使用调频染料培养的小脑颗粒神经突触小泡池补充的定量分析

Neuroscience
 

Summary

描述一个生活的荧光成像技术,量化的补给和动员特定的突触小泡(SV)池,在中央的神经末梢。两轮的SV回收进行监控,在相同的神经终端提供内部控制。

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Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes. J. Vis. Exp. (57), e3143, doi:10.3791/3143 (2011).

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Abstract

在中央神经末梢释放神经递质后,状态变量的内吞作用迅速检索。检索状态变量,然后重新填充的神经递质和归队回收池,作为状态变量定义的胞 1,2 。回收池,一般都可以分为两个不同的池 - 易释放池(RRP)和储备池(RP)。顾名思义,定价由是立即融合的状态变量,而RP的状态变量被释放在强烈的刺激 1,2只。重要的是有一个可靠的检测报告这些SV池差增资,以了解1)状态变量通车后不同模式的内吞作用(如网格蛋白依赖的内吞作用和活动依赖大量的内吞作用)和2)的机制如何调动双方的定价和RP控制在不同的刺激的反应。

定期聘请调频染料定量报告中央神经末梢的SV营业额3-8。他们有疏水性烃类尾气的,允许在脂双层的可逆分区,横跨膜和亲水性头组块通过。很少在水溶液中的荧光染料,但在 9分区时,其量子产率显着增加。因此,调频染料跟踪积极回收状态变量的理想荧光探针。调频染料使用标准的协议如下。首先,它们是适用于神经元和期间内吞作用(图1)。非内化后的染料从质膜,内回收池回收状态变量重新分配冲走。这些状态变量,然后使用卸载刺激(图1)耗尽。由于调频染料状态变量的标签是量子 10,由此产生的荧光下降释放囊泡数量成正比。因此,状态变量的回收和融合产生的PRevious轮内吞作用,可以可靠地量化。

在这里,我们提出了一个已被修改,以获得两个额外的信息内容的协议。首先,连续装卸刺激差异卸载定价和RP,让量化具体的SV池增资。其次,每一个神经末梢,两次经过协议。因此,在S1相同的神经末梢的反应可以比较一个阶段S2(图2)的测试物质的存在,提供了一个内部​​控制。这一点很重要,因为SV在不同的神经末梢循环再造的程度是高度可变的11。

可能对本协议中使用的任何附着的初级神经元文化,但电镀密度,解决方案和刺激的条件进行了优化小脑颗粒神经元(CGNS )12,13。

Protocol

1。小脑颗粒神经元的制备

  1. 高压灭菌约100直径25毫米的盖玻片(见表1)。
  2. 在50毫升无菌无菌聚D -赖氨酸溶液(见表2)管放置盖玻片。广场上为2小时到涂层的盖玻片的旋转平台。
  3. 干涂层盖玻片,在层流罩(见表1)消毒纸巾。
  4. 可以储存在4 ° C放置盖玻片进入无菌6孔板和温暖在二氧化碳培养箱(见表1)。 盖玻片在使用前1个月
  5. 安乐死7天的老只大鼠小狗根据当地的伦理委员会的指引。我们使用颈椎脱位安乐死幼仔。
  6. 剖析小脑和放置在无菌培养皿菜含有磷酸盐缓冲盐溶液(溶液B,表3)。
  7. 重复步骤4-6幼鼠1.5和1.6。
  8. 小脑,然后放在一个McIlwain组织赵无菌阶段PPER(见表1)。组织切碎通过90 °的旋转舞台,并重复这个过程之前,在375微米的间隔。
  9. 切碎的小脑被转移到一个胰蛋白酶溶液(溶液T,表4)以前被加热到37 ° C。
  10. 孵育小脑在37 ° C为20分钟,轻轻搅拌,大约每5分钟。
  11. 在胰蛋白酶消化,火焰波兰三个无菌玻璃滴管(见表1)使用本生灯火焰。使用火焰创建移液器各自的嘴巴一个罚款孔,一个中等口径和大口径。
  12. T溶液中20分钟孵化后,加入20毫升一个胰蛋白酶/ DNA酶抑制剂的解决方案(解决方案瓦,表5)小脑悬浮和沉淀细胞在台式离心机1分钟(见表1)1000
  13. 弃上清,重悬在1.5毫升集中胰蛋白酶/ DNA酶抑制剂(溶液C,表6)使用最广泛的孔吸管的细胞沉淀。
  14. 这是关键的一步,必须在这个阶段的同质暂停。
  15. 层的细胞悬液10毫升上一个预热(37℃)牛血清白蛋白补充Earles平衡盐溶液15毫升无菌管(表7)。
  16. 离心5分钟,暂停在1500 和悬浮预热MLS 2细胞沉淀(37℃)培养基(表8)。
  17. 估计使用血球(见表1)细胞数量和细胞悬液稀释到最终密度3.3 × 10 6细胞每毫升。
  18. 细胞是镀加入75μL的细胞悬液,以D -聚赖氨酸包被盖玻片(最终密度为2.5 × 10 5)的中心。
  19. 二氧化碳培养箱含有盖玻片的培养皿放置60分钟,让一个在细胞dhere。
  20. 每口井照顾,不要打扰镀细胞,并返回 CO 2培养箱培养板中加入培养基1.5毫升。
  21. 次日更换新鲜培养与有丝分裂抑制剂阿糖胞苷(表8)培养基中培养液中。 逮捕这种文化中的神经胶质细胞扩散。

2。实验装置

  1. 应包括以下基本实验装置(使用特定的设备和软件,见表1和表9):
    • 倒外延荧光显微镜
    • 冷却CCD相机
    • 荧光光源(单色或滤光轮)
    • 重力灌注设备
    • 与平行的铂电极影像室
    • 起搏器
    • 计算机
    • 图像采集软件
  2. 实验应在黑暗中或红色光COND下itions最小样品的荧光照明,以避免调频染料褪色。
  3. 实验是在室温下进行。如果是必需的生理温度,温度控制灌注系统也可使用。

3。样品制备

  1. 文化应采用体外后8-12天。
  2. 传输一个单一的盖玻片,在室温下10分钟的盐水(表10),以便在新的中期稳定。
  3. 取出盖玻片,干其底面和周边地区的小块用纸巾或吸水纸贴壁细胞。
  4. 使用硅脂(见表2),胶水盖玻片成像室的下部。细胞之间应该是两条平行线。应使用足够的硅脂完全密封腔,但没有任何油脂进入中心的洗浴室。
  5. 轻轻地填补了沐浴室〜260μLSA行的解决方案,然后填写相同的解决方案输入管。
  6. 清洁盖玻片室顶部与硅脂胶密封。输入和输出管道可用于被困在会议厅内,以消除任何空气气泡。 重要的是,气泡不中断电路
  7. Immobilise在不锈钢平台的成像室,轻轻灌注生理盐水溶液通过输入管泄漏检查。
  8. 山倒置显微镜阶段的组装室,和重力灌注系统连接室,先催芽与盐溶液的入口。
  9. 连接电刺激室的电线连接。
  10. 添加浸油下降的目标,如果使用油镜头。在使用亮场照明分中焦点细胞。

4。 S1期

  1. 灌注神经元与1.5毫升盐水稀释调频染料(见表2)。
  2. 使用的附加刺激,刺激神经元,以唤起染率。
  3. 刺激后,2分钟,用新鲜盐水灌注神经元,洗去多余的染料调频(流量为7毫升/分钟)。CGN文化系统中的胶质污染低于 5%14,因此这段时间内是足以消除染料。
  4. 保留神经元休息8分钟。
  5. 在此期间,找到个人FM染料加载神经末梢可见荧光波长(激发,480 nm处,发射,550 nm处)的轴突网络。避免细胞群的地区。保持照明至少在这一步,因为强烈的激励可以导致染料的光毒性。 这种明显的迹象是出泡轴突和缺乏的染料卸载(由于染料固色)。
  6. 立即重新聚焦图像,图像采集前,因为有轻微的漂移可能都发生在休息时间。 开始时间推移,每4秒1帧的速度图像采集
  7. 获取5 - 10个基准图像后,唤起人们提供2秒(60个动作电位)8 30赫兹刺激的胞吐的定价手动立即开始帧捕获后的刺激。
  8. 后获得另外10张图像,唤起对RP的SV胞吐为10秒(400个动作电位)40赫兹的刺激,每30 ,除了8。
  9. 获得另外5 - 10图像,然后暂停图像采集。

5。恢复阶段(见图2)

  1. 允许的神经细胞恢复至少20分钟。
  2. 可选 -如果一种药物的内吞作用的影响进行测试,与药物溶液灌注神经元在此期间(图2b)3,8

6。 S2期

  1. 重复使用相同的视野,为控制实验S1阶段协议(第4)在S1。
  2. 可选 -如果一种药物的内吞作用的影响进行测试,灌注辅以FM染料(图2b)3,8的药物溶液中的神经元。
  3. 可选 -胞吐作用的药物的影响,或者,如果感兴趣的是,与药物溶液灌注神经元的定价和RP的装卸刺激(图2c)3之前和期间。

7。数据分析

  1. 使用ImageJ和Microsoft Excel或类似的软件进行数据分析。
  2. 在堆栈格式的图像序列进行分析,是必需的。一些图像处理软件可导出为单个图像序列。如果是这样的情况下,转换图像堆栈使用一个ImageJ内置函数图像>书库>图片堆叠。
  3. 堆栈调整亮度和对比度,以最大限度地提高动态范围图像>调整>亮度/对比度 (图3a) 。
  4. 如果发生在T显著横向漂移他的实验, 运行 StackReg http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) TurboReg http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/)ImageJ插件对齐图像堆栈(图3b ) 。
  5. 运行时间系列分析仪插件( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html )(图3c)。
  6. 定义了至少90神经末梢地区的利益(投资回报)​​。这些应该是相同的(直径为1.5微米的圆形的ROI)是有帮助的图像之间的切换前后染料装卸透露积极的神经末梢(或者一个预刺激的图像可以从刺激后的图像中减去)一个理想的投资回报率的大小是一个比一个典型的神经终端 (图3c)
  7. 获得每个ROI /综合荧光强度超过添E和导出到Microsoft Excel(图3d和4a)。
  8. Normalise的投资回报率的痕迹相同的任意值调整为先卸载在S1和S2两个阶段的刺激(图4B - C)在Y轴的平面的痕迹,这是为了控制背景荧光强度的微小变化。
  9. 测量荧光的绝对减少,在S1和S2如下(图4d)的任意荧光单位的每个装卸刺激诱发:
    • 定价=荧光变化(ΔF)30赫兹2秒触发
    • RP =ΔF萨姆3 × 40赫兹10秒触发
    • 总回收池=定价+ RP
  10. 对于每个在7.9的相关参数,计算平均值,一次实验中所有的神经末梢。
  11. 进行统计分析,意味着可以从多个独立的实验中获得的值平均。而不是数量的神经末梢盖玻片应作为STATISTICA升北路

8。代表性的成果:

一个对照实验,其中CGNS经历了两轮相同的装卸步骤是在图5表示。当开始了一系列的实验,它是必不可少的,像这样的控制实验是每天执行确认S1和S2前不同实验条件下,在S2的相媲美。

在这个例子中,装有10微米使用80赫兹10秒刺激(图5a)FM1 -​​ 43 CGNS。图5b显示FM1 -​​ 43 -加载的神经,以荧光灯puncta为代表的终端。投资回报率超过90神经末梢定义在图5c所示。用于S1和S2的投资回报率相同。在这两种卸载,定价是先卸载30赫兹(2)反相卸载连续3 40Hz的刺激(10)(图5a)刺激。在每个刺激的荧光下降可以清楚地观察和量化(图5d - E)。检查时,相应的定价荧光滴,RP和总回收池S1和S2相媲美。此外,回收状态变量的20%居住在的定价,而80%的RP居住在S1和S2。

图1
图1一个典型的FM实验示意图 。一)SV的内吞作用是触发FM染料(绿色表示)的存在。染料是内陷膜(单颗或批量内涵体)。乙)非内在质膜上的染料灌注冲走。 c)在应用程序卸载刺激标记SVS,已成为释放造成损失的荧光与血浆膜的导火索的。四)在荧光(ΔF)发布的标示为状态变量的数量成正比的变化,然后可以量化。

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图2可能的实验方案的示意图。一)控制实验的细胞进行两个回合调频染料装卸(S1和S2)的流程图。细胞可以加载使用各种不同的刺激。卸载步骤是相同的​​,定价是2秒与30赫兹卸载的反相其次卸载使用第10号第3次40赫兹定价和储备库装卸刺激相隔40秒,所有其他的刺激,30秒。左细胞恢复为S1和S2之间的20分钟。流程图可能修改测试效果为B的一种物质)的内吞作用或C​​)胞吐也显示。相应的测试药物可以灌注在所示期间进入会议厅。

图3
显示图像J的数据分析图3截图截图一)亮度和对比度调整,二)帧对齐,C)的投资回报的选择,和D)强度值的提取,使用图像研究

图4
在Microsoft Excel中的数据分析图4截图 。截图一)导入图像J( 第一列的原始数据显示,车架号,其余各列数据,从个人的神经末梢B))S1的基准值(10帧)为任意值( 200)调整开始第一个刺激,三)调整S2基准值55帧,使用相同的协议,到S1,和D)测量使用Microsoft Excel的荧光滴。请注意,在D所示的平均跟踪是用来定义时间点前后每下降。每个ROI的荧光滴的大小应确定在C所示的电子表格上的值

图5 图5。代表控制实验。一)CGNS被载入10μMFM1 -​​ 43使用80赫兹(10秒)刺激的对照实验流程图。 S1和S2阶段是相同的。定价和储备库装卸刺激相隔40秒,所有其他的刺激,30秒。 b)在图像显示神经末梢加载FM1 -​​ 43。三)与B相同的图像显示90编号的投资回报进行分析选择。 d)在选定的时间点在B红色框描绘一个地区的图片。前基底=刺激; 30赫兹= =后每40赫兹10秒刺激后,30赫兹2秒的刺激; 40赫兹1,2,3。这些图像中伪荧光的变化来说明(频谱显示在右边栏)。 E)平均± SEM跟踪从90 C.个人刺激神经描绘终端获得单杠代表。比例尺= 10微米。

Discussion

调频染料被广泛用于研究在许多神经制剂的神经末梢功能。他们已受聘主要监察或SV的内吞作用,的SV营业额或胞 6动力学的程度。所描述的协议扩展了这些研究,探讨差卸载特定的SV池。这提供额外的信息有关的SV池的补水和他们的动员程度。

调频染料可用于多轮的SV回收范围内的标签相同的神经末梢。我们利用此属性和设计,其中SV在每一个终端的营业额可在同一神经末梢两次监测的协议。这提供了一个准确的内部控制,这是必不可少的,由于异质性的SV回收并行神经末梢11。通过使用作为内部控制的S1阶段,加气站的定价,RP和总SV药物池,可以比较可靠和直接。

除了提供回收的绝对大小的信息,定价和RP池不同的刺激条件下,该协议还可以提供下列资料 - 1)之间的定价和RP的状态变量作为一个回收池的功能分区S1和S2,2)总S1回收池和3)任何定义S2在S1相同的池功能的SV池的相对大小的功能(定价和RP)的S2池的相对大小。这种特殊的协议不会提供有关卸载动力学的信息不过,因为采集时间太慢(动能测量的采集时间应尽可能和卸载自动同步图像采集快速)。

我们30赫兹2秒的刺激唤起定价相同程度装卸高渗蔗糖8。由于定价的大小是由高渗蔗糖卸载15定义,我们可以这个协议卸载所有定价状态变量,在16个海马神经元的研究协议。储备库3 400刺激(40赫兹10秒),因为这刺激卸载相同的染料量范式(2 50毫米氯化钾刺激),耗尽所有染料标记的状态变量的95%的列车几乎完全耗尽8,17。准确的定量定价和储备库的大小还依赖于线性CCD相机的动态范围内获得的信息。

这个简单的协议,也可以进一步修改。装货刺激的强度,也可以是多种多样的,以确定神经元的活动和不同的内吞作用模式影响SV池补水。此外,也可以进行装卸大于两个周期,如果需要的话。此协议也可使用或者过度表达或转染细胞shRNA的载体。由于转染效率低的初级神经元文化,表达的蛋白质必须与荧光蛋白标记。它是必不可少的,这些荧光标记不与染料的调频信号干扰(例如,使用青色或红蛋白)。在这种情况下,在相同的视野转染和未转染细胞的神经末梢,也可以作为一个额外控制8相比。在这种实验中的S1和S2之间的负载加载程度的比较是没有什么价值,因为目前在两个负载扰动。 SV池之间的染料分区仍然可以进行可视化不过 8 。

遗传记者称为pHluorins也可以监测初级神经元文化的SV胞吐和内吞作用。这些探头使用pH敏感的绿色荧光蛋白的管腔域的标签,如鞋面,突触 VGLUT1 18的SV蛋白的pH值环境19动力学和程度。调频染料为基础的方法这里描述在pHluorin技术的一些优点,首先,调频染料提供信息SV内吞作用模式的补充定价和储备 8 。其次具体SV池可与具有不同的光谱特性 20年,最后没有要求转FM染料标记。不能提供调频染料之间的休息,但是回收的SV池(对比pHluorins 19)的SV交通信息,自定义状态变量与染料期间加载的内吞作用是可见的。因此FM染料和pHluorins的长处和短处,并在独立实验中使用,以解决同样的问题时,是最强大的。

高品质的图像是必不可少的有效的分析和reproducib乐的结果。虽然可以很容易地纠正横向漂移,那里是一个在Z轴漂移的实验无法恢复。出于这个原因,重要的是重新集中开始前S1和S2卸载的图像。时发生的情况下,一个显著的荧光衰变,衰变更正可应用于(通常是由减去先前记录的跟踪,从FM加载细胞刺激的情况下)。然而,这是建议,图形表示和不被用于任何定量分析进行衰减校正。

Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

这项工作是从威康信托基金(编号:084277)赠款支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera Carl Zeiss, Inc. 4265099901000
Axio Observer.A1 Microscope Carl Zeiss, Inc. 4310040000000
Cell culture plates (6 wells) Greiner Bio-One 657160
Centrifuge (Universal 32R) Hettich Zentrifugen 1610
CO2 incubator Heraeus Instruments 51014042
Falcon tubes (15/50 ml) Greiner Bio-One 188271/210261
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective Carl Zeiss, Inc. 4401459901000
Glass coverslips (25mm) VWR international 631-1584
Glass pasteur pipettes (230 nm) Greiner Bio-One 612-1799
Haemocytometer VWR international 15170-170
Imaging chamber Warner Instruments RC-21 BRFS
Laminar flow hood BIOHIT VLF BHS 1200
McIlwain Tissue Chopper Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. MTC/2
Mercury lamp Carl Zeiss, Inc. HBO 103
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) Digitimer Ltd. D330
Perfusion pump Watson-Marlow Pumps Group 313S
Serological Pipettes (5/10/25 ml) Greiner Bio-One 606180/607180/760180
Shutter controller Carl Zeiss, Inc. MAC5000
Syringe (20 ml) BD Biosciences ST01-B002
Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) Sartorius AG 16532
VC-6 Six Channel valve controller Warner Instruments 64-0135
YFP Filter set (Set 46) Carl Zeiss, Inc. 1196-681
Table 1. Specific equipment and apparatus used
FM1-43 Cambridge BioScience BT70021 10 μM
FM2-10 Cambridge BioScience BT70044 100 μM
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7886 15 μg/ml
Silicone grease Sigma-Aldrich 85403 -
Table 2. Specific reagents used
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503 0.3%
D-Glucose Sigma-Aldrich G5767 0.25%
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2773 1.5 mM
D-PBS GIBCO, by Life Technologies 21300 960 mg/100 ml
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Solution B 19 ml
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich T9201 1 ml
Table 4. Solution T for CGN preparation
Solution C 3.2 ml
Solution B 16.8 ml
Table 5. Solution W for CGN preparation
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich D5025 0.5 ml
MgSO4· 7H2O Sigma-Aldrich M2773 1.5 mM
Solution B 10 ml
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) Sigma-Aldrich T9003 0.5 ml
Table 6. Solution C for CGN preparation
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503 4%
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) GIBCO, by Life Technologies 24010 10 ml
MgSO4· 7H2O Sigma-Aldrich M2773 3 mM
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * Sigma-Aldrich C1768 10 μM
F–tal Bovine Serum GIBCO, by Life Technologies 10106 10 %
D-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126 2 mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 25 mM
Minimal Essential Medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 21090 500 ml
Penicillin (P)/Streptomycin (S) GIBCO, by Life Technologies 15140 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S)
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
AxioVision Rel. Carl Zeiss, Inc. 4.8
ImageJ National Institutes of Health 1.42q
Microsoft Excel Microsoft 2003
Table 9. Specific computer software used
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C7902 1.3 mM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 5 mM
KCl Sigma-Aldrich P5405 3.5 mM
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 0.4 mM
MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich M0250 1.2 mM
NaCl Fluka 71378 170 mM
NaHCO3 Fluka 71627 5 mM
Na2SO4 VWR 10264 1.2 mM
TES Sigma-Aldrich T1375 20 mM
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)

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References

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