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盲腸結紮穿刺手順

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Summary

人間の敗血症の研究のための貴重なツールとして、盲腸結紮穿刺のマウスモデル。

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

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Abstract

人間の敗血症は、ローカルホストによって含まれていることに失敗した集中的かつ大規模な感染に応答して、全身反応のセットによって特徴付けられる。現在、米国集中治療室1の死亡率のトップ10に名の間で敗血症のランク。敗血症時には重複する可能性が確立された2つの血行動態のフェーズがあります。初期段階は(亢進)マクロファージと血管透過性(低血圧につながる)、心機能に影響を及ぼし、組織の壊死や臓器不全​​で最高潮に達する代謝の変化を誘発する好中球による炎症性サイトカインや活性酸素種の大規模な生産として定義されています。その結果、死亡率の最も一般的な原因は、急性腎障害である。第2フェーズが(hypodynamic)改変された単球、抗原提示を含む抗炎症プロセスであり、リンパ球の増殖および機能とアポトーシスの増加を減少させた。免疫抑制や免疫抑うつと呼ばれるこの状態は急激にnocosomial感染し、最終的に、死のリスクを増大させる。これらの病態生理学的プロセスのメカニズムは十分に特徴付けされていません。敗血症の両方のフェーズでは不可逆的と取り返しのつかない損傷を与える可能性があるので、それは患者の免疫学的および生理学的状態を判断するために不可欠です。これは、多くの治療薬が失敗した主な理由です。敗血症のさまざまな段階で与えられた同じ薬剤は、治療またはその他の有害な場合または効果2,3がないかもしれません。さまざまなレベルで敗血症を理解するには、疾患の臨床経過を再現した適切かつ包括的な動物モデルを持つことが重要です。敗血症時に発生する病態生理学的メカニズムを特徴づけるし、潜在的な治療薬をテストするためのモデルの条件を制御することが重要です。

人間の敗血症の研究者の病因を研究するために別の動物モデルを開発しました。最も広く使用されている臨床モデルでは、盲腸結紮穿刺(CLP)です。 CLPモデルでは、腹腔内に糞便材料のリリースでは、複数菌感染により誘導される悪化免疫応答を生成できるように盲腸の穿孔から構成されています。このモデルは、臨床的に関連している人間の条件を満たしています。人間のように、流体蘇生でCLPを受けるマウスは、時間に秒(後期)hypodynamic段階に進行する最初(初期)亢進相を示す。さらに、サイトカインプロフィールは、リンパ球アポトーシスを(4,5でレビューさ)が増大されている場所、人間の敗血症で見られるものと似ています。敗血症に関与し、複数のと重複するメカニズムにより、研究者が一貫して再現性のある結果を得るために制御された重篤度の適切な敗血症モデルを必要としています。

Protocol

1。ヒト敗血症のマウスモデルとして盲腸結紮穿刺

この手順のC57BL / 6マウスのために(7-9週齢)に使用されています。

  1. 腹腔内に1時01分ケタミン(75mg/kg)とキシラジン(15mg/kg)の溶液を注入することにより、マウスを麻酔。参考として、20グラムのマウスに1:1溶液30μlを注入する。また、マウスは、麻酔薬の気化器を用いて吸入イソフルランで麻酔をすることができます。
  2. マウスの腹部をひげをそると最初の70%アルコールに浸した綿棒(下の写真の順序で番号1)で拭い続いbetadineのソリューションを適用することによって領域を消毒する。クロルヘキシジンは、代替の防腐剤として使用することができます。オプション:滅菌ドレープがきれいな部分を維持するために使用されることがあります。
  3. 無菌条件下では、1〜2センチメートル正中開腹術を練習し、隣接する腸(2と3)と盲腸を公開。
  4. 盲腸はしっかり6.0絹縫合糸(6-0 PROLENE、8680G、エチコン)と連結する回腸盲腸弁下に、そのベースにある、と同じで穴あき一度か二度19ゲージ針(4と5)となります盲腸の側面。ライゲーションのポイントに盲腸の先端からの距離として定義されて連結された盲腸の長さは、重症度を決定することに注意してください。 ≤1cmの距離が中〜低学年の敗血症を生成しながら> 1cmの距離は、高品位の敗血症を生成します。また、ここに示されて盲腸穿孔のメソッドを使用しても、(盲腸を通して針を導入する)を介して穿刺の技術を利用して、標準とは異なることに注意してください。どちらのメソッドも同じ敗血症の予後を確実に生成する。しかし、根っからの技術の欠点の1つは、盲腸が絞られているときに押し出された糞の量を制御すること容易にしないことです。
  5. 盲腸は、その後、静かに穿孔部位(6)から糞の少量を押し出すために圧迫されています。盲腸を腹腔内に返され、腹膜が6.0絹縫合糸で閉じられます。 (7)。
  6. 皮膚は、リフレックス7ミリメートルクリップ(RS - 9258、Roboz手術器具)やミシェルの創傷クリップ(7ミリメートル、RS - 9270)(8)で閉じられます。
  7. 25G針を用いて予め温めておいた0.9%生理食塩水の皮下1mlを注入することにより、マウスを復活させる。この流体の蘇生措置は、敗血症の亢進相を誘導する。この重要なステップは、議論のセクションで詳しく説明されています。
  8. オプション:術後鎮痛のために皮下ブプレノルフィン(0.05mg / kg体重)またはトラマドールの(20mg/kg体重)注入。これらの麻薬は、呼吸や運動を抑制することができることをお勧めすると、これらの効果は、敗血症の兆候として誤って解釈することができます。
  9. 動物は、加熱パッドを一時的に置くか、彼らは麻酔から回復するまで交互に150Wの赤外線加熱ランプへの曝露とのケージに直ちに返されます。回復時間は30分〜1時間からです。
  10. ケージの底部に配置食べ物と水(ハイドロゲル)への無料アクセスを提供します。
  11. マウスは1週間から2週間生存のために12時間ごとに監視したり、様々なパラメータの解析のために異なる時点で安楽死されています。

実験的な設計のための対照として、偽の動物は結紮穿刺することなく開腹術のテクニックに従う。
外科的処置のマウスの後の6〜12時間は、無気力になり、発熱、立毛、下痢、拠り所、および倦怠感を開発し、敗血症のすべての症状。非常に重症敗血症のマウスは、ほとんど死亡前に移動し、体温の劇的な低下を示すことができる。このステップのマウスでの長時間の痛みと苦しみを避けるために安楽死されるべきである。

図0

2。最も一般的な分析されたパラメータ

手続きの結果を評価するために、異なるパラメータが臓器、細胞抽出物または体液で分析することができます。サンプルは、外科的処置後3時間から一週間に異なるタイムポイントで収集することができます。

  1. マウスの生存率。
  2. 血清、腹腔内および臓器抽出物におけるサイトカインとケモカイン。
    1. インターロイキン6:単球、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、T細胞、顆粒球、マスト細胞と、より多くの細胞型により産生され、放出。それは急性相反応と炎症において重要な役割を果たしている。
    2. 腫瘍壊死因子-α:炎症およびアポトーシスにおいて中心的な役割を果たすPleiotrophicサイトカイン。単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞と線維芽細胞によって産生さ。
    3. nterleukin -1β:単球、NK細胞、樹状細胞、B細胞とT細胞により産生される。発熱や急性期タンパク質の合成を誘導する。
    4. インターロイキン10:貪食取り込みおよびTh2応答を促進するがantig抑制ENプレゼンテーションとTh1の炎症性応答。
    5. インターロイキン10:貪食取り込みおよびTh2応答を促進するが、抗原の提示とTh1の炎症反応を抑制します。
    6. 単球走化性タンパク質-1(もCCL2とも呼ばれる):新兵の単球、メモリーT細胞、および組織損傷や感染症のサイトへの樹状細胞。
    7. KC(CXCL1):マクロファージと血管内皮細胞により産生される。マウスKCは、強力な好中球の誘引及び活性剤です。
    8. RANTES:単球走化性。それは、非刺激CD4 + / CD45RO +メモリーT細胞と刺激CD4 +およびNaのVEとメモリの表現型を有するCD8 + T細胞を化学的に誘引することができます。
    9. インターフェロン-γ:Th1細胞、細胞傷害性T細胞、樹状細胞とナチュラルキラー(NK)細胞から分泌される。マクロファージの抗原提示と溶解活性を増加させ、Th2細胞の活性を抑制する。白血球遊走に必要な接着との結合を促進し、NK細胞活性を促進する。
    10. 高移動度群B - 1蛋白質:単球では、敗血症の後期段階における炎症性メディエーターの放出を活性化する、事前の糖化最終産物の細胞受容体(RAGE)に結合することにより、核因子カッパB活性化因子である。
  3. 好中球浸潤の指標としての臓器におけるミエロペルオキシダーゼの定量。ミエロペルオキシダーゼは(MPO)好中球顆粒球の中で最も豊富に存在するペルオキシダーゼ酵素です。それは好中球のアズール顆粒に格納されたリソソーム蛋白質である。 MPOは、膿や粘液のいくつかの形態として、好中球の豊富な分泌物で、その緑の色を、引き起こすヘム色素を持っています。
  4. 臓器や血流中の細菌負荷、ミリリットル当たりコロニー形成単位の数として測定する。

3。代表的な結果

CLPの手順は、最初にC57BL / 6マウスの系統で実施した。我々は図1図2に示すように針のライゲーションと厚さの長さを変えることによって敗血症の重症度を調節するためにいくつかのパラメータをテスト。これら二つの因子の中で、ライゲーションの長さは、生存率を変更するために、針の太さよりも効果的と思われる。 図1に示すように、1センチメートル以上でライゲーションの長さを増加させると≤1cmのライゲーションを有するマウスに比べて100%の死亡率の増加を引き起こす。針の太さを大きくすると、2つの穴を開けて100%(22G針を使用して)から55%(19G針を使用して)に生存率を減少させた。我々はまた、異なるマウス系統は、CLP -誘導敗血症に類似または異なる感受性を表示するかどうかを判断するためにC57BL / 6と129SvJマウスにCLPの効果を試験した。図3と同じ条件の下で、129SvJマウスは増加パーセントの死亡率で示されたC57BL / 6、より感染を受けやすくなったことを示している。

図1
図1。動物の生存に盲腸の結紮の長さの効果。CLPは、盲腸結紮二つの異なる長さを使用して、C57BL / 6マウスで行われた。この単一のパラメータは、劇的に1cmの約のライゲーションの面積を有する動物の群と比較して3日未満で死亡した1cm未満長いライゲーションエリアと群の動物のすべて以来、動物の生存に影響を与えます。 (N = 8)。

図2
図2。生存に対する針板厚の影響は。CLPは、19Gおよび22Gつの異なる針サイズを、使用してC57BL / 6マウスで行われた。 19G針を用いて穿孔盲腸とマウスは、55〜60パーセントの生存率を示した。彼らは最初の3-4日間は炎症の典型的な症状を経験したものの、これとは対照的に、22G針を用いて穿孔盲腸とマウスは100%の生存率を示したが、これは(n = 8)を4日後に消失した。

図3
図3。二つの異なるマウス系統間で敗血症の感受性の比較。CLPモデルは、同じ条件で129SvJとC57BL / 6で行われた。評価期間の終了時に129SvJ株の生存率は、複数菌感染により誘導される炎症に高い感受性を示し、C57BL / 6系統に比べて25%低かった。 (N = 6)。

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Discussion

ここでは、マウスにCLPモデルを実行する方法を詳細に示し、重症度を調節している。

敗血症の他の動物モデルと比較すると、CLPは、異なる年齢と性別のいずれかのマウス系統で行うことができます。それは比較的簡単で安価な手術です。このモデルでは、重症度のグレードは、生存の割合に直接影響を与えます。ライゲーションの長さ、針の太さとパンクの数は、CLPの重要度/死亡率を変調するように制御できるパラメータです。重症度のわずかな変更が針の太さを調整することによって導入することができますが、その結果、CLP重症度の劇的な変化を得るために、ユーザーは、ライゲーションの長さを変更することができます。

CLPの結果にかなりのばらつきを導入することができる他の重要なパラメータは、マウスの系統6,7、性別8と動物の9歳です。この点に関し、我々は、同じ条件で実行するときに異なるマウス系統がプロシージャに異なる感受性を表示することを示している。確かに、血漿サイトカインレベルおよび組織損傷の違いは、異なるマウス系統10から12の間に検出されている。輸液と鎮痛剤投与の包含は、CLPモデルで有意な変動を導入することができる要因である。例えば、流体の蘇生は、このように潜在的な治療介入の効果をマスキング初期の炎症性サイトカイン11、13、14の生産を減少させることによって可能性が生存率を向上させます。対照的に、麻薬性鎮痛薬は、動物の呼吸と運動を抑制し、敗血症とは関係のない不可逆的な効果を引き起こすことができる。彼らの使用は、したがって、生存率と免疫細胞機能15を影響を与えることができます。

結論として、CLPモデルを実行する際に、これらの条件と技術的な変数のすべてを注意深く再現性と一貫性のある結果を得るために考慮する必要があります。そのため、手続きの深い知識とマスタリングは、絶対に正確にCLPモデルを実行するために必要です。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、健康のペンシルバニア部からの助成金によって支えられて。
博士ミゲルガルシアトスカーノはこの調査中にアルフォンソマルティンエスクデロ財団が資金提供テンプル大学でポスドクだった。
我々は、ビデオの製作のためにIliya YordanovとケビンKotredesに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Comments

7 Comments

  1. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:03 AM
  2. dear sir:I am a student of Central South University,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!

    Reply
    Posted by: peng x.
    May 13, 2013 - 4:27 AM
  3. Hello Colleges, we are very interested in your model of abdominal sepsis, we would very much like to ask you a complete description, unfortunately we can not pay money for it. We'll be very grateful, and try using it to make a drop in the ocean of the world science.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 26, 2013 - 3:33 PM
  4. I'll be happy to send you the complete description. please provide me an e-mail address where to send the information.
    Ana

    Reply
    Posted by: ana g.
    November 26, 2013 - 4:43 PM
  5. medroma03@gmail.com I am very grateful to you and I promise you that all this will not be publicized.

    Reply
    Posted by: Roma Z.
    November 27, 2013 - 12:21 AM
  6. dear sir:I am a student of zhejiang University of China,can you sent me the view of Cecal Ligation Puncture Procedure
    please thank you very much!
    my e-mail:li.renjun@yahoo.com

    Reply
    Posted by: li r.
    January 12, 2014 - 9:42 PM
  7. Dear sir:I am a student from Jiangsu University. Recently we will do some experiment in this CLP model. however, we all don't understand the detail about the procedure. So when we search your video, we are very excited. Would you please send it to us,because we can't afford it? Thank you very much! my e-mail: 191853184@qq.com.

    Reply
    Posted by: Yuyun X.
    January 14, 2014 - 2:26 AM

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