU युक्त द्वारा मुक्त भ्रूण. भ्रूण प्रकाश तंग एक बॉक्स में विकसित जब तक वे तय कर रहे हैं.

4. एंटीबॉडी लेबल और Uncaged fluorescein Dextran की जांच

  1. ठीक अब लगानेवाला में भ्रूण 4 में दो से चार घंटे कमरा (आर टी) तापमान या रातोंरात (ओ / एन) में डिग्री सेल्सियस के लिए (4% paraformaldehyde, 0.3mm 2 CaCl, 8% sucrose, 1X फास्फेट खारा, 7.3 पीएच buffered ) सभी लेबलिंग चरणों के लिए एक प्रकाश तंग बॉक्स या पन्नी लिपटे ट्यूब में भ्रूण रखें.
  2. लगानेवाला निकालें और 100% MeOH के साथ जगह, आरटी से कम 10 मिनट के लिए छोड़ दें, MeOH और repla हटायेंताजा MeOH 100% के साथ CE.
  3. MeOH में कम से कम 30 मिनट के लिए -20 ° सी में स्टोर नोट: आप MeOH में दो सप्ताह के लिए दुकान से पहले epitopes को नीचा दिखाना शुरू कर सकते हैं .
  4. 75% MeOH/1X फास्फेट के आरटी पर 5 मिनट washes के साथ भ्रूण rehydrate 0.1% के बीच 20 (1X PBSTw) के साथ खारा buffered, तो 50% MeOH/50% 1XPBTw, तो 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
  5. 1XPBSTw में 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं.
  6. यदि भ्रूण> 24 घंटे पुराने हैं, 10 μg / एमएल proteinase कश्मीर 1XPBSTw में भ्रूण permiabilize. Permiabilization समय मंच पर निर्भर करता है. Proteinase कश्मीर में पांच मिनट के लिए पर्याप्त है अगर भ्रूण 24 और 48 घंटे बाद निषेचन (HPF) के बीच हैं. अधिक समय बड़े लार्वा के लिए यदि आवश्यक हो सकता है. आरटी पर 20 मिनट के लिए अब लगानेवाला में पुनः तय
  7. आरटी 1XPBSTw में 5 मिनट के लिए पांच बार धोएं.
  8. ब्लॉक समाधान में (1XPBS, 0.1% ट्राइटन x100, 10% भेड़ सीरम, 10% गोजातीय सीरम अंडे की सफ़ेदी, 1% डाइमिथाइल sulfoxide) आरटी पर 1-2 घंटे के लिए सेते हैं.
  9. पतला समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी fluorescein प्लस सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी).
  10. सेते भ्रूण हे N / 4 ° सी प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान में.
  11. 1XPhosphate में 20 मिनट के लिए चार बार धो 0.1% आरटी में ट्राइटन x100 (PBSTx) के साथ खारा buffered.
  12. पतला समाधान अवरुद्ध में fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (1:300 आमतौर पर).
  13. सेते हे / N 4 बजे ° सी माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान में.
  14. आरटी 1XPBSTx में 20 मिनट के लिए चार बार धो लें.
  15. आरटी पर कम से कम दो घंटे के लिए 50% glycerol/50% 1XPBS में साफ भ्रूण, तो ग्लिसरॉल / पीबीएस मिश्रण को हटाने और 100% ग्लिसरॉल जोड़ने और ओ एन / 4 में खड़े दो डिग्री सेल्सियस

5. प्रतिनिधि परिणाम:

Immunolabeling के बाद, वहाँ कोशिकाओं है कि (Figure.1) uncaged थे धुंधला हो जाना के एक समृद्ध क्षेत्र होना चाहिए. यह असामान्य शोर अनुपात करने के लिए> 48 घंटे पुराने zebrafish में एक अपेक्षाकृत उच्च संकेत, fluorescein की सहज uncaging कारण देख नहीं है.

चित्रा 1
चित्रा 1 zebrafish चीटीदार परिसर के वंश लेबलिंग. 24 से कम HPF, पूर्वकाल चीटीदार anlage के एक हिस्से, foxd3 द्वारा संकेत: GFP अभिव्यक्ति, यूवी लेजर दालों का उपयोग uncaged था 48hpf करके), कोशिकाओं का एक समूह बाईं तरफा parapineal बुलाया लाल वृत्त () uncaged से उभरा है डोमेन (सफेद वृत्त) बी.) Uncaged fluorescein संकेत parapineal (लाल वृत्त में समृद्ध है) और चीटीदार अंग (सफेद वृत्त).

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है, zebrafish में एक अपेक्षाकृत जल्दी वंश लेबलिंग तरीका है कि microinjection, माइक्रोस्कोपी, और immunofluorescence का आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक पर बनाया गया है प्रदान करता है. हमने पाया है कि लेजर के लिए सबसे कुशल और लागत प्रभावी एक स्थानीय फैशन में fluorescein रिहा कर देना uncaging. इस विधि endpoints के साथ प्रयोगात्मक वंश लेबल 4 DPF के रूप में देर के रूप में में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, सेल प्रति एकाग्रता बंदी fluorescein अंततः detectable स्तर से परे घट जाती है. इसके अलावा, वहाँ सहज, zebrafish लार्वा 11 में गैर विशिष्ट fluorescein के uncaging की रिपोर्ट किया गया है. Uncaged fluorescein की ऐसी पहचान, के रूप में जल्दी लार्वा चरण में सबसे अधिक प्रभावी (48-72 HPF) या पहले है.

हमारी पसंदीदा uncaging विधि एक स्पंदित नाइट्रोजन लेजर का उपयोग कर रहा है. ये आमतौर पर सेल ablations प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है और पर्याप्त झुलसाना कक्षों या 11-12 कोशिकाओं के छोटे समूहों को रिहा कर देना सही हैं. हालांकि, uncaging भी एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर निपुण किया जा सकता है, दो फोटोन confocal सूक्ष्मदर्शी बहुत ही सटीक 12 uncaging प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. स्पेक्ट्रम के दूसरे छोर पर, अगर परिशुद्धता की आवश्यकता नहीं है, तो एक लेजर नगण्य है. एक epifluorescent एक DAPI फ़िल्टर सेट के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के लिए एक छोटे pinhole 11 के माध्यम से रिहा कर देना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम uncaged fluorescein की है कि पता लगाने के एक प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी कि एक लाल या दूर लाल (जैसे 633 Alexa) तरंग दैर्ध्य सबसे अच्छा हमारी जरूरतों सूट पर उत्सर्जन करता है का उपयोग कर पाया है. यह हमें GFP से uncaged fluorescein एक transgene (चित्रा 1) द्वारा व्यक्त भेद करने के लिए अनुमति देता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम दान कार्लिन बंदी fluorescein बनाने में मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इसके अलावा हम निम्नलिखित वित्तपोषण स्रोतों का धन्यवाद करना चाहते हैं: JAC Vanderbilt विकासात्मक जीवविज्ञान प्रशिक्षण अनुदान के लिए विश्वविद्यालय के मेडिकल स्कूल कार्यक्रम, और NIH HD054534to JTG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMNB-caged fluorescein SE Invitrogen C20050
Aminodextran, 10kDa Invitrogen D1860
Zeba desalt spin columns Pierce, Thermo Scientific 89889
goat anti-fluorescein antibody Invitrogen A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody Invitrogen A21082
35mmx10mm petri dishes BD Biosciences 351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective Leica Microsystems DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU) Alfa Aesar L06690
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Proteinase K Roche Group 03115836991
Plastic thread Any Supplier
Agarose Research Products International Corp. A20090
SpeedVac Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant SPD131DDA
Vortexing mixer VWR international Vortex Genie 2
Pressure injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 05/25/2011. Citeable Link.

A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:

Ilya A. Shestopalov and James K. Chen

instead of:

Ilya Shestopalov and James Chen

Comments

1 Comment

  1. u did not wear gloves.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 24, 2011 - 4:43 PM

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