Studie av aktin cytoskjelettet i Live endotelceller uttrykker GFP-Actin

Biology
 

Summary

Mikroskopiske avbildning av levende endotelceller uttrykker GFP-aktin lar karakterisering av dynamiske endringer i cytoskeletal strukturer. I motsetning til teknikker som bruker faste prøver, gir denne metoden en detaljert vurdering av tidsmessige endringer i aktin cytoskjelettet i de samme cellene før, under og etter ulike fysiske, farmakologiske, eller provoserende stimuli.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin. J. Vis. Exp. (57), e3187, doi:10.3791/3187 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den mikrovaskulær endotelet spiller en viktig rolle som et selektivt permeabel barriere mot væske og oppløste stoffer. Limet veikryss mellom endotelcellene regulere permeabilitet av endotelet, og mange studier har indikert det viktige bidraget av aktin cytoskjelettet å bestemme junctional integritet 1-5. En kortikale aktin belte antas å være viktig for å opprettholde stabile 1 veikryss, 2, 4, 5. I kontrast er aktin stresset fiber antatt å generere sentripetal spenning i endotelceller som svekker veikryss 2-5. Mye av denne teorien har vært basert på studier der endotelcellene er behandlet med inflammatoriske mediatorer kjent for å øke endotelceller permeabilitet, og deretter fikse cellene og merking av F-aktin for mikroskopisk observasjon. Men disse studiene gir en svært begrenset forståelse av rollen av aktin cytoskjelettet fordi bilder av faste celler gir bare øyeblikksbilder itid med ingen informasjon om dynamikken i aktin strukturer 5.

Live-cell imaging muliggjør inkorporering av den dynamiske naturen av aktin cytoskjelettet inn i studier av de mekanismer avgjøre endoteliale barriere integritet. En stor fordel med denne metoden er at virkningen av ulike inflammatoriske stimuli på actin strukturer i endotelceller kan vurderes på samme sett av levende celler før og etter behandling, fjerne potensielle skjevheter som kan oppstå når observere faste prøver. Menneskelig umbilical vein endotelceller (HUVEC) er transfektert med GFP-β-aktin plasmid og vokst til sammenløpet på glass Dekkglass. Time-lapse bilder av GFP-aktin i confluent HUVEC blir fanget før og etter tilsetning av inflammatoriske mediatorer som framprovosere tidsavhengige forandringer i endoteliale barriere integritet. Disse studiene gir visuell observasjon av væske sekvensen av endringer i aktin cytoskjelettet som bidrar til endothelial barriere avbrudd og restaurering.

Våre resultater viser gjennomgående lokale, actin-rik lamellipodia dannelse og omsetning i endotelceller. Dannelse og bevegelse av aktin stresset fiber kan også observeres. En analyse av hyppigheten av dannelse og omsetning av de lokale lamellipodia, før og etter behandling med inflammatoriske stimuli kan dokumenteres ved kymograph analyser. Disse studiene gir viktig informasjon om dynamiske natur aktin cytoskjelettet i endotelceller som kan brukes til å oppdage tidligere uidentifiserte molekylære mekanismer viktig for opprettholdelse av endoteliale barriere integritet.

Protocol

1. Transfeksjon av HUVEC med GFP-aktin

  1. Ulike metoder kan brukes til å transfektere HUVEC. Våre lab bruker Nucleofector systemet (Lonza, Basel Sveits) beskrevet nedenfor. Generelt arbeide raskt for å forbedre celleviabilitet og transfeksjon effektivitet. Hver transfeksjon krever 5 x 10 5 HUVEC som vil bli seedet på to glass Dekkglass (Corning nr. 1, 22 x 50 mm). Den Nucleofector kombinerer electroporation og kjemiske reagenser til transfektere plasmid DNA, og vanligvis oppnår en> 50% uttrykk effektivitet. Kjemisk transfeksjon reagenser er en alternativ metode. En gruppe har lykkes transfektert bovine endotelceller med GFP-aktin bruker GenePORTER reagenset 6. Den Nucleofector protokoll vi bruker er beskrevet nedenfor.
  2. Presterilized cultureware eller vanlig Dekkglass kan brukes, avhengig av kammer type. For glass Dekkglass, sterilisere i en biologisk sikkerhet hette ved å plassere dem inn i en 10 cm kultur plateinneholder ca 5 ml 70% etanol for 2 min. Plukk dem opp med steril pinsett og lufttørke ved å lene seg mot siden av en egen kultur plate.
  3. Når tørr, plassere hver dekkglass i sin egen 10 cm kultur plate. Pipetter en 300 mL perle av varm gelatin løsning (1,5% i 0,9% NaCl) på midten av dekkglass og la den stå i 5 min., Og deretter aspirer. Holde denne matrisen belegget i sentrum, uten å berøre kantene, vil sikre at cellene vil bli seedet tett og vil oppnå samløpet raskt.
  4. Forbered en 1,5 mL microfuge tube per transfeksjon med 500 mL av EGM2MV media (Lonza) og sett til side i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
  5. Ta HUVEC med 0,25% trypsin-EDTA og samle inn et 15 mL konisk tube. Telle cellene. 5 x 10 5 celler er nødvendig for hver transfeksjon. Juster cellesuspensjon volum for å oppnå en pellet som skal inneholde 5 x 10 5 celler multiplisert med antall transfections skal utføres.
  6. Sentrifuger cellesuspensjonen i en klinisk sentrifuge ved 5000 rpm i 3 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten ved å vippe røret for å fjerne så mye media som mulig.
  7. Resuspender pellet med Basic Nucleofector Solution fra enten HUVEC eller Primary endotelcelle Nucleofector Kit (Lonza). Bruker 100 mL per 5 x 10 5 celler. På grunn av giftigheten av denne løsningen, er det viktig å jobbe raskt mens cellene er suspendert i denne løsningen.
  8. Legg til GFP-β-actin vektor plasmid (0,2 til 2 mikrogram per 100 mL av Nucleofector suspensjon) til transfeksjon prøven. 0,2 til 2 mikrogram GFP-aktin plasmid DNA per 5 x 10 5 celler per transfeksjon.
  9. Overfør 100 mL cellesuspensjon til en Nucleofector Cuvette. Dekk og trykk kyvetten noen ganger for å sikre at cellesuspensjonen er helt til bunnen.
  10. Plasser kyvetten i Nucleofector II apparatet kyvette spor og kjøre desired electroporation program. Vi bruker program A-034 for HUVEC.
  11. Tilbake kyvetten til biologisk sikkerhet panseret. Ta en av de microfuge rør fra 37 ° C inkubator som inneholder 500 mL av EGM2MV til hetten. Hjelp av en av overføringen pipetter gitt i Nucleofector kit, tilsett den varme 500 mL av media til cellen suspensjon i kyvetten. Overfør alt innholdet i kyvetten tilbake til microfuge tube og plass i inkubator i 15 min. å la cellene for å gjenopprette.
  12. Gjenta trinn 9-11 som nødvendig hvis flere celler skal transfektert.
  13. Ett microfuge tube inneholder 600 mL av transfektert HUVEC suspensjon kan bli seedet på to Dekkglass. Under panseret og med 1000 mL mikropipette, forsiktig pipette opp og ned en gang for å blande suspensjonen, og deretter plassere 300 mL av suspensjonen direkte på en gelatin-belagt dekkglass. Ikke la suspensjonen berøre kanten av dekkglass. Plass i 37 ° C / 5% CO 2
  14. Etter 1-4 h, inspisere transfektert cellene for å bekrefte at de har festet til dekkglass. Tilsett deretter 10 ml av EGM2MV media, og gå tilbake til plate til 37 ° C / 5% CO 2 inkubator. GFP-aktin uttrykk kan vanligvis observeres i løpet av 4-8 timer. Eksperimenter er vanligvis utføres i løpet av 24-48 t.

2. Sette opp live-cell imaging kammer og scene varmeapparat

  1. For de fleste av våre studier har vi brukt en Warner Instruments åpne diamant bath (RC22) plassert i en PH-1 trinns varmeapparat, matet av en tyngdekraften flow system. Men flere alternativer er tilgjengelige for live cell imaging stadier, inkludert kammer som rommer glassbunn kultur retter, åpne kontra lukkede kamre, og ulike microincubator / objektiv varmeapparat kombinasjoner og stor inkubator systemer. Til syvende og sist vil kammeret valget avhenger av faktorer, inkludert behovet for å få tilgang til bad for å legge til en test agent eller narkotika, Whedet mediet vil være statiske eller under flow, og lengden på forsøket. I tillegg, noen ganger faktorer som ustabil temperatur kan føre fokus drift, og kan minimeres ved styringssystemer som kan opprettholde en stabil bath og objektiv temperaturer.
  2. Delmengde nok medium for forsøket. Vi delmengde 50 ml albumin fysiologisk salt-løsning (APSS; Tabell 1) for hver time forsøket vil vare.
  3. Enten en pumpe eller tyngdekraften flow system kan brukes til å levere medium til kammeret. For vårt system, legger vi APSS til en enkel tyngdekraften-flow system bygget fra en intravenøs flow linje, koblet til en inline varmeapparat (Warner Instrumenter modell SH-27A). Vi bruker strøm på ca 40 ml / t.
  4. Dersom et åpent bad kammer som vårt vil bli brukt, gjelder vakuum fett til den ytre kanten på undersiden av diamant badet og med en bomull-tipped applikator. Deretter får vi en celle-dekket dekkglass fra inkubatoren, og forsiktig løft dekkglass bruke pinsett. Gently berører baksiden til et kimwipe å suge opp overflødig medium samtidig som celle-dekket side vått. Med cellene forsiden opp, plasserer diamond bath over dekkglass å danne et kammer.
  5. Raskt plasser i kammeret inn på scenen varmeapparat og hånd-skru klemmene over kammeret. En stor bekymring på dette stadiet er muligheten for at cellene skal tørke ut. Derfor er det viktig å jobbe raskt og når du er ferdig, umiddelbart pipette ~ 1 mL medium inn i kammeret for å hindre at cellene ikke tørker ut.
  6. Våre kammer gir jevn strøm av mediet over cellene. Like før du skrur på strømmen, er det viktig å feste et vakuum slange til holderen på kammeret for å tillate exit av overflødig kultur medium (APSS). Den inline varmeapparat og bad varmeapparat bør også være slått på dette punktet (til 37 ° C). Vårt system har også en termistor sonde til å overvåke temperatur, noe som bør plasseres på kanten av badekaret.
  7. Tørk forsiktig undersiden av coverslip med en kimwipe fuktet med 70% EtOH å fjerne gjenværende EGM2MV media og salt buildup. Tørk en gang med en tørr kimwipe eller linse papir.
  8. Etter at kammeret er satt opp, er flyt på, og temperaturen er stabil på 37 ° C, la cellene minst 30 minutter for å justere og stabilisere før du starter forsøket.
  9. Mens du venter, slå på alle komponentene i live-cell imaging mikroskop (lamper, filter hjul controller, kamera, PC).

3. Oppkjøp av data med live-cell imaging mikroskop

    • Ulike live celle mikroskopi systemer er tilgjengelig. Vårt system er et Nikon Eclipse TE-2000U med følgende komponenter:
    • Sutter Instruments Lambda LS 300 W xenon lampe
    • Sutter Instruments Lambda 10-3 eksitasjon filter hjul med SmartShutter og S492 filter (D350 og S572 eksitasjonsfilter filtre er også tilgjengelig for UV og RFP applikasjoner)
    • Dichroic 2002bs emitter (Nikon 61002m)
    • CI Plan Fluor 10X DLL Objektive, NA 0.30 (Nikon MRH10100)
    • Plan Fluor ELWD 40X DM Mål, 0.60 NA (Nikon MRH08420)
    • Plan Apo VC 100X Oil Objektive, NA 1.40 (Nikon MRD01901)
    • Fotometriske CoolSNAP HQ2 kamera, 1392 x 1040 bildebehandling array, 6,45 x 6,45 mikrometer piksler
      (Roper Scientific)
    • Vi har også to programvarepakker som kan brukes for bilde oppkjøpet. Nikon Elements-AR 3.0 og Metamorph 6.1.
  1. Etter å ha sett cellene og finne et passende område for studien, låse grovskruen og sjekke programvaren oppkjøpet innstillingene slik at:
    1. Filteret hjul er satt for S492 filter (merket "FITC" i vårt oppsett)
    2. I oppkjøpet programvare, er målet satt til å matche ønsket forstørrelse (vår mikroskop er uten motor, men dette setter mikrometer / pixel ratio). Også sørge for at optivar linsen på mikroskop er satt til 1,0 x forstørrelse. Stille optivar til 1,5 X kan øke forstørrelse, men på bekostning av å miste signal intensitet.
      Forstørrelsen som skal brukes avhenger mål av studien. For best detalj, vil en 100X objektiv med høy numerisk apertur gir best romlig oppløsning og overføring av signal. Vårt mikroskop er også utstyrt med en lang arbeidsavstand 40X objektiv beregnet for et annet program som krever den ekstra distansen. Imidlertid kan dette målet være nyttig når vi ønsker å observere flere celler samtidig, og fungerer fint for visning organelle store strukturer, men til en kostnad for å miste romlig oppløsning og signal intensitet. For enhver studie hvor signal intensitet er et endepunkt, eller for mer avanserte imaging teknikker som fluorescens speckle mikroskopi, er et 100X objektiv anbefales.
    3. Kameraet eksponeringstid ligger mellom 0,5 til 2 s. Dette avhenger av GFP-aktin intensitet i cellene. Vi bruker vanligvis lavest mulig eksponeringstid for å unngå bleaching av GFP-aktin og potensielle toksisitet til cellene.
    4. For å oppnå den beste oppløsningen, bør Binning settes til 1 x 1 og Gain på 1. I noen tilfeller har vi satt Binning til 2 x 2 for å redusere eksponeringen tid, men dette reduserer nøyaktigheten av målingene kan vi gjøre på bevegelige objekter i time-lapse studie.
    5. Konfigurer time-lapse innstillinger:
      1. Velg mappen du vil lagre bildene og skriv inn et filnavn.
      2. Still inn antall bilder og intervall varighet tider for forsøket. Vi bruker vanligvis en 15 s til 1 min intervall mellom bilder og opptil 2 timer for varigheten.
      3. Pass på at den aktive lukkeren er satt til å være stengt mellom oppkjøp.
  2. Før oppstart av time-lapse bilde oppkjøpet, slå av rommet lys og fange et enkelt bilde for å sjekke innstillingene.
  3. Også ta en lysfelt bilde. Pass på kondensatoren er satt til riktig fase eller DIC filter. Slå påhalogen lampe og samle bildet. Slå av halogen lampen.
  4. Gå tilbake til "FITC" innstillinger for time-lapse bildebehandling og fange en test bilde.
  5. Capture the time-lapse serien.
    Under eksperimentet, er det viktig å overvåke de bildene som de er ervervet. I noen tilfeller små endringer i temperaturen i kammeret kan føre fokus drift. Dette kan unngås ved å optimalisere tilsig og vakuum linjer slik at strømmen er jevn over cellene. I tillegg kan minimere trafikken i mikroskop rommet, og omdirigere trekk fra taket lufteventiler unna mikroskopet være nyttig. Et alternativ som har fungert bra i vår erfaring er bruk av 37 ° C / 5% CO 2 inkubator kammer som omslutter hele scenen og objektiv. Disse tilbyr fordelen av overvåking celler over natten eller lenger, men tilgang til cellene er begrenset.
    Hvis nødvendig, pause tid-lapse erverv og refokusere bildet. Utfør refokusere så raskt som mulig for å Unngå å endre tidsintervallet mellom bildene.
  6. En typisk protokollen vil bestå av 20-30 minutter av baseline bilder før du legger en test agenten fulgt med 0,5 til 4 timer ekstra image oppkjøpet. Lengden på eksperimentet kan være begrenset av fotobleking av GFP over tid, som er hvorfor det er viktig å velge den korteste eksponeringstiden mulig. Det kan også være ønskelig å endre intervallet mellom tid lapse bilder til 30-60 s hvis en lengre studie er ønskelig.

Fire. Dataanalyse

  1. Flere programvarepakker kan brukes til å analysere bildet settene, slik som NIS Elements, Metamorph, Slidebook, osv. Vi vanligvis utfører våre bildeanalyse med NIH ImageJ slik analyse på en datamaskin på vårt laboratorium eller hjemme. Versjonene vi bruker er:
    MBF ImageJ ( http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ )
    FIJI (i "target =" _blank "> http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji).
  2. ImageJ kan brukes til å analysere mange dynamiske prosesser, inkludert:
    • Frekvens av lamellipodia fremspring
    • Distanse, tid og hastighet fremspring
    • Actin fiber bevegelse over tid
    Nikon Elements sparer tid-lapse bilder som en "ND" filen. Slik åpner i ImageJ dette må konverteres til et TIF serie med "eksport ND dokumentet"-funksjonen. Metamorph Bildestakker kan åpnes i ImageJ uten modifikasjoner. Ett alternativ vi velger når du åpner en TIF serie i ImageJ er å konvertere til 8-bits gråskala. Dette gjør visning enklere fordi justeringer av lysstyrke og kontrast vil gjelde for hele serien i stedet for enkelt bilde som vises.
  3. I ImageJ vil når bildet satt åpner slice antall / totalt skiver vises i øvre venstre hjørne av vinduet, sammen med filnavn, antall piksler, filtype og størrelse. Z scrollbar på bunnen tilsvarer tid. I tillegg vil svever pekeren over bildet vise x, y og z pixel plassering på bunnen av ImageJ verktøylinjen.
  4. Lamellipodia protrusion kan studeres ved å bestemme antall nye utstikk over tid. Dette kan gjøres for hele cellen omkretsen eller et valgt område. Denne typen analyse kan også utføres i nonconfluent, untransfected celler med fasekontrast eller DIC mikroskopi. Men ved hjelp av celler uttrykker GFP-aktin gjør analyser av confluent monolayers, spesielt når cellene inneholder og mangler GFP-aktin er ved siden av hverandre.
  5. Lamellipodia protrusion avstand, utholdenhet (tid), og hastigheten kan vurderes ved kymograph (linje scan) analyse. Tegn en linje vinkelrett på kanten av en celle (dette er enklest hvis det ikke er tilstøtende celle, eller den tilstøtende cellen uttrykker ikke GFP-aktin). I ImageJ, trykke på "/" vil generere en kymograph, med x-aksen representerer distance og y-aksen representerer tid (15 s til 1 min per piksel i henhold til tidsintervallet retningslinjene ovenfor). Linjer kan trekkes over en utstående lamellipodia og boksen dimensjonene måles (ved å trykke på M i ImageJ). Avstanden, tid og hastighet kan da beregnes.
  6. Bevegelsen av stress fiber kan også måles ved kymograph analyse på en lignende måte.

5. Representant Resultater:

Med vår transfeksjon protokollen vi vanligvis ser uttrykk for GFP-aktin i minst 50% av HUVEC transfektert, og ofte kan finne områder på dekkglass der> 90% av HUVEC i regionen uttrykker GFP-aktin. Et eksempel på en live-cell imaging eksperimentere med subconfluent HUVEC uttrykker GFP-aktin er vist i Movie 1. For denne spesielle forsøket, var et bilde anskaffet en gang per minutt. Som kan sees i filmen, GFP-aktin i HUVEC kan observeres gjennom hele cytoplasma, samt i filamentous structtiltak og i lokale lamellipodia utstående langs cellen kanten. Også tydelig i filmen er at GFP-aktin uttrykket er ikke ensartet mellom celler. Celler som er valgt for studiet har vanligvis nok GFP-aktin stede for å visualisere ulike strukturer som inneholder trådformede aktin. Celler som uttrykker svært høye nivåer av GFP-aktin kan være problematisk for studier fordi i disse cellene er det vanligvis vanskelig å skille F-aktin strukturer fra det høye antallet G-aktin stede.

Movie 2 viser et eksempel på oppførselen til confluent HUVEC uttrykker GFP-aktin. I likhet med subconflent HUVEC, var aktiv lamellipodia dannelse og omsetning langs utkant cellene tilsynelatende. Men disse lamellipodia ofte ga opphav til membran ruffles, som indikerer mindre effektiv protrusion 7. Dette er trolig på grunn av tilstedeværelsen av tilstøtende celler blokkerer nærliggende undergrunnen. Aktin kortikal fiber og stress fiber er også synlig i Movies 1 og 2. Selv om cellene vi observed forble stasjonære, stress fibrene ligner på tverrgående arc fibre i migrere celler, forming nær cellen kanten og beveger seg sideveis mot cellen senteret der de demontere 8, 9. En ytterligere dynamisk funksjon observert i disse cellene var dannelsen av aktin ring strukturer som utvidet konsentrisk, tidligere kalt actin skyer 10.

Et eksempel på hvordan avstanden, utholdenhet og hastighet av celle utstikkere er kvantifisert fra disse time-lapse bilde settene bruker kymograph analyse er vist i figur 1. I figur 1A, er én pixel linje trukket omtrent vinkelrett cellen kant for generering av et kymograph (Figur 1B). I denne kymograph, er regionen defineres av linjen plasseres vertikalt og bilder fra hele time-lapse er stablet horisontalt. Ser fra venstre til høyre i kymograph er fremspring representert som oppadgående bevegelser i kanten av cellen. I figur 1C, var en linje støtteerimposed på kanten av en av disse fremspring, og pixel data knyttet til at linjen ble samlet inn og vises i resultatene vinduet nederst i panelet. Denne analysen gir kvantifisering av protrusion dynamikk, og kan også brukes til å estimere protrusion frekvens (antall utstikkere / tid) i denne regionen av cellen.

Et eksempel på analyse av stress fiber bevegelse er vist i figur 2. Mest stresset fiber vi observerte dannet nær cellen periferi og flyttet mot cellen sentrum, hvor de til slutt demontert. Dette kan også kvantifiseres ved kymograph analyse. En linje er trukket vinkelrett på celle kant og til stress fibre (Figur 2A) og en kymograph genereres (figur 2B). Stress fiber vises som sammenhengende linjer i det cytoplasmatiske området i kymograph, ofte på vei ned og til høyre (mot cellen sentrum). Noen ganger fibrene er vanskelig å se i den opprinnelige kymograph, og i disse tilfellene vibruke unsharp mask filter for å gjøre bildet skarpere (Figur 2C). Linjene er tegnet på stress fiber og pixel data er samlet inn ved hjelp tiltakets funksjon (Figur 2D). En alternativ måte å samle inn disse dataene er å trekke en linje fra start til slutt av de identifiserte stresset fiber for å få gjennomsnittet skråningen for varigheten at fiber ble observert (Figur 2E). Denne analysen gir kvantifisering av stress fiber sideveis bevegelse og kan også brukes til å kvantifisere antall av stress fiber observert i denne regionen av cellen.

Figur 1
Figur 1. Kymograph analyse av cellen kanten å bestemme protrusion avstand, utholdenhet og hastighet av lokale lamellipodia. A. En enkelt piksel linje er trukket omtrent vinkelrett på kanten av cellen. Denne regionen er hentet fra hvert bilde av time-lapse satt til å generere en montasje av regionen over tid. B. I the resulterer kymograph representerer x-aksen tid, går fra venstre til høyre, og y-aksen viser avstanden. Bevegelse av cellen kanten over tid kan bli vurdert i denne kymograph, og lamellipodia er identifisert områder der cellen kanten, flytting rightward går oppover. C. En linje er trukket på cellen kanten der en utvekst av en lamellipodium har blitt identifisert. Dimensjonene på markeringsrammen rektangelet for linje trukket blir deretter kjøpt (vist i oppå vindu). Bredden blir brukt til å beregne protrusion tid eller utholdenhet. Høyden brukes til å beregne protrusion avstand. Utstikket hastighet beregnes ved å dele høyden ved bredden. I dette eksempelet, ble den oppadgående avstanden 96 piksler x 0,16125 mikrometer / pixel = 15,5 mikrometer, og tiden var 11 piksler x 1 min. / pixel = 11 min. Hastigheten ble beregnet til 15,5 μm/11 min. = 1,4 mikrometer / min.

Figur 2
Figure 2. Kymograph analyse av bevegelse av aktin stresset fiber. A. En enkelt piksel linje trukket vinkelrett på kanten av cellen til å generere en kymograph. B. Som vist i fig. 1, i den resulterende kymograph representerer x-aksen tid og y-aksen avstand. Stress fibre blir observert som sammenhengende linjer i cellen, ofte går nedover og til høyre (piler) C. For bedre å visualisere stress fiber, kan unsharp mask filter brukes. I dette eksempelet var en radius på 3 piksler og maske vekt 0.60 brukes. D. Enkelt piksel linjer blir deretter trukket over identifiserte stresset fiber, og data samles inn. I dette panelet tre linjer ble trukket og deretter "slett" ble trykket for å lage en permanent kommentar (hvit linje) av sine plasseringer etter hver måling. E. Alternativt, hvis gjennomsnittlig distanse, tid og hastighet av stress fiber er ønskelig, kan en linje trekkes fra start og slutt poeng (gul linje), og dataene forr som kan erverves (uthevet i resultatlisten vindu). For dette eksempelet, ble målinger gjort på dette stress fiber for 37 frames x 1 ramme / min. = 37 min. Avstanden reiste over denne tidsperioden var 75 frames x 0,16125 mikrometer / pixel = 12,1 mikrometer. Den resulterende lateral hastighet av stress fiber var 12,1 μm/37min = 0,33 mikrometer / min. En positiv verdi for hastighet er tildelt for fiber beveger seg mot cellen sentrum, og negativt for fiber beveger seg mot periferien.

Movie 1. Time-lapse bilder av levende HUVEC uttrykker GFP-aktin. Intervallet mellom bilder er 1 min. Lokale lamellipodia stakk langs hele omkretsen av celler. I tillegg flyttet tverrstilt arc stresset fiber lateralt mot midten av cellene. Når trombin (1 U / ml) ble lagt til badet, avtalte cellene litt og ytre fremspring av lamellipodia pause i ca 10 min. Etter at cellene kontrakt, lamellipodia dannelse og omsetning gjenoppta d. Klikk her for å se filmen.

Movie 2. Confluent HUVEC uttrykker GFP-aktin, før og etter behandling med trombin. Medgått tid vises nederst i høyre hjørne som minutter: sekunder. Intervallet mellom bilder er 30 s. Trombin (1 U / ml) ble lagt inn etter 45 min. baseline periode. Annotated hendelser inkluderer lokale lamellipodia dannelse og omsetning (pilspisser nær celle kanter, 00:59 - 37:29), actin skyer (piler, 01:59-21:29), og et gap på en tricellular knutepunkt som utvider etter trombin er lagt (pil, 62:30 - 70:00). Tverrgående arc stresset fiber er også tydelig i flere av cellene. Cellene viste aktiv dannelse og omsetning av lokale lamellipodia langs sin utkant, med mange som gir opphav til membran ruffles. Trombin forårsaket en pause i lamellipodia formasjon og omsetning, og kort opptreden av noen små hull mellom celler.http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi "> Klikk her for å se filmen.

Discussion

Den avbildning av GFP-aktin i live endotelceller muliggjør en detaljert analyse av dynamikken i aktin cytoskjelettet i respons til inflammatoriske stimuli. Denne metoden kan også være nyttig å bygge videre på tidligere funn som viser ombygging av cytoskjelettet i respons på fysiske krefter som skjærspenning 11. I tillegg gir denne metoden en detaljert vurdering av bidraget fra aktin cytoskeletal dynamikk til ulike endotelcelle aktiviteter, blant annet migrasjon, mitose, dannelse av intercellulær veikryss og junctional modning, og vedlikehold av barrierefunksjon.

I data vises, kan atferden til endotelial aktin cytoskjelettet observeres før og etter behandling med trombin. Lokale lamellipodia langs kantene av endotelceller ble observert forming og tilbakegang over tid i både nonconfluent og confluent celle monolayers. Behandling med trombin kort avbrutt lamellipodia skjemaasjon og omsetning. Trombin også forårsaket cellene til kontrakt litt, i enighet med tidligere rapporter som trombin forårsaker actin stresset fiber dannelse og økt sentripetal spenning utvikling i endotelceller 12-14. Men fra levende celle imaging studier som dette, kan opprinnelsen til stress fiber nå bestemmes. I HUVEC, de fleste av stress fibrene kommer på cellen periferien og ligner tverrgående arc fibre i migrere celler 8, 9. En annen styrke med denne metoden enn ved hjelp av faste celler er at antallet av stress fibre kan kvantifiseres i individuelle celler før og etter trombin behandling, eliminerer utvalg skjevhet mellom eksperimentelle grupper.

Med denne protokollen evaluerer vi dynamisk bevegelse av cellen kanten og aktin stresset fiber. For å forstå aktin monomer dynamikk i endotelceller, mer avanserte teknikker som fluorescens recovery etter fotobleking (FRAP) eller fluorescens speckle MICROSkopi (FSM) kan brukes 15, 16. I tillegg, fordi mikrovaskulære endotelceller kan representere en bedre modell av mikrovaskulær barrierefunksjon, optimalisering av transfeksjon protokoller for effektivt å uttrykke GFP-aktin i mikrovaskulære endotelceller representerer en logisk fremtidige retning.

I sammendraget, representerer avbildning av levende endotelceller uttrykker GFP-aktin et kraftig verktøy for å bestemme hvordan endotelcelle aktin cytoskjelettet reagerer på ulike typer stimuli. Studier med tett confluent endotelial monolayers vil bidra til å bestemme rollene av dynamiske strukturer som aktin-rik lamellipodia og tverrgående arc stresset fiber i endotelial barrierefunksjon. I tillegg vil leve celle avbildning av endotelceller uttrykker GFP-aktin eller andre fusjon proteiner som tillater visualisering av andre subcellular strukturer gi detaljert i tid og rom nødvendig informasjon for å forstå signalering og strukturelle mekanismer som determine barriere integritet.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Den GFP-β-actin plasmid ble generøst gitt av Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Avdeling for patologi, og ble forsterket i laboratoriet av Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Institutt for farmakologi. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (P20 RR-018766) og American Heart Association (05835386N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Ringer 5x Stock
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-3 35 g
Potassium Chloride JT Baker 3040 1.75 g
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C-3881 1.47 g
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M-9397 1.44 g
Sterile Filtered Water N/A N/A Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
2. MOPS buffer
MOPS Sigma-Aldrich M3183 125.6 g
Sterile Filtered Water N/A N/A Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Ringer stock (5x) N/A N/A 200 mL
Mops Buffer N/A N/A 5 mL
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S-9638 0.168 g
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 0.22 g
EDTA sodium salt Sigma-Aldrich ED2SS 0.0074 g
Glucose Sigma-Aldrich G7528 0.901 g
Albumin, Bovine USB Corp., Affymetrix 10856 10 g
Sterile Filtered Water N/A N/A Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C.
4. 0.9% Saline
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-3 9 g
Sterile Filtered Water N/A N/A Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C
5. 1.5 % Gelatin Solution
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 15 g
0.9% Saline N/A N/A Bring to 1 L
Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. Role of GTPases in control of microvascular permeability. Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).
  2. Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability. Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).
  3. Yuan, S. Y. Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability. Microcirculation. 7, 395-403 (2000).
  4. Birukov, K. G. Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier. Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).
  5. Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. Handbook of Physiology: Microcirculation. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).
  6. Hu, Y. L., Chien, S. Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).
  7. Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization. Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).
  8. Hotulainen, P., Lappalainen, P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).
  9. Pellegrin, S., Mellor, H. Actin stress fibres. J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).
  10. Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin dynamics in living mammalian cells. J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).
  11. Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells. Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).
  12. Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction. Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).
  13. van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, 335-340 (2000).
  14. Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).
  15. Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).
  16. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics