Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

Published 4/28/2011
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo esboza una manera de etiquetar y rastrear el destino de los pequeños grupos de células de embriones de pez cebra empleando la radiación UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido de monte se inmunomarcaje para amplificar la señal de la fluoresceína uncaged.

Cite this Article

Copy Citation

Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672, doi:10.3791/2672 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Un problema central en la biología del desarrollo es deducir el origen de la miríada de tipos de células presentes en los vertebrados que se presenten a partir de precursores indiferenciados. Los investigadores han utilizado diversos mecanismos de etiquetado linaje, como DII etiquetado y una presión de inyección de enzimas trazabilidad de 2 a determinar el destino celular en etapas posteriores del desarrollo de los sistemas modelo. Los mapas de destino por primera vez en el pez cebra (Danio rerio) se reunieron por inyección iontoforética de los tintes fluorescentes, tales como rodamina dextrano, en células individuales en regiones discretas del embrión y el seguimiento de la suerte de la celda marcada con el tiempo 5.3. Si bien es efectivo, estos métodos son técnicamente exigentes y requieren equipo especializado no se encuentran comúnmente en los laboratorios de pez cebra. Recientemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como el Eos y Kaede, que irreversiblemente cambia de verde a rojo cuando la fluorescencia expuestos a la luz ultravioleta, estamos viendo un mayor uso en el pez cebra 6-8. La claridad óptica del embrión de pez cebra y la relativa facilidad de la transgénesis ha hecho estas herramientas especialmente atractiva para el etiquetado de linaje y de observar la migración de las células in vivo 7. A pesar de su utilidad, estas proteínas tienen algunas desventajas en comparación con el tinte mediada por los métodos de etiquetado linaje. La más crucial es la dificultad que hemos encontrado en la obtención de 3-D de alta resolución durante fotoconversión de estas proteínas. En este sentido, tal vez la mejor combinación de resolución y facilidad de uso para el etiquetado de linaje en el pez cebra hace uso de jaulas con fluoresceína dextrano, un tinte fluorescente que se une a un grupo de enfriamiento que enmascara su fluorescencia 9. El medio de contraste puede ser "Uncaged" (lanzado desde el grupo de extinción) dentro de una célula específica mediante la luz ultravioleta de una lámpara de láser o de mercurio, lo que permite la visualización de la fluorescencia o la inmunodetección. A diferencia de los métodos de iontoforesis, fluoresceína enjaulados puede ser inyectado con aparatos de inyección estándar y uncaged con un microscopio de epifluorescencia equipado con un orificio 10. Además, los anticuerpos contra la fluoresceína detectar sólo la forma uncaged, y el epítopo sobrevive la fijación y 11. Por último, la fluoresceína enjaulados puede ser activado con muy alta resolución 3-D, sobre todo si la microscopia de dos fotones se emplea 12,13. Este protocolo describe un método de etiquetado linaje de fluoresceína enjaulados y uncaging láser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína se detecta de forma simultánea con otros epítopos, como las buenas prácticas agrarias, mediante el etiquetado con anticuerpos.

Protocol

1. Síntesis de la jaula con fluoresceína Dextran

  1. Mida 3,5 a 4 mg de aminodextrano y añadir en el tubo de color Invitrogen suministrado con 1 mg de CMNB-jaula SE fluoresceína. En nuestras manos esta relación da una carga promedio de ~ 2,5 moléculas de colorante por dextrano.
  2. Añadir 500 l de 0,1 M Na 2 B 4 O 7 buffer (borato de sodio) en el tubo.
  3. El tapón y mezclar por 30 segundos para disolver el aminodextrano fluoresceína y enjaulado.
  4. Vamos a reaccionar durante la noche en un mezclador vórtex.
  5. Desenrosque el cierre inferior de una columna de centrifugación Zeba y aflojar la tapa. Marca un punto en la columna con un rotulador. Colocar la columna en un tubo cónico de 15 ml.
  6. Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Use la columna inmediatamente después de la compactación.
  7. Colocar la columna compacta en una nueva de 15 ml tubo cónico.
  8. Piscina mezcla de reacción y traslado al centro de la cama columna de resina compacta. Reemplace la tapa.
  9. Centrifugar a 1000 xg durante 2 minutos con el punto frente al centro del rotor. Después de la vuelta, el eluyente y la parte superior de la columna será más o menos el mismo tono de color amarillo.
  10. Transferir el eluyente amarillo (~ 350 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  11. Liofilizar hasta sequedad en un speedvac. Cubrir el speedvac con papel de aluminio.
  12. Vuelva a suspender el resultado ~ 3.2 mg de espuma de color amarillo pálido en el agua a una concentración final de 1% w / v.
  13. Almacenar esta solución a -20 ° C en papel de aluminio cubierto de tubos. Es una buena idea alícuota de la solución de dextrano para prevenir la repetición de congelación-descongelación.

2. La inyección de fluoresceína Caged Dextran en embriones de pez cebra

  1. Diluir 1% w / v stock de jaulas 01:05 fluoresceína dextrano o 1:10 en KCl 0,2 M.
  2. Inyectar 0,5 - 1.0nL de la solución de fluoresceína enjaulados en la yema de un embrión de células etapa con una presión de inyección. Una vez inyectado, garras de embriones debe ser mantenido en la oscuridad a 28,5 ° C para reducir no específicos uncaging.
  3. Eliminar manualmente coriones a partir de embriones.
  4. Anestesiar a los embriones en el 4% tricaína.
  5. Los embriones se montará en el 0,8% de agarosa en 35mmx10mm placa de Petri, luego se cubre con agua de huevo.
  6. Equilibre agarosa derretida en el 50 del bloque de calor ° C durante al menos 15 minutos.
  7. Con una pipeta de vidrio, elaboración de un embrión en una cantidad mínima de agua y la liberan en la agarosa. Nota: Es importante que se enfríe el tubo de agarosa en la mano durante aproximadamente 30 segundos antes de colocar el embrión en el tubo para evitar matar al embrión.
  8. Pipeta el embrión de la trompa, junto con aproximadamente 50μL de agarosa y expulsar el contenido en el centro de la placa de Petri.
  9. Orientar rápidamente el embrión utilizando un hilo de plástico con las células que se uncaged hacia arriba. Nota: La agarosa se ​​enfrían rápidamente para ser precipitada con la orientación del embrión. Los embriones se pueden dañar si se manipula después de la agarosa se vuelve rígido.
  10. Deje que la agarosa para solidificar completamente (esto tarda unos minutos) y llenar el recipiente con dos tercios del agua de huevo contiene un 4% y 0,003% tricaína PTU.

3. Laser uncaging de fluoresceína Dextran

  1. El microscopio usado para uncaging debe tener un objetivo de inmersión en agua 40 veces.
  2. Utilizamos un Fotónica Instrumentos láser con la célula nm tinte 365 y el 70% / 30% se reparte espejo dicroico.
  3. Antes de uncaging, el láser se debe hacer parfocal con el objetivo y atenuada a la alimentación adecuada.
  4. Para enfocar el láser, colocar una lámina de vidrio reflejado en el objetivo y el enfoque del objetivo hasta que los arañazos en la diapositiva son visibles.
  5. Ajuste del atenuador de láser hasta que el láser puede producir un rasguño claramente visible en el espejo con un solo pulso.
  6. Ajustar el enfoque objetivo hacia arriba y abajo. Si el láser puede producir un cero cuando el objetivo está fuera de foco, ajuste el enfoque de láser de ¼ de vuelta hacia arriba o hacia abajo. Repita hasta que el láser puede rayar el espejo sólo cuando el objetivo se centra.
  7. Lugar montado embrión en el objetivo y se centran en el área que se uncaged.
  8. Para desenjaular, se centran en una célula de interés y el pulso es 10-20 veces menos 2-3 Hz.
  9. Después de uncaging, sin el embrión mediante el peeling de agarosa de distancia con unas pinzas y poniéndolas en agua que contienen huevo PTU 0,003%. Deje que se desarrollan los embriones en una caja opaca a la luz hasta que se fija.

4. Anticuerpo etiquetado y detección de Uncaged Dextran con fluoresceína

  1. Fix embriones en Ab fijador (4% de paraformaldehído, 0,3 CaCl 2, 8% de sacarosa, fosfato 1X buffer de pH de solución salina, 7.3) de dos a cuatro horas a temperatura ambiente (RT) o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Mantener los embriones en una caja de luz o un tubo estrecho envueltas en papel aluminio para todas las medidas de etiquetado.
  2. Retire el fijador y reemplazar con el 100% de MeOH, dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar MeOH y reemce con MeOH frescas 100%.
  3. Tienda en MeOH a -20 ° C durante al menos 30 minutos. Nota: Es posible almacenar en MeOH para un máximo de dos semanas antes de epítopos comienzan a degradarse.
  4. Rehidratar embriones con 5 lavados minutos a temperatura ambiente de 75% de fosfato MeOH/1X solución salina tamponada con Tween 20 al 0,1% (1X PBSTw), entonces 1XPBTw 50% MeOH/50%, entonces el 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
  5. Lavar tres veces durante 5 minutos en 1XPBSTw.
  6. Si los embriones son> 24 horas de vida, permiabilize embriones con 10 mg / ml de proteinasa K en 1XPBSTw. Permiabilization tiempo depende de la etapa. Cinco minutos en proteinasa K es suficiente si los embriones tienen entre 24 y 48 horas posteriores a la fecundación (HPF). Más tiempo puede ser necesario si las larvas de la tercera edad. Volver a fijar en Ab fijador durante 20 minutos a temperatura ambiente
  7. Lavar cinco veces durante 5 minutos en 1XPBSTw a temperatura ambiente.
  8. Incubar en la solución de bloqueo (1XPBS, 0,1% Triton X100, el 10% suero de oveja, 10% de albúmina de suero bovino, 1% de dimetilsulfóxido) durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
  9. Diluir anticuerpos primarios (anti-fluoresceína además de anticuerpos contra el tipo de célula-marcadores específicos) en solución de bloqueo.
  10. Embriones se incuban O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos primarios.
  11. Lavar cuatro veces durante 20 minutos en solución salina tamponada con 1XPhosphate Triton x100 0,1% (PBSTx) a temperatura ambiente.
  12. Diluir anticuerpos marcados con fluorescencia secundaria (por lo general 1:300) en solución de bloqueo.
  13. Incubar O / N a 4 ° C en una solución que contiene anticuerpos secundarios.
  14. Lavar cuatro veces durante 20 minutos en 1XPBSTx a temperatura ambiente.
  15. Embriones claro en 1XPBS 50% glycerol/50% por lo menos dos horas a temperatura ambiente, luego retire el glicerol / PBS mezcla y se añaden 100% de glicerol y se deja reposar O / N a 4 ° C.

5. Los resultados representativos:

Después de inmunomarcación, debe haber una zona enriquecida de la tinción de las células que se uncaged (Figure.1). No es raro ver una señal relativamente alta proporción de ruido en> el pez cebra de 48 horas de edad, debido a uncaging espontánea de la fluoresceína.

Figura 1
Figura 1. Etiquetado linaje de peces cebra complejo pineal. A las 24 HPF, una porción de la glándula pineal esbozo anterior, indica foxd3:. Expresión GFP, se uncaged utilizando pulsos de láser UV A) Por 48hpf, un grupo en el lado izquierdo de células llamadas parapineal (círculo rojo) ha surgido de la uncaged dominio (círculo blanco). B) Uncaged señal de fluoresceína se enriquece en el parapineal (círculo rojo) y el órgano pineal (círculo blanco).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Como se ha descrito, este protocolo ofrece un método de etiquetado linaje relativamente rápido en el pez cebra que se basa en las técnicas de uso de la microinyección, la microscopía e inmunofluorescencia. Hemos encontrado que el láser uncaging ser la manera más eficiente y rentable para desenjaular fluoresceína de forma localizada. Este método podría ser utilizado para etiquetar linaje con criterios de valoración experimental tan tarde como 4 dpf. Sin embargo, como se dividen las células, la concentración de jaula con fluoresceína por celda con el tiempo disminuye más allá de los niveles detectables. Además, ha habido informes de espontáneo, no específica uncaging de fluoresceína en larvas de pez cebra 11. Como la detección de tales, de fluoresceína uncaged es más eficaz en la etapa larval (48-72 HPF) o anterior.

Nuestro método preferido es uncaging por el uso de un láser pulsado de nitrógeno. Estos se utilizan para la ablación de células y experimentos son lo suficientemente precisos para desenjaular singe células o pequeños grupos de células 11-12. Sin embargo, uncaging también puede llevarse a cabo utilizando un microscopio confocal, dos fotones microscopios confocal se han utilizado para lograr uncaging muy precisa 12. En el otro extremo del espectro, si la precisión no es necesaria después de un láser es prescindible. Un microscopio de epifluorescencia equipado con un conjunto DAPI filtro se puede utilizar para desenjaular a través de un pequeño agujero 11.

Hemos encontrado que la detección de fluoresceína uncaged utilizando un anticuerpo primario y secundaria de anticuerpos fluorescentes que se emite en una longitud de onda roja o roja lejana (por ejemplo, Alexa 633) mejor se adapte a nuestras necesidades. Esto nos permite distinguir con fluoresceína uncaged de GFP expresada por un transgén (Figura 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Dan Carlin para ayudar en la toma de fluoresceína enjaulado. Además nos gustaría agradecer a las fuentes de financiación: Universidad de Vanderbilt Programa Escuela de Medicina de Subvención de Desarrollo de Capacitación de Biología de JAC, y NIH HD054534to JTG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CMNB-caged fluorescein SE Invitrogen C20050
Aminodextran, 10kDa Invitrogen D1860
Zeba desalt spin columns Pierce, Thermo Scientific 89889
goat anti-fluorescein antibody Invitrogen A11095
Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody Invitrogen A21082
35mmx10mm petri dishes BD Biosciences 351008
Upright compound microscope with 40x water immersion objective Leica Microsystems DM6000B
MicroPoint Manual Laser Illumination System Photonic Instruments
Phenylthiourea (PTU) Alfa Aesar L06690
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Proteinase K Roche Group 03115836991
Plastic thread Any Supplier
Agarose Research Products International Corp. A20090
SpeedVac Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant SPD131DDA
Vortexing mixer VWR international Vortex Genie 2
Pressure injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
  2. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
  3. Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
  4. Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. Suppl 2. 1-8 (1991).
  5. Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
  6. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
  7. Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
  8. Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
  9. Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 9th Edition, 707-711 (2002).
  10. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
  11. Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
  12. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  13. Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 05/25/2011. Citeable Link.

A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:

Ilya A. Shestopalov and James K. Chen

instead of:

Ilya Shestopalov and James Chen

Comments

1 Comment

  1. u did not wear gloves.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 24, 2011 - 4:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats