माउस रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के द्वारा अभिकर्मक Vivo में Electroporation

Neuroscience

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Summary

हम एक का प्रदर्शन

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Dhande, O. S., Crair, M. C. Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (50), e2678, doi:10.3791/2678 (2011).

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Abstract

लक्ष्यीकरण और midbrain के लिए RGC अनुमानों के शोधन के विकास के दौरान कैसे तंत्रिका कनेक्टिविटी के फार्म का सटीक पैटर्न के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय और शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. चूहों में, retinofugal अनुमानों एक स्थलाकृतिक तरीके और पार्श्व Geniculate न्यूक्लियस में आँख विशिष्ट परतों के फार्म thalamus और सुपीरियर Colliculus (अनुसूचित जाति) के (dLGN) में व्यवस्थित होते हैं. retinofugal अनुमानों के इन सटीक पैटर्न के विकास आम तौर पर RGCs के फ्लोरोसेंट रंजक और tracers के साथ 1-4 peroxidase हॉर्सरैडिश जैसे, आबादी लेबलिंग द्वारा अध्ययन किया गया है. हालांकि, इन तरीकों भी व्यक्तिगत RGC axonal कुंज आकारिकी में विकास परिवर्तन है कि retinotopic नक्शे गठन के आधार हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मोटे हैं. उन्होंने यह भी RGCs के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति नहीं है.

हाल ही में, electroporation चार्ज अणुओं के 5-11 रेटिना में प्रसव के लिए सटीक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्रदान करने के लिए एक कारगर तरीका बन गया है . वर्तमान रेटिना electroporation प्रोटोकॉल आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति नहीं है और प्रसव के बाद चूहों में RGCs की एक एकल या छोटे समूह के retinofugal अनुमानों की अनुरेखण. यह तर्क दिया है कि vivo electroporation में प्रसवोत्तर transfecting RGCs के बाद से लेबलिंग दक्षता बेहद कम है के लिए एक व्यवहार्य तरीका है और इसलिए नहीं है भ्रूण उम्र जब RGC progenitors 6 प्रसार और भेदभाव के दौर से गुजर रहे हैं पर लक्षित की आवश्यकता है.

इस वीडियो में हम जीन की लक्षित वितरण, shRNA, और murine postnatally RGCs फ्लोरोसेंट dextrans के लिए vivo electroporation प्रोटोकॉल में एक वर्णन . इस तकनीक एक प्रभावी, लागत तेजी से उम्मीदवार अक्षतंतु तर्क सहित तंत्रिका विकास के कई पहलुओं में शामिल जीनों के कुशल स्क्रीनिंग के लिए और अपेक्षाकृत आसान मंच प्रदान करता है, शाखाओं में बंटी, फाड़ना उत्थान, और सर्किट विकास के विभिन्न चरणों में synapse गठन. संक्षेप में हम यहाँ एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो आणविक संवेदी नक्शे विकास अंतर्निहित तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा वर्णन.

Protocol

1. Electroporation के लिए सेट उपकरण

  1. इलेक्ट्रोड: Dumont हम # 5 संदंश इलेक्ट्रोड के रूप में उपयोग के लिए संशोधित.
    1. अलग और अलग संदंश तोड़ने.
    2. प्रत्येक शूल के व्यापक अंत में एक तार मिलाप. तार संलग्न और इन्सुलेशन टेप के साथ prongs उजागर prongs की नोक के लगभग 25-30 मिमी छोड़ने लपेटें.
    3. संशोधित संदंश दो prongs के बीच किसी भी उपयुक्त प्लास्टिक (जैसे एक बटन) स्पेसर वसंत कार्रवाई प्रदान के साथ एक साथ वापस रखो.
  2. विद्युत उपकरण: हम एक बिजली electroporation और एक आस्टसीलस्कप ऑडियो और मॉनिटर के लिए वर्तमान दालों देने के लिए और वितरित किया जा रहा दालों की तरंग संख्या की पुष्टि के लिए उत्तेजक औधधि का उपयोग करें.
    1. संदंश के एक शूल से जो भी उत्तेजक औधधि के साथ श्रृंखला में जुड़ा हुआ है एक पैर पेडल करने के लिए तार कनेक्ट. पैर पेडल एक स्विच के रूप में कार्य करता है. जब उदास electroporation के लिए सर्किट पूर्ण.
    2. अन्य शूल से बिजली उत्तेजक औधधि के तार कनेक्ट.
    3. आस्टसीलस्कप और ऑडियो मॉनिटर करने के लिए उत्तेजक औधधि कनेक्ट.
  3. Micropipette और सुई लगानेवाला सेट अप: हम तेज खींच लिया गिलास pipettes और Nanoinject द्वितीय सुई लगानेवाला प्रणाली का उपयोग करने के लिए डाई या रेटिना में सीधे डीएनए समाधान की बहुत छोटी मात्रा इंजेक्षन.
    1. माउंट एक 3 अक्ष micromanipulator पर सुई लगानेवाला प्रणाली.
    2. एक लंबे शंकु और छोटे टिप के साथ कांच pipettes खींचो.
    3. खनिज तेल और सुई लगानेवाला के लिए सुरक्षित के साथ वापस खींचा विंदुक भरने (विवरण के लिए Nanoinect द्वितीय अनुदेश मैनुअल देखते हैं).
    4. तेज microdissecting कैंची का प्रयोग पिपेट की नोक में कटौती, एक छोटे से खोलने (~ 2-3 सुक्ष्ममापी) बनाने.
    5. विंदुक पिपेट की नोक के माध्यम से इंजेक्शन समाधान के वांछित राशि के साथ भरें. जब तक के रूप में टिप की अखंडता रखती है, यह एकाधिक इंजेक्शन और पशुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
      नोट: i) सुनिश्चित करें कि पर्याप्त इंजेक्शन समाधान ऐसी है कि backfilled खनिज तेल आंख में कभी नहीं अंतःक्षिप्त है सुझावों में भरी हुई है. ii) Nanoinject द्वितीय प्रणाली और इस वीडियो में विशिष्ट इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों का इस्तेमाल किया RGCs के सफल लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं. और अन्य आम stimulators के साथ picospritzer electroporation जैसे अन्य उपकरणों के साथ बनाया इंजेक्शन भी लेबल RGCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. RGC लेबल के लिए प्लाज्मिड समाधान

  1. RGCs के छोटे समूहों के लेबलिंग के लिए: हम सीएजी प्रमोटर (चिकन β-actin एक सीएमवी तत्काल जल्दी बढ़ाने के साथ प्रमोटर) के नियंत्रण के अधीन एक निर्माण एन्कोडिंग EGFP (~ 2-3 μg / μL) बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन ) का उपयोग करें. EGFP गैप-43 palmitoylation अनुक्रम (वृद्धि जुड़े प्रोटीन 43) सेल (mut4EGFP) झिल्ली 12 लक्ष्यीकरण के साथ टैग है . इस का निर्माण pCAG - gapEGFP के रूप में संदर्भित किया जाता है.
  2. एकल कक्ष लेबलिंग के लिए: हम दो constructs का एक संयोजन का उपयोग करें. प्रथम वेक्टर एक सीएजी प्रमोटर ड्राइविंग Cre recombinase (pCAG Cre, Addgene [कैम्ब्रिज, एमए] प्लाज्मिड 13,775) 13 और दूसरी वेक्टर floxed STOP EGFP (pCAG LNL - gapEGFP) को लक्षित झिल्ली द्वारा पीछा कैसेट होता है . pCAG-Cre (0.15-ng/μL ~) pCAG LNL gapEGFP (~ μgμL 1-2) से लगभग 1,000-10,000 गुना कम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है, कक्षों की एक छोटी संख्या को मजबूत EGFP अभिव्यक्ति सीमित (के आधार पर अपेक्षाकृत कम pCAG Cre) एकाग्रता.

3. रेटिना इंजेक्शन और electroporation प्रोटोकॉल

  1. प्रसव के बाद का दिन 0 P5 पिल्ले (P0) हाइपोथर्मिया द्वारा anesthetized हैं, जबकि P5 की तुलना में बड़े चूहों (4.28 मिलीग्राम / एमएल) ketamine, xylazine (0.82 मिलीग्राम / एमएल) के एक कॉकटेल के एक intraperitoneal इंजेक्शन (0.7 मिलीलीटर / किग्रा) के साथ anesthetized हैं , और (0.07mg/ml) acepromazine 14.
  2. सभी सर्जिकल उपकरणों और इलेक्ट्रोड एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में सुझावों जीवाणुरहित. इसके बाद दोनों बाँझ खारा पहले आंख के लिए थर्मल क्षति से बचने के उपयोग में ठंडा.
  3. विच्छेदन गुंजाइश और स्थिति सुई लगानेवाला के तहत प्लेस माउस.
  4. P14 (आंख खोलने से पहले) की तुलना में छोटी चूहों के लिए, शल्य चिकित्सा सूक्ष्म विदारक वसंत कैंची ख के साथ भविष्य पलक खोलने की पूरी लंबाई के साथ काटने से पलक खुला.
  5. नेत्रगोलक आंशिक रूप से धीरे आंख के आसपास संदंश के सुझावों के साथ दबाव लागू करने के द्वारा बहर .
  6. धीरे नेत्रगोलक के आसपास त्वचा pinching द्वारा जगह में नजर पकड़ो.
  7. Micromanipulator समायोजित और नेत्रगोलक के लिए करीब विंदुक ले आओ.
  8. प्रेस पैर पेडल, जो Nanoinject द्वितीय प्रणाली से जुड़ा है इंजेक्शन समाधान की कुछ बूँदें को निष्कासित करने और इस प्रकार सत्यापित करें कि विंदुक नहीं भरा हुआ है.
  9. एक नेत्रगोलक स्थिर हाथ के साथ, जैसे कि कांच विंदुक की नोक रेटिना वर्णक उपकला के माध्यम से pierces और रेटिना में प्रवेश करती है है micromanipulator चाल है.
  10. डेस इंजेक्षनired Nanoinject द्वितीय प्रणाली के लिए पैर पेडल दबाकर समाधान की राशि. उदाहरण के लिए, हम 2.3 4.6nL के एक इंजेक्शन बनाने एकल RGCs लेबल करने के लिए.
  11. विंदुक वापस लेना और ध्यान से इलेक्ट्रोड सुझावों सीधे और इंजेक्शन स्थल पर जगह उत्तेजक औधधि के लिए पैर पेडल दबाना सर्किट को पूरा करने और आंख electroporate. आम तौर पर हम 25V शक्ति, 50msec अवधि, 1sec अलग सेटिंग्स के साथ वर्ग दालों का उपयोग करें. 10 दालों (प्रत्येक polarity के 5 दालों) चूहों P4 से अधिक उम्र और 6 दालों (प्रत्येक polarity के तीन दालों) P0 के लिए P3 चूहों को लागू कर रहे हैं के लिए लागू कर रहे हैं.
  12. धीरे वापस नेत्रगोलक और सॉकेट में धक्का कटौती पलकें अधिक बाँझ नेत्र मरहम लागू.
  13. एक तापमान नियंत्रित गर्मी पैड पर और पर्याप्त rewarming और गतिशीलता सहित पूरी वसूली, पर रखें पशुओं, उनकी माँ के लिए जानवरों की वापसी.
  14. जानवरों को दर्द संकट, या गतिशीलता की हानि, असामान्य मुद्रा या दूल्हे के लिए विफलता जैसे बेचैनी, के किसी भी हस्ताक्षर के लिए हर 12 घंटे मॉनिटर. संज्ञाहरण, इंजेक्शन, और electroporation की बार - बार राउंड एक ही जानवर पर नहीं किया जा चाहिए.

4. नोट्स

  1. इंजेक्शन के इस वीडियो में वर्णित विधि एक 'अंधा इंजेक्शन है. यह संभव है और इंजेक्शन की राशि और स्थान कल्पना जब अल्बिनो चूहों और रंग का समाधान (DiI या तेजी से नीले रंग की मात्रा का पता लगाने के साथ प्लाज्मिड समाधान) के साथ काम कर रहे हैं. हालांकि, pigmented चूहों उपभेदों के साथ इंजेक्शन स्थान सीधे कल्पना नहीं हो सकता है और इसलिए यह मुश्किल है के लिए मौखिक रूप से वर्णन है कि क्या एक इरादा रेटिना स्थान तक पहुँच गया है या कैसे एक विंदुक दूर स्थानांतरित करने के लिए RGC परत विशेष रूप से लक्ष्य होना चाहिए कर सकते हैं. इसलिए, हम दृढ़ता से नए उपयोगकर्ताओं को सलाह देने के पहले अल्बिनो चूहों में DiI इंजेक्शन के साथ शुरू के बाद से इन इंजेक्शनों तुरंत रेटिना में visualized किया जा सकता है और रेटिना को RGC अनुमानों और मस्तिष्क की लेबलिंग के लिए इंजेक्शन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फोकल इंजेक्शन के लिए तैयार एन में 10% DiI, एन Dimethylformamide (100%). एक बार इस प्रक्रिया में महारत हासिल है उपयोगकर्ताओं को लगातार pigmented चूहों में स्पष्ट डीएनए प्लाज्मिड समाधान के साथ RGCs लक्ष्य करने में सक्षम होना चाहिए.
  2. इंजेक्शन के इस वीडियो में वर्णित विधि फोकल DiI इंजेक्शन बनाने के लिए कोशिकाओं की छोटी आबादी से 14 retinotopy अध्ययन (4.6nL लेबल एक कुछ सौ RGCS) और (Alexa555, 488 आदि) fluorophores संयुग्मित के साथ थोक लेबल RGCs लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हैजा विष सबयूनिट बी आँख विशिष्ट अलगाव का अध्ययन करने के लिए, # ऊपर 10 में electroporation कदम को छोड़कर. एक अधिक से अधिक 2-p14 किसी भी समाधान की तुलना में छोटी चूहों के लिए p14 और एक - 2uL से अधिक उम्र के चूहों के लिए 3uL कुल इंजेक्शन की मात्रा की सिफारिश की है.
  3. Pipettes खनिज तेल के साथ सुई लगानेवाला पर विंदुक बढ़ते और टिप तोड़ने से पहले backfilling द्वारा पीछा किया जा इंजेक्शन समाधान के साथ backfilled किया जा सकता है है. यह विशेष रूप से उपयोगी है जब उच्च एकाग्रता डीएनए (6ug/uL ~) समाधान है, जो सामान्य होते हैं बहुत चिपचिपा और मुश्किल पिपेट की नोक से लोड का उपयोग कर.
  4. यदि कांच विंदुक भरा हो जाता है, डाई समाधान (DiI) के लिए डीएनए समाधान और इथेनॉल (100%) के लिए पानी में भिगो एक कपास झाड़ू के साथ ध्यान से पोंछ विंदुक टिप.
  5. आंख में इंजेक्शन के बाद, नेत्र गोलक से विंदुक टिप वापस लेना और पैर फिर से इंजेक्षन पेडल दबाएँ. यह पुष्टि करने के लिए कि टिप इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान प्राप्त नहीं भरा था. यदि कोई समाधान नहीं तिरस्कृत है, यह काफी संभावना है कि इंजेक्शन सफल नहीं था. बहरहाल, यह एक निरपेक्ष संकेत है कि इंजेक्शन सफल नहीं था के रूप में नहीं किया जा लिया जाना चाहिए. experimenter एक ही आंख फिर इंजेक्षन यदि एकाधिक इंजेक्शन साइटों और कक्षों की बड़ी संख्या की लेबलिंग वांछित हो सकता है.
  6. एकल RGCs लेबलिंग के लिए, इंजेक्शन Nanoinject नियंत्रण बॉक्स पर धीमी गति सेट करने के लिए. यह आगे रेटिना में इंजेक्शन के रूप में प्रणाली इस सेटिंग पर अधिक समय लेता है समाधान बांटना जबकि एक साथ कांच pipettes नेत्रगोलक की नोक से किया जा रहा है जल्दी से मुकर समाधान की राशि कम कर देता है.
  7. प्रसव के बाद दिन के electroporation 0 से 3 चूहों (P0 P3 के लिए) अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता के बाद से यह बहुत आसान है आँख क्षति (इस वसूली के कुछ दिनों के बाद स्पष्ट हो जाता है, जब आँख प्रदर्शन सामान्य से छोटा है). दालों और वोल्टेज लागू की संख्या को कम जल्दी नवजात चूहों के लिए सलाह दी जाती है. P4 के बाद, आंखों और अधिक electroporation से नुकसान लचीला कर रहे हैं.
  8. (GapEGFP ', 12) EGFP या आरएफपी के हमारे अनुभव झिल्ली लक्षित संस्करणों में अभी तक मस्तिष्क को retinofugal अनुमानों की जांच के लिए असंशोधित GFP बेहतर कर रहे हैं. हालांकि, pCAG - tdTomato, जो एक झिल्ली लक्ष्यीकरण संशोधन का अभाव भी अच्छी तरह से काम करता है (चित्रा 1E). इसके अलावा, dextran संयुग्मित फ्लोरोसेंट रंजक भी लेबल electroporation प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित का उपयोग कर RGCs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. आमतौर पर, 10 इंजेक्शन के 9 लेबल RGCs सीसा, दोहरी प्लाज्मिड दृष्टिकोण के साथ इंजेक्शन के हालांकि केवल 15% के बारे में होगासिर्फ एक ही RGC लेबल किया जा रहा में परिणाम. सफल मामलों की संख्या कई स्थानों में एक आंख में डीएनए इंजेक्शन द्वारा या प्रत्येक आंख में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग plasmids इंजेक्शन द्वारा बढ़ाया जा सकता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

RGC लेबलिंग सभी उम्र में मनाया गया, P2 से P25 को लेकर RGCs में 24hrs द्वारा electroporation बाद EGFP लेबलिंग के साथ अभिव्यक्ति और अभिकर्मक के बाद कम से कम तीन सप्ताह के लिए बनाए रखा.

Fluorescently लेबल (चित्रा 1 ए, बी) dendrites और एकल RGCs की axonal arbors (चित्रा 1F) स्पष्ट रूप से कल्पना और खंगाला जा सकता है.

RGCs के अलावा, इस तकनीक के लिए अन्य क्षैतिज कोशिकाओं, द्विध्रुवी कोशिकाओं और विभिन्न amacrine सेल उपप्रकारों (चित्रा 1C) जैसे रेटिना सेल प्रकार लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

इस विधि दृश्य नक्शे के रूप में अनुसूचित जाति (चित्रा 1E) में सामान्य retinotopy द्वारा प्रदर्शन शोधन के सामान्य समय कोर्स के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.

सभी उम्र में, में मामलों के बारे में 90%, pCAG - gapEGFP की एक छोटी मात्रा इंजेक्शन (~ 2.3-4.6nL) कुछ RGCs (चित्रा 1D) में अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व किया.

PCAG Cre और pCAG - LNL - gapEGFP जानवर प्रति संयोजन plasmids का एक इंजेक्शन, एकल रेटिना न्यूरॉन लेबलिंग RGCs (चित्रा 1 ए, बी, डी) और amacrine जैसे अन्य प्रकार की कोशिकाओं सहित करने के लिए नेतृत्व का उपयोग कर परीक्षणों के लगभग 15% में कोशिकाओं (चित्रा 1C).

चित्रा 1
चित्रा 1 - ए, बी उदाहरण के EGFP प्रसवोत्तर 14 दिन (p14) पर एक फ्लैट माउंट रेटिना में एकल रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (तीर सिर अक्षतंतु की ओर इशारा करते हुए) लेबल एकल starburst amacrine सेल के P8 पर सी. डी उदाहरण. EGFP लेबल और p14 पर सही नज़र में. ई. पृष्ठीय और उदर RGCs एक फ्लैट माउंट रेटिना में RGCs amacrine कोशिकाओं सहित रेटिना न्यूरॉन्स की एक क्लस्टर. electroporated थे और EGFP और बाईं आंख में लौकिक और उदर RGCs के साथ लेबल रहे थे electroplated और P1 पर tdTomato के साथ लेबल. लक्ष्य क्षेत्रों (तारांकनों) लेबल RGCs द्वारा गठित P9 पर अपने topographically अनुसूचित जाति में सही स्थान (पूरे माउंट, सफेद रूपरेखा) में देखा जा सकता है एक एकल में RGC कुंज (2-D प्रक्षेपण) लेबल EGFP एफ उदाहरण. अनुसूचित जाति के एक बाण के समान (250 सुक्ष्ममापी मोटी) खंड (बिंदीदार रेखा). स्पष्टता के लिए, में छवियों (डी) और (एफ) परिवर्तित कर दिया गया है ग्रेस्केल और औंधा. स्केल (सुक्ष्ममापी सलाखों): (क) - (डी), (एफ): 100 (ई): 500

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Discussion

इस वीडियो में हम vivo electroporation प्रोटोकॉल में एक दिखाना है कि डीएनए फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग constructs के साथ प्रसव के बाद चूहों में रेटिना न्यूरॉन्स की एकल या छोटे समूहों के लेबलिंग में परिणाम है . Fluorescently लेबल dLGN और अनुसूचित जाति के लिए RGC अनुमानों के छोटे समूहों के समान प्रक्षेपण पैटर्न reproduced रूप में पिछले अध्ययनों lipophilic रंगों के साथ RGC लेबलिंग का उपयोग कर, यह दर्शाता है कि electroporation सामान्य RGC अक्षतंतु कुंज शोधन के साथ हस्तक्षेप नहीं किया. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है दोनों एकल और RGCs के समूहों के विभिन्न माउस मॉडल में सामान्य और बाधित दृश्य नक्शे के साथ के स्तर पर retinotopic नक्शे का विश्लेषण.

हमारे परिणाम दिखाना है कि प्रसव के बाद रेटिना में विभेदित रेटिना न्यूरॉन्स मज़बूती से उपयोग vivo electroporation में ट्रांसफ़ेक्ट कर सकते हैं . vivo electroporation प्रोटोकॉल में प्रसवोत्तर यहाँ वर्णित एक साथ और एक spatially और अस्थायी प्रतिबंधित तरीके RGCs के आनुवंशिक हेरफेर लेबलिंग के लिए अनुमति देता है. हम plasmids एन्कोडिंग Cre recombinase और फ्लोरोसेंट floxed STOP अनुक्रम द्वारा पहले संवाददाता का एक संयोजन का उपयोग रेटिना न्यूरॉन्स की लेबलिंग प्रदर्शित करता है. अनुरूप एकल न्यूरॉन अभिकर्मक बेहद कम Cre प्लाज्मिड प्लाज्मिड रिपोर्टर के सापेक्ष एकाग्रता का उपयोग करके हासिल की है. Utero electroporation में की तुलना में, इस विधि का कम आक्रामक है और जल्दी अक्षतंतु मार्गदर्शन ऑप्टिक chiasm पर पार के रूप में इस तरह की घटनाओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. इसके अलावा, वायरल दृष्टिकोण के सापेक्ष, यह मजबूत जीन की अभिव्यक्ति के लिए कम समय की आवश्यकता है और कम विषाक्त है. इस उपकरण के सेलुलर और आणविक तंत्र और misexpression के माध्यम से सकल संरचनात्मक और synaptic स्तर पर दोनों या उम्मीदवार जीनों के नीचे दस्तक retinofugal अनुमानों के शोधन और परिपक्वता mediating की जांच के लिए एक कुशल और तेजी से मतलब vivo में लक्ष्यीकरण RGCs में एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ भी प्रदान करता है. vivo में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दो photon RGC अक्षतंतु गतिशीलता और उनके शारीरिक गुण इमेजिंग. सारांश में, आनुवंशिक लक्ष्य और vivo में RGCs कल्पना करने की क्षमता postnatally आगे मदद सेलुलर और आणविक तंत्र माउस दृश्य प्रणाली में सर्किट विकास शासी स्पष्ट होगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

pCAG - gapEGFP प्लाज्मिड डॉ. एस McConnell (स्टैनफोर्ड, CA) से एक उपहार था. प्लाज्मिड pCAG - tdTomato डॉ. एम. पेड़ काटने वाला (बर्कले, CA) से एक उपहार था. हम दो प्लाज्मिड एकल कक्ष लेबलिंग और दो प्लाज्मिड तकनीकी सहायता के लिए Cre / loxP पायलट अध्ययन और Crair प्रयोगशाला के सदस्यों में रणनीति मान्य करने के लिए ऐनी Schohl (मॉन्ट्रियल, QC) के लिए एक रणनीति के उपयोग का सुझाव के लिए धन्यवाद डॉ. एडवर्ड Ruthazer. R01 (एमसी) MH62639, एनआईएच EY015788 R01 (एमसी) और NIH p30 EY000785 (एमसी) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Electrical Stimulator Grass Technologies Model S4
Oscilloscope Agilent Technologies Model 54621A
Audio monitor Grass Technologies Model AM8B
Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Vannas Scissors a World Precision Instruments, Inc. 14003
Micro Scissors b Ted Pella, Inc. 1347
Dumont AA Forceps c Fine Science Tools 11210-20
Nanoinject II System Drummond Scientific 3-000-204
Glass Pipettes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Foot pedal Drummond Scientific 3-000-026
Mineral Oil Sigma-Aldrich M3516
DiI Invitrogen D-383
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551

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References

  1. Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
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Comments

6 Comments

  1. What type of solder do you recommend?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 29, 2011 - 7:28 PM
  2. This is the solder we used: Rosin Core Solder from Kester (Model 81-4000-0000)

    Reply
    Posted by: Onkar D.
    May 2, 2011 - 11:04 PM
  3. Thanks! I have tried soldiering our inox alloy forceps using a rosin core solder but it has been hard to get the solder to stick. I will give it another shot.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 2, 2011 - 11:14 PM
  4. We sometimes apply superglue on top of the solder to make it stick.

    Reply
    Posted by: Onkar D.
    May 2, 2011 - 11:31 PM
  5. When soldering stainless steel you need to use specific soldering flux that chemically removes oxides from metal surfaces to enable the flow of filler metals on base metals.

    Typically I use a high acid zinc chloride flux.

    I would dip both metal tips in the flux, warm the flux on the metals with the soldering iron, put the metals together, then hot solder the two ends together.

    Super glue sometimes works if the metal is etched and if the superglue base is made from arachidonic acid.
    Good luck!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 10:14 AM
  6. Thank you for your JOVE article, very interesting and helpful. Our goal is a little different. We would like to get plasmid expression in as many RGCs as possible, and would like to do the electroporation in adults (rats or mice) if possible. Would you have any suggestions for achieving this goal? Thanks, Don

    Reply
    Posted by: Don Z.
    October 7, 2012 - 11:21 AM

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