संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स एफएम रंगों का उपयोग करने में Synaptic पुटिका पूल पुनःपूर्ति के मात्रात्मक विश्लेषण

Neuroscience
 

Summary

एक जीवित प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक और केंद्रीय तंत्रिका टर्मिनलों में विशिष्ट synaptic पुटिका जुटाना पूल (एसवी) पुनःपूर्ति यों वर्णित है. एसवी रीसाइक्लिंग के दो दौर एक ही तंत्रिका एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान टर्मिनलों में निगरानी कर रहे हैं.

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Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes. J. Vis. Exp. (57), e3143, doi:10.3791/3143 (2011).

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Abstract

Protocol

1. अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन तैयारी

  1. लगभग 100 25 मिमी व्यास coverslips आटोक्लेव (तालिका 1).
  2. एक 50 मिलीलीटर बाँझ बाँझ समाधान पाली - डी - lysine (तालिका 2) युक्त ट्यूब में रखें coverslips. 2 coverslips कोट करने के लिए ज के लिए एक rotating मंच पर रखें.
  3. एक लामिना का प्रवाह हुड में सूखी लेपित बाँझ टिशू पेपर पर coverslips (तालिका 1).
  4. बाँझ 6 अच्छी तरह प्लेटें और सीओ 2 इनक्यूबेटर (तालिका 1) में गर्म. Coverslips में प्लेस coverslips 4 ° C से कम 1 महीने के लिए उपयोग करने से पहले के लिए भंडारित किया जा सकता है.
  5. एक दिन 7 पुराने Sprague Dawley स्थानीय नैतिक समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार पिल्ला चूहे euthanize. हम गर्भाशय ग्रीवा के पिल्ले का उपयोग अव्यवस्था euthanized.
  6. सेरिबैलम काटना और यह एक बाँझ पेट्री डिश में एक फॉस्फेट लवण समाधान (समाधान बी, 3 टेबल) buffered युक्त जगह.
  7. 4-6 चूहे पिल्ले के लिए 1.5 और 1.6 कदम दोहराएँ.
  8. मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है तो एक McIlwain ऊतक चो के बाँझ मंच पर रखा जाता हैpper (तालिका 1). ऊतक 375 सुक्ष्ममापी अंतराल पर पहले 90 डिग्री के माध्यम से मंच घूर्णन और इस प्रक्रिया को दोहरा कटा हुआ है.
  9. कटा मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है एक trypsin (समाधान टी, टेबल 4) समाधान ° जो पहले 37 के लिए गर्म किया गया था सी. में स्थानांतरित कर रहे हैं
  10. 37 में सेते मस्तिष्क् का पोंस तथा ऑब्लांगाटा के पीछे स्थित एवं इनसे जु्ड़ा भाग, जिसमें बीच का एक भाग् वर्मिस तथा दो पार्श्वीय खण्ड (गोलार्द्ध) होते है ° C कोमल आंदोलन लगभग हर 5 मिनट के साथ 20 मिनट के लिए.
  11. Tryptic पाचन के दौरान, लौ पॉलिश तीन बाँझ कांच pipettes (तालिका 1) एक लेम्प लौ का उपयोग. लौ का प्रयोग करें एक ठीक बोर, एक मध्यम बोर pipettes के संबंधित मुंह पर और एक विस्तृत बोर बनाने.
  12. समाधान टी में 20 मिनट ऊष्मायन के बाद, अनुमस्तिष्क और एक benchtop अपकेंद्रित्र में 1 मिनट (तालिका 1) के लिए 1,000 ग्राम पर निलंबन गोली कोशिकाओं के लिए एक अवरोध करनेवाला / trypsin DNase समाधान के 20 मिलीलीटर (समाधान डब्ल्यू, टेबल 5) जोड़ें.
  13. सतह पर तैरनेवाला निथारना और एक केंद्रित / trypsin DNase (समाधान सी, टेबल 6) अवरोध करनेवाला व्यापक बोर पिपेट का उपयोग कर के 1.5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  14. बोर समरूप है यह एक महत्वपूर्ण कदम है, निलंबन इस स्तर पर समरूप होना चाहिए..
  15. सेल निलंबन परत के 10 मिलीलीटर की चोटी पर एक prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) गोजातीय सीरम albumin एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में पूरक Earles बैलेंस्ड साल्ट समाधान (7 टेबल).
  16. 5 मिनट के लिए 1,500 g पर निलंबन और अपकेंद्रित्र prewarmed के 2 mls में सेल गोली (37 डिग्री सेल्सियस) मध्यम संस्कृति (8 टेबल). Resuspend
  17. सेल एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग संख्या (तालिका 1) का अनुमान है और 3.3 x 10 मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं की एक अंतिम घनत्व सेल निलंबन पतला .
  18. कक्ष पाली डी lysine-लेपित coverslips (अंतिम घनत्व 2.5 x 10 5) के केंद्र के लिए सेल निलंबन के 75 μl जोड़कर चढ़ाया जाता है .
  19. संस्कृति coverslips युक्त प्लेटें सीओ 2 इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए रखा जाता है कोशिकाओं के लिए एक की अनुमतिdhere.
  20. प्रत्येक अच्छी तरह से ख्याल रख रही मढ़वाया कोशिकाओं परेशान नहीं है और सीओ 2 इनक्यूबेटर संस्कृति प्लेटों वापसी में मध्यम संस्कृति के 1.5ml जोड़ें.
  21. अगले दिन ताजा संस्कृति mitotic अवरोध करनेवाला साइटोसिन arabinoside (8 टेबल) के साथ पूरक माध्यम से संस्कृति के माध्यम संस्कृति में glial कोशिकाओं के इस गिरफ्तारी के प्रसार की जगह.

2. प्रायोगिक सेटअप

  1. मूल प्रयोगात्मक सेटअप निम्नलिखित से मिलकर चाहिए (1 टेबल्स और विशिष्ट उपकरण और सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल के लिए 9 देखें):
    • उलटा माइक्रोस्कोप महामारी प्रतिदीप्ति
    • ठंडा सीसीडी कैमरा
    • प्रतिदीप्त प्रकाश स्रोत (monochromator या फिल्टर पहिया)
    • ग्रेविटी छिड़काव उपकरण
    • समानांतर प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ इमेजिंग कक्ष
    • विद्युत उत्तेजक औधधि
    • कंप्यूटर
    • छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर
  2. प्रयोगों काले या लाल बत्ती cond के तहत किया जाना चाहिएनमूने की न्यूनतम फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ itions एफएम डाई से बचने के लिए विरंजन.
  3. प्रयोगों से बाहर कमरे के तापमान पर किया जाता है. यदि शारीरिक तापमान की आवश्यकता होती है, एक तापमान नियंत्रित छिड़काव प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. नमूना तैयार

  1. संस्कृतियों इन विट्रो में 8-12 दिनों के बाद किया जाना चाहिए.
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमकीन घोल (तालिका 10) के लिए एक एकल coverslip स्थानांतरण के लिए नए माध्यम में स्थिरीकरण की अनुमति.
  3. Coverslip निकालें, इसके नीचे और कागज तौलिया या शोषक कागज का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ संलग्न कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में सूखे.
  4. सिलिकॉन तेल (तालिका 2) का उपयोग करना, गोंद इमेजिंग चैम्बर के नीचे coverslip. कक्ष दो समानांतर तार के बीच होना चाहिए. पर्याप्त सिलिकॉन तेल को पूरी तरह से कक्ष को सील किया जाना चाहिए, लेकिन किसी भी तेल स्नान कक्ष के केन्द्र में प्रवेश करने के बिना.
  5. धीरे ~ 260 μl सा के साथ स्नान कक्ष को भरनेलाइन समाधान और फिर एक ही समाधान के साथ इनपुट टयूबिंग भरने करें.
  6. गोंद चैम्बर के शीर्ष करने के लिए सिलिकॉन तेल के साथ एक स्वच्छ coverslip इसे सील करने के लिए. इनपुट और आउटपुट टयूबिंग किसी भी हवाई चैम्बर में फंस बुलबुले को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यह महत्वपूर्ण है कि विद्युत परिपथ हवाई बुलबुले के द्वारा बाधित नहीं है.
  7. एक स्टेनलेस स्टील के मंच में इमेजिंग कक्ष Immobilise और धीरे इनपुट टयूबिंग के माध्यम से नमकीन घोल perfusing द्वारा लीक के लिए जाँच करें.
  8. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर इकट्ठे कक्ष माउंट, और एक गुरुत्व छिड़काव प्रणाली चैम्बर कनेक्ट पहले नमकीन घोल के साथ इनलेट primed.
  9. बिजली उत्तेजक औधधि के चैम्बर के तारों को जोड़ने संलग्न.
  10. विसर्जन के तेल के एक उद्देश्य के लिए ड्रॉप अगर एक तेल लेंस प्रयोग किया जाता है जोड़ें. उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर चैम्बर के बीच में कोशिकाओं पर ध्यान दें.

4. S1 चरण

  1. 1.5 मिलीलीटर से छिड़कना न्यूरॉन्सएफएम (तालिका 2) डाई नमकीन घोल में पतला.
  2. न्यूरॉन्स उत्तेजित डाई तेज आह्वान संलग्न उत्तेजक औधधि का उपयोग.
  3. उत्तेजना के बाद, 2 मिनट के लिए ताजा नमकीन घोल के साथ छिड़कना न्यूरॉन्स दूर अतिरिक्त एफएम डाई (प्रवाह की दर 7 मिलीलीटर / मिनट) धोने के लिए CGN संस्कृति प्रणाली में Glial प्रदूषण कम से कम 5 14% है., इसलिए इस समय सीमा डाई हटायें पर्याप्त है .
  4. न्यूरॉन्स छोड़ो 8 मिनट के लिए आराम.
  5. इस अंतराल के दौरान, जहां व्यक्तिगत एफएम डाई लोड तंत्रिका टर्मिनलों दिखाई fluorescein तरंगदैर्य का उपयोग (, उत्सर्जन,> 550 एनएम उत्तेजना, 480 एनएम) axonal नेटवर्क का पता लगाने. कोशिकाओं के समूहों के साथ क्षेत्रों से बचें इस कदम पर एक न्यूनतम करने के लिए रोशनी रखें, क्योंकि तीव्र उत्तेजना डाई phototoxicity में परिणाम कर सकते हैं. इस के स्पष्ट संकेत axons और डाई उतराई की कमी (फिक्सिंग डाई के कारण) के blebbing हैं .
  6. पुन फोकस की छवि छवि अधिग्रहण से पहले एक मामूली बहाव से तुरंत शेष अवधि के दौरान हुई हो सकता है. 1 फ्रेम दर हर 4 एस में समय चूक की छवि अधिग्रहण शुरू
  7. 5 खरीदने के बाद - 10 आधारभूत छवियों, 2 (60 कार्रवाई क्षमता), 8 के लिए एक 30 हर्ट्ज उत्तेजना देने से RRP के exocytosis आह्वान उत्तेजना मैन्युअल फ्रेम कब्जा करने के बाद तुरंत शुरू करो. .
  8. एक और 10 छवियों को प्राप्त करने के बाद, आरपी की एसवी exocytosis आह्वान 10 एस (400 कार्रवाई क्षमता) के लिए 40 हर्ट्ज की तीन stimulations का उपयोग कर, प्रत्येक 30 8 के अलावा.
  9. 5 एक और मोल - 10 और फिर थामने छवि अधिग्रहण छवियों.

5. रिकवरी चरण (देखें चित्र 2)

  1. न्यूरॉन्स कम से कम 20 मिनट पर ठीक करने के लिए अनुमति दें.
  2. वैकल्पिक - यदि endocytosis पर एक दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, इस अवधि (चित्रा 2b) 3,8 के दौरान नशीली दवाओं के समाधान के साथ छिड़कना न्यूरॉन्स.

6. S2 चरण

  1. एक नियंत्रण के रूप में देखने का एक ही क्षेत्र का उपयोग प्रयोग के लिए दोहराएँ S1 चरण प्रोटोकॉल (4 खंड)S1 में.
  2. वैकल्पिक - यदि endocytosis पर एक दवा के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए किया जाता है, दवा एफएम डाई (चित्रा 2b) 3,8 के साथ पूरक समाधान के साथ न्यूरॉन्स छिड़कना.
  3. वैकल्पिक वैकल्पिक रूप से अगर exocytosis पर दवा प्रभाव ब्याज की हैं, दोनों से पहले और RRP और आरपी उतराई (चित्रा 2c) उत्तेजनाओं 3 के दौरान नशीली दवाओं के समाधान के साथ छिड़कना न्यूरॉन्स.

7. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ और Microsoft Excel या डेटा विश्लेषण के लिए इसी तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  2. विश्लेषण के लिए, ढेर प्रारूप में एक छवि अनुक्रम की आवश्यकता है. कुछ इमेजिंग सॉफ्टवेयर एकल छवियों के रूप में अनुक्रम निर्यात कर सकते हैं. यदि यह मामला है, एक ढेर का उपयोग कर एक निर्मित में समारोह छवि> ढेर छवियाँ> ImageJ ढेर करने के लिए छवियों कन्वर्ट.
  3. छवि और स्टैक की चमक, इसके विपरीत समायोजित करने के लिए गतिशील रेंज को अधिकतम.> समायोजित> चमक / कंट्रास्ट (चित्रा 3a) .
  4. यदि महत्वपूर्ण क्षैतिज बहाव टी के दौरान हुआ हैवह प्रयोग, रन आउट (StackReg http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) और TurboReg ImageJ ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ पर) plugins के छवि ढेर (3b चित्रा) संरेखित .
  5. समय श्रृंखला विश्लेषक (प्लगइन भागो http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (चित्रा -3 सी).
  6. कम से कम 90 तंत्रिका टर्मिनलों से अधिक ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों को परिभाषित करें. ये समान होना (1.5 सुक्ष्ममापी व्यास के साथ परिपत्र ROIs) से पहले छवियों के बीच टॉगल यह उपयोगी है और बाद डाई करने के लिए सक्रिय तंत्रिका टर्मिनलों (वैकल्पिक रूप से एक पूर्व उत्तेजना छवि एक उत्तेजना के बाद छवि से घटाया जा सकता है) प्रकट उतारने चाहिए एक आदर्श. आरओआई आकार एक है कि एक विशिष्ट तंत्रिका टर्मिनल (चित्रा -3 सी) की तुलना में थोड़ा बड़ा है है.
  7. / कुल एकीकृत टिम पर प्रत्येक रॉय के प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्तई और Microsoft Excel (चित्रा 3 डी और 4a) को निर्यात.
  8. एक ही मनमाना मूल्य के लिए आरओआई निशान दोनों S1 और S2 चरणों में पहले उतारने प्रोत्साहन (4b - ग चित्रा) के लिए Y-अक्ष के विमान में निशान aligning से यह पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता में छोटे बदलाव के लिए नियंत्रण है Normalise..
  9. प्रतिदीप्ति में पूर्ण कमी प्रकार (चित्रा 4d) के रूप में S1 और S2 के लिए मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों में प्रत्येक उतारने उत्तेजना पैदा उपाय:
    • प्रतिदीप्ति में RRP = बदलें (ΔF) 30 हर्ट्ज 2 एस द्वारा ट्रिगर
    • आरपी ΔF का योग = 3 एक्स 40 हर्ट्ज 10 s द्वारा ट्रिगर
    • कुल रीसाइक्लिंग पूल = RRP + आरपी
  10. 7.9 में प्रत्येक प्रासंगिक पैरामीटर के लिए, एक ही प्रयोग के सभी तंत्रिका टर्मिनलों से अधिक मतलब मूल्य की गणना.
  11. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मतलब है, कई स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त मूल्यों औसतन किया जा सकता है. तंत्रिका टर्मिनलों की संख्या के बजाय coverslips की संख्या के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए statisticaएल एन

8. प्रतिनिधि परिणाम:

एक नियंत्रण प्रयोग है, जहां CGNs समान चरणों का लदान और उतराई के दो राउंड लिया चित्रा 5 में प्रतिनिधित्व किया है. जब प्रयोगों की एक श्रृंखला शुरू, यह जरूरी है कि इस तरह के रूप में एक नियंत्रण प्रयोग प्रत्येक दिन प्रदर्शन की पुष्टि करते हैं कि S1 और S2 S2 दौरान प्रयोगात्मक शर्तों के अलग से पहले तुलना कर रहे हैं.

इस उदाहरण में, CGNs 10 FM1 43 सुक्ष्ममापी एक 80 हर्ट्ज 10 एस उत्तेजना (चित्रा 5a) का उपयोग कर के साथ भरी हुई थी. चित्रा 5b FM1 -43 लोड तंत्रिका फ्लोरोसेंट puncta द्वारा प्रतिनिधित्व टर्मिनलों से पता चलता है. ROIs 90 तंत्रिका टर्मिनलों पर परिभाषित किया गया के रूप में चित्र 5c में दिखाया गया है. ROIs के एक ही सेट में दोनों S1 और S2 के लिए इस्तेमाल किया गया था. दोनों अनलोड के दौरान, RRP पहले एक 30 हर्ट्ज (2 s) उत्तेजना आरपी 3 अनुक्रमिक 40Hz (10 s) उत्तेजनाओं (चित्रा 5a) के साथ उतारने के द्वारा पीछा के साथ उतार था. प्रतिदीप्ति ड्रॉप प्रत्येक उत्तेजना के दौरान स्पष्ट रूप से हो सकता है और देखा जा मात्रा (चित्रा 5d - ई). जब जांच की, प्रतिदीप्ति RRP के लिए इसी बूँदें, आरपी और कुल रीसाइक्लिंग पूल दोनों S1 और S2 में तुलनीय थे. इसके अलावा, पुनर्नवीनीकरण SVS के 20% RRP में बसता है, जबकि 80% दोनों S1 और S2 में आरपी में बसता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 एक ठेठ एफएम प्रयोग के योजनाबद्ध आरेख. ए) एसवी endocytosis एफएम डाई (हरे रंग में प्रतिनिधित्व) की उपस्थिति में शुरू हो रहा है. डाई invaginating झिल्ली (एकल SVS या थोक endosomes) द्वारा लिया जाता है. बी) के प्लाज्मा झिल्ली पर गैर भली भाँति डाई छिड़काव द्वारा दूर धोया जाता है. सी) एक उतराई उत्तेजना, SVS लेबल है कि प्लाज्मा झिल्ली प्रतिदीप्ति का एक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के साथ रिलीज फ्यूज के लिए उपलब्ध हो गए हैं के आवेदन पर. डी) (ΔF) प्रतिदीप्ति जो की राशि जारी लेबल SVS करने के लिए आनुपातिक है में परिवर्तन की मात्रा तो किया जा सकता है.

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2 संभव प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख चित्रा. ए) एक नियंत्रण प्रयोग है जहाँ कोशिकाओं लदान और उतराई (S1 और S2) एफएम डाई के दो दौर से गुजरना फ्लो चार्ट. कक्ष विभिन्न उत्तेजनाओं की एक श्रृंखला का उपयोग कर लोड किया जा सकता है. उतराई चरणों में समान है कि RRP s 2 के लिए 30 हर्ट्ज के साथ उतार आरपी द्वारा पीछा किया 10 एस के लिए 3 बार 40 हर्ट्ज का उपयोग अनलोड RRP और आरक्षित पूल उतराई उत्तेजनाओं और 40 सेकंड, अन्य सभी उत्तेजनाओं द्वारा 30 सेकंड से अलग हो गए थे. कक्ष S1 और S2 के बीच 20 मिनट के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया जाता है. संभव संशोधनों के प्रवाह चार्ट या तो बी पर एक पदार्थ के प्रभाव का परीक्षण) endocytosis या सी) exocytosis भी दिखाए जाते हैं. अनुरूप परीक्षण दवा संकेत अवधि के दौरान कक्ष में perfused किया जा सकता है.

चित्रा 3
चित्रा छवि जम्मू में डेटा विश्लेषण के 3 स्क्रीनशॉट स्क्रीनशॉट. दिखाए जाते हैंए) चमक और विपरीत समायोजन, बी) फ्रेम संरेखण, सी) ROIs चयन, और डी) तीव्रता मूल्यों निष्कर्षण छवि जे का उपयोग कर के लिए

चित्रा 4
Microsoft Excel में डेटा विश्लेषण के 4 स्क्रीनशॉट चित्रा. स्क्रीनशॉट ए) छवि जम्मू (1 सेंट स्तंभ से कच्चे डेटा आयात करने के लिए दिखाए जाते हैं = फ्रेम नंबर, शेष कॉलम व्यक्तिगत तंत्रिका टर्मिनलों से डेटा =) बी) के एक मनमाना मूल्य (200) के लिए S1 के आधारभूत मूल्यों (10 फ्रेम) के शुरू में समायोजन पहले प्रोत्साहन के 55 फ्रेम पर, सी) S2 के आधारभूत मूल्यों के समायोजन S1 के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग कर, और डी प्रतिदीप्ति बूँदें Microsoft Excel का उपयोग कर के) माप. ध्यान दें कि औसतन डी में दिखाया ट्रेस करने के लिए एक बूंद के पहले और बाद में समय अंक को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक रॉय के लिए प्रतिदीप्ति बूंदों के आकार सी. में दिखाया स्प्रेडशीट पर मान से निर्धारित किया जाना चाहिए

चित्रा 5 चित्रा 5. प्रतिनिधि नियंत्रण प्रयोग. ए) एक नियंत्रण प्रयोग है जहां CGNs 10μM FM1-43 के साथ भरी हुई थी 80 (10 ओं) हर्ट्ज उत्तेजना का उपयोग फ्लो चार्ट. S1 और S2 चरणों समान हैं. RRP और आरक्षित पूल उतराई उत्तेजनाओं और 40 सेकंड, अन्य सभी उत्तेजनाओं द्वारा 30 सेकंड से अलग हो गए थे. बी) एक तंत्रिका टर्मिनलों दिखा छवि FM1-43 के साथ भरी हुई है. सी) 90 गिने ROIs दिखा बी के रूप में एक ही छवि विश्लेषण के लिए चुना है. डी) एक चयनित समय बिंदुओं पर बी में एक लाल बॉक्स द्वारा दर्शाया क्षेत्र के छवियाँ. उत्तेजना से पहले बेसल =, 30 हर्ट्ज = 30 हर्ट्ज 2 उत्तेजना के बाद, 40 1,2,3 हर्ट्ज = प्रत्येक 40 हर्ट्ज 10 उत्तेजना के बाद. इन छवियों pseudocolor में प्रस्तुत कर रहे हैं प्रतिदीप्ति में परिवर्तन (स्पेक्ट्रम के लिए दाईं तरफ प्रदर्शित पट्टी) वर्णन. ई) मीन ± SEM 90 तंत्रिका सी. व्यक्तिगत उत्तेजनाओं में दर्शाया टर्मिनल से प्राप्त ट्रेस क्षैतिज सलाखों के द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. स्केल सलाखों = 10 सुक्ष्ममापी.

Discussion

एफएम रंजक बड़े पैमाने पर कई neuronal तैयारी में तंत्रिका टर्मिनल समारोह की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. वे मुख्य रूप से नियोजित किया गया है या तो एसवी endocytosis, एसवी कारोबार या 6 exocytosis के कैनेटीक्स की हद पर नजर रखने के. वर्णित प्रोटोकॉल इन अध्ययनों का विस्तार विशिष्ट एसवी पूल की उतराई अंतर की जांच. यह अतिरिक्त एसवी पूल की पुनःपूर्ति और भी लामबंदी के अपने हद तक के बारे में जानकारी प्रदान करता है.

एफएम रंजक एक ही तंत्रिका टर्मिनल के भीतर एसवी रीसाइक्लिंग के कई दौर के लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस संपत्ति का शोषण किया है और डिजाइन प्रोटोकॉल जिसमें प्रत्येक टर्मिनल में एसवी कारोबार एक ही तंत्रिका टर्मिनलों में दो बार निगरानी कर सकते हैं. यह एक सटीक आंतरिक नियंत्रण है, जो एसवी रीसाइक्लिंग के समानांतर तंत्रिका 11 टर्मिनलों में विषम प्रकृति के कारण आवश्यक है प्रदान करता है . Via एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में S1 चरण के उपयोग, RRP, आरपी और कुल के refillingदवाओं की उपस्थिति में एसवी पूल मज़बूती से और सीधे तुलना की जा सकती है.

रीसाइक्लिंग के पूर्ण आकार की जानकारी प्रदान करने के अलावा, RRP और आरपी पूल विभिन्न उत्तेजना की शर्तों के तहत, इस प्रोटोकॉल भी निम्नलिखित के लिए डेटा प्रदान कर सकते हैं - 1) RRP और आरपी के बीच SVS की रीसाइक्लिंग पूल के एक समारोह के रूप में विभाजन 2 S1 और S2, के लिए) S2 पूल के सापेक्ष कुल S1 रीसाइक्लिंग पूल और 3) किसी भी परिभाषित S1 में एक ही पूल के एक समारोह के रूप में S2 में एसवी पूल के सापेक्ष आकार के एक समारोह के रूप में आकार (RRP और आरपी). इस विशेष प्रोटोकॉल लेकिन कैनेटीक्स उतारने पर जानकारी प्रदान नहीं करता है, अधिग्रहण के समय के बाद से बहुत धीमी है (गतिज माप के लिए अधिग्रहण के समय के रूप में संभव है और स्वचालित रूप से उतारने छवि पर कब्जा करने के लिए सिंक्रनाइज़ के रूप में तेजी से होना चाहिए).

हमारे 30 हर्ट्ज 2 एस उत्तेजनाओं RRP के अतिपरासारी 8 sucrose के एक समान हद तक उतारने के उदाहरण भी देते हैं . RRP के आकार के बाद सेअतिपरासारी 15 उतराई sucrose के द्वारा परिभाषित है, हम है कि इस प्रोटोकॉल unloads सभी RRP SVS hippocampal 16 न्यूरॉन्स में पढ़ाई के साथ समझौते में, राज्य कर सकते हैं . आरक्षित पूल लगभग 400 उत्तेजनाओं (40 हर्ट्ज 10 प्रत्येक) इस उत्तेजना के बाद से (50 मिमी KCl के साथ 2 उत्तेजनाओं) प्रतिमान है कि सभी डाई लेबल SVS के 95% depletes डाई का एक समान राशि unloads के तीन गाड़ियों द्वारा पूरी तरह समाप्त हो गया है 8,17. दोनों RRP और आरक्षित पूल के आकार की सटीक मात्रा का ठहराव भी सीसीडी कैमरे के रैखिक गतिशील रेंज के भीतर जानकारी प्राप्त करने पर निर्भर है.

यह सरल प्रोटोकॉल आगे भी संशोधित किया जा सकता है. लोड हो रहा है उत्तेजनाओं की ताकत भी निर्धारित करने के लिए कैसे neuronal गतिविधि और विभिन्न endocytosis मोड एसवी पूल पुनःपूर्ति प्रभावित विविध किया जा सकता है. इसके अलावा, लदान और उतराई की दो से अधिक चक्र भी यदि आवश्यक प्रदर्शन किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को भी या तो overexpression या के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता हैshRNA वैक्टर. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के कम अभिकर्मक दक्षता के कारण, व्यक्त प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग होना चाहिए. यह आवश्यक है कि इन फ्लोरोसेंट टैग एफएम डाई संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं (सियान या लाल प्रोटीन उदाहरण के लिए, का उपयोग करें). इस उदाहरण में, देखने का एक ही क्षेत्र में ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से तंत्रिका टर्मिनलों भी एक अतिरिक्त 8 नियंत्रण के रूप में तुलना में किया जा सकता है. ऐसे प्रयोगों में S1 और S2 भार के बीच लोड करने की हद तक की तुलना में कम मूल्य का है, के बाद से दोनों भार के दौरान गड़बड़ी मौजूद है. एसवी पूल डाई के बीच का विभाजन अभी भी 8 तथापि visualized किया जा सकता है .

जेनेटिक संवाददाताओं से कहा जाता है pHluorins भी एसवी और प्राथमिक neuronal संस्कृति में exocytosis endocytosis की निगरानी करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. ये जांच खलनायिका, synaptophysin और VGLUT1 18 के रूप में टैग एसवी प्रोटीन की luminal डोमेन के पीएच पर्यावरण के लिए एक pH-संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग एसवी पूल जुटाना 19 के दोनों और कैनेटीक्स हद तक रिपोर्ट कर सकते हैं. एफएम डाई आधारित दृष्टिकोण यहाँ वर्णित pHluorin तकनीक पर कुछ फायदे हैं, सबसे पहले, एफएम रंजक जानकारी है जिस पर एसवी endocytosis मोड RRP और रिजर्व 8 पूल replenishes प्रदान करते हैं. दूसरे विशिष्ट एसवी पूल एफएम रंजक है कि विभिन्न वर्णक्रमीय गुण है 20 और अंत में वहाँ अभिकर्मक के लिए कोई आवश्यकता नहीं है के साथ लेबल किया जा सकता है. एफएम रंजक आराम और एसवी पूल लेकिन रीसाइक्लिंग (19 pHluorins विपरीत) के बीच एसवी यातायात पर जानकारी उपलब्ध नहीं है, परिभाषा SVS द्वारा के बाद से डाई के साथ दिखाई जा endocytosis के दौरान लोड कर सकते हैं. इस प्रकार दोनों एफएम रंजक और pHluorins शक्तियों और कमजोरियों है और सबसे शक्तिशाली जब स्वतंत्र प्रयोगों में उपयोग करने के लिए एक ही सवाल को संबोधित कर रहे हैं.

उच्च गुणवत्ता छवियों मान्य विश्लेषण और reproducib के लिए आवश्यक हैंले परिणाम. जबकि क्षैतिज बहाव आसानी से सुधारा जा सकता है है, प्रयोगों जहां Z-अक्ष में एक बहाव है बरामद नहीं किया जा सकता है. इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है S1 और S2 unloads शुरू करने से पहले छवियों को फिर से ध्यान केंद्रित. मामलों में जब एक महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट क्षय हुआ है, क्षय सुधार लागू किया जा सकता है (आमतौर पर एफएम लोड कोशिकाओं से उत्तेजना के अभाव में पहले से दर्ज ट्रेस subtracting द्वारा). हालांकि, यह सुझाव दिया है कि क्षय सुधार ग्राफिकल प्रतिनिधित्व नहीं है और किसी भी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा के लिए ही किया जाता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम वेलकम ट्रस्ट (रेफरी: 084277) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera Carl Zeiss, Inc. 4265099901000
Axio Observer.A1 Microscope Carl Zeiss, Inc. 4310040000000
Cell culture plates (6 wells) Greiner Bio-One 657160
Centrifuge (Universal 32R) Hettich Zentrifugen 1610
CO2 incubator Heraeus Instruments 51014042
Falcon tubes (15/50 ml) Greiner Bio-One 188271/210261
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective Carl Zeiss, Inc. 4401459901000
Glass coverslips (25mm) VWR international 631-1584
Glass pasteur pipettes (230 nm) Greiner Bio-One 612-1799
Haemocytometer VWR international 15170-170
Imaging chamber Warner Instruments RC-21 BRFS
Laminar flow hood BIOHIT VLF BHS 1200
McIlwain Tissue Chopper Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. MTC/2
Mercury lamp Carl Zeiss, Inc. HBO 103
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) Digitimer Ltd. D330
Perfusion pump Watson-Marlow Pumps Group 313S
Serological Pipettes (5/10/25 ml) Greiner Bio-One 606180/607180/760180
Shutter controller Carl Zeiss, Inc. MAC5000
Syringe (20 ml) BD Biosciences ST01-B002
Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) Sartorius AG 16532
VC-6 Six Channel valve controller Warner Instruments 64-0135
YFP Filter set (Set 46) Carl Zeiss, Inc. 1196-681
Table 1. Specific equipment and apparatus used
FM1-43 Cambridge BioScience BT70021 10 μM
FM2-10 Cambridge BioScience BT70044 100 μM
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7886 15 μg/ml
Silicone grease Sigma-Aldrich 85403 -
Table 2. Specific reagents used
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503 0.3%
D-Glucose Sigma-Aldrich G5767 0.25%
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2773 1.5 mM
D-PBS GIBCO, by Life Technologies 21300 960 mg/100 ml
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Solution B 19 ml
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich T9201 1 ml
Table 4. Solution T for CGN preparation
Solution C 3.2 ml
Solution B 16.8 ml
Table 5. Solution W for CGN preparation
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich D5025 0.5 ml
MgSO4· 7H2O Sigma-Aldrich M2773 1.5 mM
Solution B 10 ml
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich T9003 0.5 ml
Table 6. Solution C for CGN preparation
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503 4%
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) GIBCO, by Life Technologies 24010 10 ml
MgSO4· 7H2O Sigma-Aldrich M2773 3 mM
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * Sigma-Aldrich C1768 10 μM
F–tal Bovine Serum GIBCO, by Life Technologies 10106 10 %
D-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126 2 mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 25 mM
Minimal Essential Medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 21090 500 ml
Penicillin (P)/Streptomycin (S) GIBCO, by Life Technologies 15140 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S)
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
AxioVision Rel. Carl Zeiss, Inc. 4.8
ImageJ National Institutes of Health 1.42q
Microsoft Excel Microsoft 2003
Table 9. Specific computer software used
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C7902 1.3 mM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 5 mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 3.5 mM
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 0.4 mM
MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich M0250 1.2 mM
NaCl Fluka 71378 170 mM
NaHCO3 Fluka 71627 5 mM
Na2SO4 VWR 10264 1.2 mM
TES Sigma-Aldrich T1375 20 mM
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)

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References

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