で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

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マイクロアレイ解析はで遺伝子発現プロファイルを決定するために実施された

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Guthmueller, K. L., Yoder, M. L., Holgado, A. M. Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR. J. Vis. Exp. (53), e2777, doi:10.3791/2777 (2011).

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Abstract

シナプスは、標的細胞における細胞シグナル伝達とシナプス端末の前シナプスのアクティブゾーンで構成されています。化学シナプスの場合には、メッセージは、シナプス後細胞上の受容体がシナプス前終末から放出されると、受信した神経伝達物質によって行われている。 線虫(Caenorhabditis elegans)における当社のこれまでの研究では、VSM - 1はマイナスのエキソサイトーシスを調節することが示されている。また、VSM - 1変異体におけるシナプスの解析ではその完全に機能するVSM - 1は増加しているシナプスの接続性を欠いている動物。これらの予備調査結果に基づいて、我々は仮説を立てたそのC.虫 VSM - 1は、シナプス形成において重要な役割を果たす可能性があります。この仮説をテストするには、二重標識マイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現プロファイルを決定した。最初に、全RNAを単離し、逆にcDNAに転写し、DNAマイクロアレイにハイブリダイズした。その後、蛍光プローブのハイブリダイゼーションのインシリコの解析では、強化されたシナプス形成と変異の主要な精子のタンパク質ファミリー(MSP)のメンバーのためにコードする多くの遺伝子の有意な誘導が明らかになった。 MSPはC言語で精子の主要なコンポーネントです。 と線虫の卵成熟と排卵を知らせるために表示されます。ショウジョウバエでは、チャイと同僚1は MSPのような分子は神経筋接合部でシナプスブートンの数とサイズを調節することが明らかに。また、津田と同僚によって行われる分析は、2 MSPSがエペソの受容体とトリガーの受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達カスケードのためのリガンドとして作用する可能性が示唆された。最後に、リアルタイムPCR解析には、MSP - 32をコードする遺伝子は、VSM - 1(ok1468)変異体では誘導されることを確証した。一緒になって、私たちの研究室で実施した調査では、VSM - 1変異体は、MSP - 32シグナル伝達によって媒介される可能性がシナプス密度の大幅な増加を、持っていることを示している。

Protocol

1。トータルRNAの分離

  1. 健康な同期線虫は、プレートあたり2〜3 mlを用いて、室温M9培地でプレートを洗浄することにより収穫した。再懸濁した線虫は、4分間4℃で遠心分離、3200 gで15 mlコニカルチューブとペレットダウンに移した。収穫された線虫は、0.1M NaClを7mlのと氷冷60パーセントw / vのスクロース7mlのでペレットを再懸濁することによりフロート細菌から洗浄した。再懸濁した混合物をショ糖溶液を介して、4分間4℃で3200グラムで混合物を遠心分離後に収集されたスイムアップ、15分、きれいな線虫を氷上でインキュベートした。無菌ワームは、滅菌ピペットを用いて新しいコニカルチューブに移し、4℃で3200グラムの遠心分離℃で2分間に続いて、最大15ミリリットルのRNaseフリー水で2回洗浄した。きれいな疎圧縮ペレットを1.5 mlのマイクロチューブに移し、30秒間の最大速度(約10,000 g)で遠心分離した。最後に、ほとんどのRNaseフリー水を除去し、RNAlaterでの10ボリュームは、ペレットに添加し、4℃で保存続行する準備が整うまで。
  2. トータルRNAサンプルを調製するために、収穫された線虫は、4分間最大速度(約10,000 g)で遠心分離され、RNAlaterでは廃棄されました。その後、分子粉砕樹脂(バイオサイエンスG)のピンチをペレットに添加し、混合物を液体窒素を用いて凍結させた。冷凍ワームの懸濁液を乳棒と液体窒素で微粉末に粉砕した粉体の寒さを保つために、必要に応じて追加されました。粉砕後、抽出物を氷上で5分間維持した後、700μlのRLT / BME(RLTの比率100容量:BMEの1体積)と混合(キアゲン社)および472μlの100%エタノール。
  3. トータルRNAをRNeasyミニキット(キアゲン)を用いて製造者の推奨プロトコルに従って単離された。単離されたRNAの最終容量は、生物学的サンプル当たり60μlであった。

2。 DNAの消化やRNAのクリーンアップ

  1. 潜在的にゲノムDNAに汚染された全RNAの50μgをDNアーゼI(キアゲン社)で消化した。 0.1 UのDNase /1μgのRNAと1XバッファーRDPを含むダイジェストの反応を10分間室温でインキュベートした。
  2. RNAサンプルは、私はクリーンアップしたRNeasyアプライクリーンアップキット(Qiagen)を使用したDNaseで処理した。メーカーが推奨するプロトコルが続いていたし、60μlの最終的な溶出量が得られた。

3。 RNAの定性および定量分析

  1. RNAの濃度は、UV分光光度計の光度計(Thermo Scientific社)を用いて測定した。
  2. RNAサンプルの完全性は、アガロース電気泳動を用いて評価した。簡単に言えば、RNaseフリーのアガロースゲル1%1X北部最大グリシンゲルプレップ/ランニングバッファー(Ambion社)、1%のRNaseフリーアガロースLE(Ambion社)および0.5μg/ mlのエチジウムブロマイドを用いて調製した。ゲルが重合されたが、RNAサンプルは50でGlyoxylサンプルローディング色素/サンプルとインキュベートサンプルの5μlを添加することによりglyoxylatedいた℃で30分間。 RNAラダーはまたglyoxylatedとサイズの比較のためにロードされました。

4。 cDNA合成

  1. 各合成反応の場合は、8.4μgのRNAサンプルは、1μlのRTプライマー(1ピコモル/μL)と混合した。 1サンプルは(WTまたは変異体)Cy5の取り込みのRTプライマーを受けて、他のサンプルは、Cy3のキャプチャのRTプライマーを(配列350標識 - 検出キット、Genisphereに付属)を受け取った。サンプルの混合物は10分間75から80℃で加熱し、2〜3分間氷に移した。
  2. RNAサンプルをインキュベート、マスターミックス(Genisphere)は以下のように調製している間:各RT反応のために、我々は、RTの4μlの5倍の反応バッファー、1μlのdNTPを(10mMの各のdATP、dCTPを、dGTPを、dTTPの)、1μlのSuperaseを組み合わせるインRNase阻害剤(配列350標識 - 検出キット、Genisphereに付属)、1μlのRT酵素(200 U /μL)。最後に、マスターミックスの7μlを穏やかに混合、各RNAサンプルに加え(ボルテックスは使用しないでください)​​と42で2時間インキュベートした℃を

5。 RNAの分解およびcDNAサンプルの精製

  1. cDNA合成は、3.5μlの0.5M NaOH/50mM EDTA(最終濃度)を追加し、15分間65℃でインキュベートすることにより停止されました。その後、反応を850 mMトリス塩酸の最終濃度になるように1Mトリス- HCl、pH 8.0を用いて中和した。最後に、WTと変異体のcDN​​Aは、1つのマイクロ遠心チューブに結合された。空のチューブを73μlの1 × TEバッファーでリンスし、cDNAを含むチューブに添加し、結合されたcDNAのチューブの最終容量は130μlであった。
  2. 混合cDNAは、以下の製造業者のプロトコールとQIAクイックPCR精製キット(Qiagen)を精製した。 cDNAの精製の結果溶出量は60μlであった。

6。最初のマイクロアレイハイブリダイゼーション

  1. C. elegansのマイクロアレイがGCAT(アクティブ教育のためのゲノムコンソーシアム)を通じて得られたスライドは、でブロックされたは0.1 mg / 3X SSCのMLサケ精子DNA、0.1%SDSを用いて1時間室温。ブロックされたスライドはddH2Oに浸漬してリンスし、底にキムワイプで50 mlコニカルチューブに2,000 gで1分間遠心分離することによりスピン乾燥させた。
  2. その後、2Xホルムアミドベースのハイブリダイゼーションバッファー(Genisphereは)55℃でインキュベートした10分間を、結晶を溶解するために十分に混合し、10,000 gで1分間遠心次に、25μlのcDNAサンプルを穏やかに2Xホルムアミドベースのハイブリダイゼーションバッファー25μlでフリックで混合した。希釈したcDNAサンプルは15秒間のフラッシュスピンによって収集され、80℃で10分間インキュベートした。
  3. 最後に、cDNAを慎重にスライドを触れることなく全体の加熱のcDNAサンプルをピペッティングすることにより、スライドをマイクロアレイにハイブリダイズした。サンプルは、一様に穏やかに注射針を用いてカバースリップを下げることによって、マイクロアレイ上に広げた。カバースリップが完全に低下される前に、カバースリップは、後ろにプルアップし、再度針を下げ、所定の位置に静かに落下させ、気泡の形成を最小限に抑えていた。セットアップ最初のハイブリダイゼーションは、スライドの下のddH 2 O50μlを50 mlコニカルチューブに水平にスライドを置くことによって頂点に達し、37℃で一晩インキュベートした。

7。第二のハイブリダイゼーション

  1. ハイブリダイズしたマイクロアレイは、様々な温度で2 × SSCで洗浄した。最初に、マイクロアレイスライドは、室温で2 × SSCおよび0.2%SDSを含むコニカルチューブに移し、カバースリップを削除するには、軽く酔っぱらった。その後、マイクロアレイスライドは、55℃2 × SSCおよび0.2%SDSを含むコニカルチューブに移し、そして15分間℃〜55でインキュベートした。次に、スライドを2 × SSCに転送し、室温で15分間インキュベートし、定期的に穏やかに震えていた。最後に、スライドは0.2 × SSCに移管され、定期的に穏やかに振とうしながら、室温で15分間インキュベートした。洗浄したスライドは、底にキムワイプで50 mlコニカルチューブにスライドダウンのラベル面を導入することによりスピン乾燥させ、2,000 gで1分間遠心分離した
  2. 次に、第二のハイブリダイゼーション混合物は、2Xホルムアミドベースのハイブリダイゼーションバッファー(Genisphere)を用いて調製した。ハイブリダイゼーションバッファーは、10分間55℃でインキュベートし、10,000 gで1分間遠心分離した蛍光試薬(Cy3およびCy5)キャプチャおよびアンチフェード試薬は、室温で解凍し、退色から試薬を保護するために箔で覆われていた。以下のハイブリダイゼーションのステップは、最小化、光曝露に暗闇の中で行った。 2Xホルムアミドベースのハイブリダイゼーションバッファー150μlのは、抗フェード処理ハイブリダイゼーション混合物を作るために1.5μlの抗フェード試薬と混合した。
  3. Cy3とCy5を3秒間撹拌し、15秒間遠心分離された試薬、10,000 gをキャプチャ第二のハイブリダイゼーション混合物を75μlの抗フェード処理ハイブリダイゼーションミックス、60μlのヌクレアーゼフリー水、7.5μlのCy3で捕獲試薬、および7.5μlのCy5と捕獲試薬を組み合わせて作製した。第二のハイブリダイゼーションミックスは℃、加熱された混合物の50μlを、乾燥/洗浄したマイクロアレイスライド上に非常に注意深くピペットで75℃10分間インキュベートした。一様にマイクロアレイにサンプルを広めるために、カバースリップを静かに注射針を用いて低下した。カバースリップが完全に低下される前に、カバースリップは、後ろにプルアップし、再度針を下げ、所定の位置に静かに落下させ、気泡の形成を最小限に抑えていた。マイクロアレイスライドのハイブリダイズする箔とのddH 2 O50μlので覆われて50 mLコニカルチューブに水平に置かれた湿気の多い部屋を作成するスライドの下に追加されました。第二のハイブリダイゼーションは、2〜5時間、37℃でインキュベートした。
  4. 第二ハイブリダイズマイクロアレイは暗い使用して室温の2 × SSC、0.2%SDS、1mMのDTTで洗浄し、カバースリップを削除するには、軽く酔っぱらったした。その後、マイクロアレイは55℃で2 × SSC、0.2%SDS、1mMのDTTを含む覆わコニカルチューブに移し、55℃で15分間インキュベートした。次に、スライドが定期的に静かに揺れ、、2X SSCを含む覆われた円錐管に移し、1mMのDTT、室温で15分間インキュベートした。最後に、スライドは、定期的に静かに揺れ、0.2 × SSC、1 mMのDTTに移し、そして15分間室温でインキュベートした。マイクロアレイスライドは、1分、2000グラム、底にキムワイプで覆われて50 mLコニカルチューブにスライドラベル面を下にのために遠心分離することによって乾燥させた。乾燥したマイクロアレイスライドは、デービッドソン大学でGenePixパーソナルスキャナのモデル4100Aを用いてスキャンした。

8。マイクロアレイ解析

  1. スキャン後に得られた画像は、ローリーハイアと彼女の学部学生のデービッドソン大学で開発MAGICToolソフトウェアを用いて分析した。簡単に言えば、"プロジェクト"タブの下に、"新規プロジェクト"が作成され、保存されています。下の"発現プロファイルをビルド"タブ、"イメージのロードペア"を選択したと赤のイメージファイル(_635.TIF)"赤"としてアップロードされ、緑のイメージファイル(_532.tif)が"グリーン"としてアップロードされました。その後、"ビルドの発現プロファイル"タブと"ロード遺伝子リスト"、Cを使用してGCATのウェブサイトから得られた線虫の遺伝子のリストのファイルがアップロードされました。
  2. マイクロアレイのイメージは、"ビルド発現プロファイル"タブおよび"作成/編集グリッド"オプションを使用してアドレス指定し、グリッドれました。 "グリッド設定"ダイアログボックスがグリッド、"22行"と各グリッドのための"22列"の数については"48"を使用して編集した、スポットは"上から下へ""左から右へ、"番号付けと。個々のスポットが容易に識別されたまでは"パーセントのコントラストの変更は、"増加し、グリッド上でズームされた。グリッドは、最初に左側のパネルで"セットトップ左スポット"を選択して作成されました。その後、左上の点、右上のスポットと下の行の中央には"グリッド1"をクリックした。このグリッド化手順は、右へ、上から下へ、左に進む、48グリッドのそれぞれについて繰り返されました。グリッド化が完了したときに、現在のグリッドは""として、現在のグリッドを保​​存する"ファイル"で保存した。グリッドが正常に保存されたときに"完了"タブが選択されまし​​た。
  3. 分析から任意の無関係なスポットを除去するために、"ビルド発現プロファイル"タブが開かれました。下に"アドレス指定グリッディング"オプション"フラグ付けスポット"が選ばれました。縞入りの斑点やバックグラウンドの蛍光は、フラグを付けて"ファイルタブ"下"として現在のフラグを保存"を選択して保存されていた。
  4. フラグが付いたファイルは、"発現プロファイルをビルド"タブを使用し、選択肢のセグメンテーションの方法として"固定半径"を選択してセグメント化された。半径は、希望のサイズに設定され、"更新データ"がクリックされました。我々は上から下にスクロールして左から右へと一度"発現プロファイルを作成する"にチェック(黄色の四角)の円が格子状の領域内に留まることを確認するに選ばれました。
  5. フラグの後に残ったのスポットの各々のための緑の蛍光比:セグメンテーションの間に、ソフトウェアは赤を計算する。 "式"タブを使用して、""選択された変換"のデータを操作する"。 "データ変換"ダイアログボックスが"logbをは(X)"オプションを、aとb = 2が入力された場所現れた。 "ワーキング式のファイルは、""式"タブから探求された。野生型ではCy3標識(緑)キャプチャシーケンスを受信し、変異体は、Cy5と(赤)キャプチャシーケンスを受信する実験では、対数変換比の値は、抑圧する遺伝子を誘導し、負された遺伝子陽性であった。
  6. 最後に、指定された因子によって誘導または抑制遺伝子は、"式"タブの下に"エクスプローラ"を選択分析した。 "探索"ダイアログボックスで、"<X(抑制遺伝子の負の数)最小値"とする遺伝子に設定されていた"最大値> X(誘導性遺伝子のための正の数)"または"遺伝子一致条件を検索する"の#5で説明したように実験。折り畳み式の式は、'x'は選択基準に入力された数値の値です、2倍に等しい値でした。

9。 cDNA合成及びリアルタイムPCR

  1. 前述のようにtotal RNAを抽出した。単離されたRNAの質と量が決定された後、cDNAをiScript cDNA合成キット(バイオラッド)、野生型および変異体、および、メーカー推奨のプロトコルから分離された500 ng /μlにトータルRNAを用いて合成した。
  2. リアルタイムPCR反応はiQ SYBRグリーンスーパーミックス(BioRad社)、100から500ナノモルの遺伝子特異的プライマー(表1)と前のステップで生成さ4μlのcDNAを用いて、設置された。 10μlの反応はサーマルサイクラーCFX96リアルタイムシステム(BioRad)を用いて実行されました。
  3. クラーは、最初の95℃に加熱した3分間。これは、5秒、95℃でのステップと58℃30秒間続いた。このループは40回の合計を完了し、0.5度の勾配を持つ65〜95℃の融解曲線も挿入されました。 ΔΔCTの値は、対照として3つのハウスキーピング遺伝子(ACT - 1、CDC - 42、およびPMP - 3)を用いて計算した。
GENE フォワードプライマー リバースプライマー
GST - 5 CTGCTCCATTCGGACAACTT TCCGTTGAGCTTGAACTCAC
GST - 9 GGAAGACAACTGGCACAATC ACCGAGAGCATCAACTTGAG
kcnl - 1 TACGCTCGGCATGTGTTGTATC CCAATCATCGGCTCCACTATCT
KSR - 2 CGAACTGCTGCTGGAATGCT GTGCTGCGTCTCTTCTGCTT
イム- 9 CTCATCGAGTGGCTCAATCT CACCTTGCTCCATCTTCAAC
LPR - 6 CAGCAGTCACTTCTGTTCAC TCTCCAATAGCGGTACTCC
MES - 6 TTGTTCCGTTGGCTCACGTACAG CGACAGACGCAGATACACGATCA
MSP - 32 GCCGCACAGGTATGATCCAG ATCCAATACGGCGAGCCGAG
MSP - 142 GATCCACCATGTGGAGTTCT GATTCTTGCGACGGACCATA
MSP - 38 GCCTTCGGACAAGAGGATACC CCATACCGTCTCCTTGGAACC
MSP - 45 TCACCGTTGAGTGGACCAAT ACGAACCAACCGTCTCCTT
MSP - 49 CGACGACAAGCACACCTACCACATCAA TCGAGGACTCCACATGGTGGATCAACT
MSP - 56 CGAAGATCGTCTTCAATGCGCCATAC TCCACATGGTGGATCAACTCCAAGTC

表1。リアルタイムPCR用のプライマー配列を正逆

10。代表的な結果:

RNAの単離と解析

シナプス部位でのアクティブなゾーンの前駆体の小胞の融合は、シナプス形成(3)中に必須のステップです。 VSM - 1は、最​​近同定されたV - SNAREマスタータンパク質は、未決定のメカニズム(4、そして私たちの未発表作品)で(図1を参照)線虫における酵母とシナプス形成で小胞融合を阻害するために提案された。よりよいVSM - 1線虫における規制とシナプス形成のフィールドにいくつかの光をもたらすの根底にある分子経路を理解するために、我々はゲノムワイドスクリーンを始め、主要な精子のタンパク質遺伝子(MSP)が完全に機能するVSM - 1の非存在下で誘導されることが判明。

C.VSM - 1(ok1468)変異株では誘導性遺伝子を調査するelegansは 、我々は、マイクロアレイ遺伝子解析を行った。これは、野生型とVSM - 1変異株から単離された転写産物をテストし、彼らの富化を決定することによって行われていた。具体的には、まず同期L4とL3野生型とVSM - 1変異体の幼虫線虫から全RNAを単離した。その後、我々は、DNase Iで得られた全RNAを治療し、アガロースゲル電気泳動を用いて抽出したRNAの品質を調べた。図2に示されている実験では、ラダーは標準のために塩基対の数を表現するために最初のレーンで使用されていました。野生型のサンプルは前処理とDNaseで後処理は、私はレーン2および4にロードされ、VSM - 1変異体の試料前処理とIはそれぞれ、レーン3および5でロードされたDNaseでポスト処理した。 RNAゲル電気泳動の分析は、良い品質のままとされていることを野生型とVSM - 1変異体RNAサンプルを示した。これは、リボソームRNAの2つのサブユニットを表す2つのバンドを観察することによって決定した。

マイクロアレイハイブリダイゼーション

RNAの品質が決定された後は、我々はcDNA合成を進めた。そのために、我々は、mRNAを逆転写し、尾にキャプチャシーケンスを追加しました。 Cy3とCy5のキャプチャ配列を含む生成したcDNAは、スライドをマイクロアレイにハイブリダイズし、スキャンのためにオフに送信されました。マイクロアレイのイメージは、ローリーハイアと彼女の学部学生がデービッドソン大学で開発MAGICToolと呼ばれるオープンソースのコンピュータのソフトウェアプログラムを締結した。このソフトウェアを使用して、我々は、Cy3とCy5の画像を重ね、グリッドマイクロアレイ、および蛍光プロファイル(図3を参照)を分析。一度グリッド化は、個々の正方形が全体に印刷オリゴヌクレオチドは、調査されたことを確認して我々はその後、セグメント化を完了した。その後、我々は、誘導比率を分析し、MSPファミリーをコードする遺伝子が強化されたシナプス形成と線虫に誘発されることを示す遺伝子プロファイルの式を作成した。 (表3)。

リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現の検証と定量化。

MSPの家族のメンバーのためのコードは、リアルタイムPCRを使用していること、さらにVSM - 1変異体の遺伝的プロファイルを理解するために我々は、遺伝子の数を分析した。最初に、全RNAを野生型とVSM - 1(ok1468)変異株から単離された。 RNAサンプルは、逆のcDNAに転写し、リアルタイムPCR解析に使用されていました。リアルタイムPCRの発現プロファイルの評価は、MSPの家族の一員は、VSM - 1(ok1468)変異体では誘導しているように見えることを示した。また、リアルタイムPCRデータは、調査結果を検証マイクロアレイから一MSP遺伝子候補(図4)に検索を絞り込みました。

図1
図1。A. UNC - 17免疫染色では、VSM - 1変異体は、背側神経索に沿ってより高いシナプス密度を示すことを明らかにした。画像は、外陰部に後部63xの倍率、(右)で分析した。 WTとVSM - 1(ok1468)変異体シナプスのB.解析は、VSM - 1変異体(** P <0.01)で統計的に有意な増強シナプス密度を表す。二十線虫は、各遺伝子型のイメージだった。

図2
図2:抽出されたRNAの品質はアガロースゲル電気泳動を用いて決定した。 DNase I処理の前後の2無傷のリボソームサブユニットの存在は、野生型およびVSM - 1(ok1468)サンプルから抽出したRNAで明らかであった。

図3
図3。A.コントロールが赤(Cy5)で標識した実験とVSM - 1変異体のためのマイクロアレイのイメージは、緑(Cy3標識)標識した。マイクロアレイごとに分析された48グリッドのうち1つの表示B.描写のイメージ。グリッド上の各小さな正方形は、単一の印刷されたオリゴヌクレオチドを​​表し、それぞれのグリッドは22行と22列で構成されています。

表2
幼虫4(A)と幼虫3(B)C.から分離された転写産物の表2。マイクロアレイ解析虫の虫は、主要な精子のタンパク質をコードする遺伝子が強化されたシナプス形成と変異体では誘導されることを示した。強調表示された遺伝子は、幼虫の3と幼虫4の両方に誘導される遺伝子を示す。

図4
図4。MSP遺伝子ファミリーの一員、MSP -32はVSM - 1(ok1468)変異体では誘導されることを明らかにリアルタイムPCR解析。代表的な正規化された折り畳み式のグラフは、野生型(WT)と3つのハウスキーピング遺伝子と比較すると、MSP - 32は有意差があるためのVM - 1(ok1468)ΔΔCTの値を正規化(ACT - 1、CDC - 42、およびPMPのために使用されていることを示しています。 -3)。 3つのレプリカの平均値がプロットされている+ / - 標準偏差を。

Discussion

本研究では、様々な生命現象の根底にある決定遺伝子発現プロファイルに使用することができる簡単な、ユーザーフレンドリーなプロトコールを開発した。このプロトコルでは、トータルRNAは、最初に単離され、RNA単離の我々の方法が劇的にフェノール抽出を省略し、5,6をクリーンアップに対する親和性樹脂を使用することによって簡素化されているのDNase Iを用いて処理した。簡単に言えば、C.虫の cuticuleと細胞膜は液体窒素と分子樹脂の研削と凍結線虫でクラック-開いていた。次に、抽出したRNAは、cDNA合成の前にDNase Iで処理した。後のステップは、非特異的ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるために添加し、ゲノムDNAに汚染されたRNAサンプルは、干渉を紹介し、多くの偽陽性を作り出すことができる。次に、野生型およびVSM - 1(ok1468)変異体のcDNAをCy3とCy5のキャプチャシーケンスでタグ付けとCにハイブリダイズさせた。 GCATプログラムを通じて取得elegansはマイクロアレイ。このシステムは、同様の製品よりも高感度であり、そしてその2つの色のデザインは、より大きな時間とコストの効率化7,8の結果、必要な配列の数を減少させる。さらに、このシステムは、他の同様のシステムの特殊な装置を必要としないため、このプロシージャは、任意の標準的な実験室の設定7で達成することができる。第三に、蛍光ハイブリダイズ配列のイメージは、オープンソースソフトウェアのMAGICToolを用いて分析し、遺伝子発現プロファイルが作成されました。 MAGICToolは学部からポスドクに、簡単にすべての経験レベルの人々によって利用されるユーザーフレンドリーなプログラムです。しかし、最適なパフォーマンスは、大容量メモリの可用性を必要とします。最後に、マイクロアレイ解析を用いて得られた候補遺伝子をリアルタイムPCRで検証された。

ゲノムアプローチは生命現象を研究するための効率的な方法ですが、1つは考慮すべきいくつかの制限があります。印刷されたオリゴヌクレオチドが保存された配列から取られている場合、最初、このマイクロアレイのプロトコルの特異性にもかかわらず、家族内での転写物は区別できない。リアルタイムPCRは、遺伝子ファミリー内の類似性を補正し、さらに、同じ遺伝子の特定のアイソフォームを区別することがあります。しかし、リアルタイムでのPCRは、それは、生物の寿命全体に均等に発現される真のコントロールを見つけることが課題です。このため、結果は相対的になります。プロテオミクスのアプローチは、我々の技術への1つの代替です。個々のタンパク質は、2次元ゲル電気泳動と質量分析法で同定を用いて単離することができる。

我々の研究は、特に主要な精子のタンパク質(MSP)の家族の多くのメンバーが強化されたシナプス密度とVSM - 1変異体線虫に誘発されることを示している。 MSPはCに固有のものですと卵成熟と排卵のための責任があります。チャイ1は、ショウジョウバエの神経筋接合部におけるシナプスブートンの数とサイズの調節が可能性が高い主な精子のタンパク質ドメインを含む分子によって制御されることが実証されています。津田らによる研究では、2つの主要な精子のタンパク質のドメインは、受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達カスケードを誘発する、Ephrine受容体のリガンドとして働くことが実証されている。また、リアルタイムPCR解析には、検証とMSPの家族の一員、MSP - 32へのマイクロアレイ結果を絞り込むこと。一緒になって、ここで紹介する作品は、中央の神経科学のジレンマのゲノムワイドな解析だけでなく、科学的試みで学部生の研究の力を表します。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、南西部のオクラホマ州立大学、ウェザーフォードのOKで学部学生により行われました。この作品は、NSF RUI - 0963258、NIH OK - INBRE 2P20RR016478、GCATとOCAST HR09 - 137Sによってサポートされていました。

vsm1(ok1468)変異体は、オクラホマ州の遺伝子ノックアウトコンソーシアムにより単離した。
著者らは、プロジェクトの実行中に貴重な助けのためにダンStefanovicとタナーウィーラーに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA Later Ambion AM7020
Molecular Grinding Resin G-Biosciences 786-138
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rnase-free Agarose LE Ambion AM9040
NorthernMax Gly 10X Gel Prep/Running Buffer Ambion 8678
RNA Millenium Marker Ambion AM7150
Glyoxal Sample Loading Dye Ambion 8551
DNase set Qiagen 79254
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204
RT Enzyme and 5X Reaction Buffer Genisphere RT300320
Array 350 Genisphere W300180
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
20X SSC VWR international 82021-4846
Sheared Salmon Sperm DNA Ambion AM9680
SDS Solution Promega Corp. V6551
DTT EM VWR international 3860
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad 170-8880

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References

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2 Comments

  1. Thanks for the informative material. Could you post something about RealTime PCRs and Traditional PCRs.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 7:20 AM
  2. Thanks for the informative material. Could you post something about http://www.fluoresentric.com/">RealTime PCTR and Traditional PCRs.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 7:20 AM

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