Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Published 9/02/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Этот метод позволяет характеристика расширенных бактериальные культуры совместно с EpiAirways, первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей, выращенных при воздушно-жидкостной интерфейс, биологически значимых

Cite this Article

Copy Citation

Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) являются человеческими адаптированных грамотрицательные бактерии, способные вызвать рецидивирующих и хронических инфекций дыхательных слизистой оболочки 1, 2. Для изучения механизмов, посредством которых эти организмы выживают и внутри дыхательной ткани, модели, в которой успешное долгосрочное сотрудничество-культуры бактерий и клеток человека могут быть выполнены не требуется. Мы используем первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей поднял в воздух-жидкость, модель EpiAirway (Маттек, Ashland, MA). Это без увековечено, хорошо дифференцированные, 3-мерный тканей, содержащих плотные соединения, мерцательного и nonciliated клеток, бокаловидных клеток, которые производят муцина и сохраняют способность вырабатывать цитокины в ответ на инфекцию.

Это биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей могут быть использованы в ряде способами; Общая цель этого метода заключается в проведении долгосрочных со-культуры EpiAirway тканей с NTHi и количественного клеточно-ассоциированных бактерий и внутренним течением времени . Кроме того, муцин производства и цитокинового профиля зараженного со-культур может быть определена. Такой подход улучшает существующие методы в том, что многие современные протоколы используют погруженные монослоя или Transwell культурах человеческих клеток, которые не способны поддерживать бактериальных инфекций в течение длительного периода 3. Например, если организм может размножаться в вышележащих средства массовой информации, это может привести к недопустимым уровням цитотоксичность и потери клеток хозяина, арестовав эксперимента. EpiAirway модель позволяет характеристику долгосрочного хозяин-патоген взаимодействий. Далее, поскольку источником EpiAirway является нормальной человеческой трахеобронхиального клеток, а не увековечена линия, каждый из них отличное представление реальной человеческой ткани верхних дыхательных путей, как в структуре и функции 4.

Для этого метода EpiAirway ткани отлучить от антимикробных и противогрибковых соединений в течение 2 дней до родов, и все процедуры проводятся под антибиотикам свободных условиях. Это требует специального рассмотрения, так как бактерии и первичных человеческих тканей, используемых в одном шкафу биобезопасности, и совместно культивировали в течение длительного периода времени.

Protocol

1. Подготовка кабинета биобезопасности EpiAirway тканей

  1. Ношение посвященный халате, с волосами, связанными назад и перчатки, начните ламинарного потока. Через 5 минут, перемещать любые инструменты в шкафу (пипетки, советы, центрифужные пробирки и т.д.) в одну сторону, спрей интерьера кабинета биобезопасности и створки с 70% этанола и протрите чистой салфеткой. Спрей очищены интерьера снова с 70% этанола и оставляют для просушки. Перемещение средств для чистой стороны и повторите процедуру этанола.
  2. Использование аэрозолей барьер наконечники пипеток и посвятил в шкафу. Чтобы использовать индивидуально обернутые стерильной серологических пипеток, проходят подключен конец через ламинарный поток, взломать, и слайд-пипетки в кабинет, отбрасывая упаковку снаружи.
  3. EpiAirway вставки должны быть обработаны с стерильных щипцов. Место 6-дюймовый тонкий кончик изогнутой рассекает щипцов в самоуплотняющихся стерилизации сумки и автоклав. Подготовка достаточно иметь по крайней мере шесть в день готов к использованию.

2. Распаковка EpiAirway тканей

  1. Спрей рабочей поверхности в биобезопасности шкаф с 70% этанола и протрите чистой салфеткой. Спрей снова и дайте поверхности высохнуть перед использованием. Открытое EpiAirway окно и выбросьте пенополистирола и упаковочный материал.
  2. EpiAirway антибиотикам бесплатное техническое обслуживание средств массовой информации, AIR-100-MM ABF (ММ), является собственностью Маттек и отправляется в комплекте с вставками. В биобезопасности кабинета, этикетка шесть стерильные 50 мл пробирок с центрифугой типа носителя и дату, и ослабьте крышки. Спрей бутылку средства массовой информации с 70% этанола и открытых внутри шкафа. Алиготе 25 мл М.М. в каждую пробирку с использованием нового стерильного серологические пипетки для каждой трубки, затяните шапки, и хранить при температуре 4 ° C. Использование свежей аликвоты ММ каждый день.
  3. Повторите 2,2 выше, с использованием свежих бутылку 1 X Дульбеко фосфатным буферным раствором (D-PBS) с кальцием и магнием. Повторите еще раз, используя D-ФСБ без кальция и магния. Храните все аликвот при 4 ° C.
  4. EpiAirway вставками AIR-100 прибудет в 24-луночного планшета при 4 ° С на твердых средах содержащих агарозы, и должны быть помещены в 6-луночных планшетах для использования. На каждом плита с датой и описание использования этанола устойчивых к маркеру. Поместите 1 миллилитр 4 ° C EpiAirway ММ в каждую лунку. Удалить транспорта пластину из упаковки, спрей с 70% этанола, и место в шкафу биобезопасности. Удалите ленту и откройте пластину. Использование автоклавного щипцы, удалите влажной марлей над EpiAirway вставками.
  5. Возьмите вкладыш с использованием щипцов автоклавного вращательным движением, чтобы помочь в освобождении его от агарозы, и поместить в хорошо из 6-луночный планшет. Некоторые агарозы может присоединиться к вставке, в частности, так как температура транспорта пластины увеличивается до температуры окружающей среды. Использование стерильной ватной палочкой, чтобы тщательно удалить из агарозы вставки. Не прикасайтесь к мембране, и убедитесь, что нет пузырьков воздуха под вставками. Место пластинки в увлажненных 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
  6. Позвольте по крайней мере 24 часов для тканей, чтобы уравновесить в инкубаторе перед началом совместного культур.

3. Поддержание EpiAirway тканей

  1. Использование автоклавного щипцы, забрать вставки и слегка пипетки 200 мкл подогретого D-PBS с кальцием и магнием на ткани и рок-вставки. Tilt вставки под углом, и разместить стерильной кончика пипетки P1000 с пластиковым кольцом, который содержит мембрану в нижней части вставки. Не прикасайтесь к ткани. Аспирируйте D-PBS промыть и поместить в стерильный помечены криопробирку. Образцы могут быть заморожены при температуре -20 ° С и анализировали на муцин и / или экспрессию цитокинов на более поздний срок.
  2. Изменение базальной ММ ежедневно аспирационных и замене с 1 мл свежей ММ. Используйте новый наконечник пипетки барьер для каждой скважины. Лечить использовать средства массовой информации с 10% отбеливателя в ночное время и выбросить.

4. Прививка EpiAirway тканей

  1. Подряд из свежих культуры nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) из замороженных фондовом глицерина на шоколадный агар. Вырасти на ночь в увлажненной 5% СО 2 инкубатора.
  2. На следующий день, ресуспендируют одной колонии в NTHi подогретого D-PBS с кальцием и магнием, чтобы OD (600 нм) примерно 0,7. Vortex энергично перед измерением оптической плотности. Отношение оптической плотности в колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл) NTHi в том, что О. Д. (600 нм) 0,2 примерно равно 1,0 х 10 8 КОЕ / мл. Таким образом, О. Д. (600 нм) 0,7 составляет около 3,5 · 10 8 КОЕ / мл. Этот алгоритм должен быть утвержден для каждого штамма NTHi перед посевом.
  3. EpiAirway тканей AIR-100 выращивают на пластины с площадью поверхности 0,6 см 2 и 0,4 микрона мембраны. Ткани состоят из ~ 8,0 х 10 5 до ~ 1,0 х 10 6 </ SUP> клеток. Таким образом, прививки от 1,0 х 10 7 КОЕ соответствует множественность заражения около 10 - 12. Чтобы привить, промойте каждую EpiAirway вставить как в 3.1, а затем добавить 28 мкл бактериальной суспензии, приготовленной в 4,2 до апикальной поверхности каждого EpiAirway вставить в кабинете биобезопасности. Не прививать базальной ММ. Вернуться к каждой пластине инкубатора.

5. Количественная оценка NTHi посевной

  1. Подготовка фосфатным буферным раствором (PBS), решение с 0,1% желатина (PBS-G), автоклав для стерилизации. Этикетка стерильный 1,5 мл Eppendorf труб с желаемой 1:10 разведения на основе OD (600 нм) и посевной аликвоту 900 мкл стерильной PBS-G в каждую пробирку.
  2. Определить количество шоколада агаром необходимо перечислить прививку NTHi. Место этих пластин в воздухе инкубатора с ног на голову с нижней части пластины опираясь на половину верхней течение одного часа. Это позволит пластины как теплая до 37 ° С и поверхности высохнуть, облегчая раскрывающемся обшивки NTHi.
  3. Начало серийных разведений 1:10 посевной путем добавления 100 мкл бактериальной суспензии с 4,2 до первой трубы. Vortex каждого разведения энергично в течение 5 секунд до внесения следующего. Оставьте 10 мкл аликвот на подогретого и поверхностных высушенные пластины шоколадный агар, используя половину пластины для каждого разведения. Пять-шесть аликвоты 10 мкл может поместиться на одной половине каждого 100 мм пластины, не запуская вместе. При сухой, место с ног на голову в увлажненной 37 ° C CO 2 инкубаторе на ночь.
  4. На следующий день, определить КОЕ / мл, считая разведения, которые имеют 15-30 различных колоний в каждой капле и расчета на ваш фактический жизнеспособной инокулятом NTHi.

6. Долгосрочное сотрудничество культуры с NTHi

  1. Каждые 24 часа, мыть вставки, как в 3.1, то бассейн стирок каждой ткани, которая была сделана прививка с тем же штаммом бактерии и замерзает при -20 ° С в меченых криопробирку для последующего анализа. Эти образцы могут быть исследованы на наличие муцин от точки или пятна на выражение цитокинов ELISA Кроме того, ткани могут быть собраны для мРНК и КПЦР может быть выполнена на гены интерес. Изменение базальной ММ ежедневно, как в п. 3.2. Продолжить в течение всего срока совместной культуры.

7. Заготовка EpiAirway тканей

  1. Подготовка свежей 1% раствора сапонина в D-ФСБ без кальция и магния, фильтр-стерилизовать и теплой до 37 ° C.
  2. Теплая 50 мл трубки ММ и другой Д-ФСБ без кальция и магния до 37 ° C.
  3. Подготовка разведения труб, как в 5.1, а также один пустой стерильный 1,5 мл Eppendorf туба на вставке, помечены числа вставки и NTHi напряжения.
  4. EpiAirways могут быть собраны как для общего клеточно-ассоциированных бактерий, которые включает в себя как приверженца и внутреннюю организмов, или по внутренним бактерий только.
  5. Определить количество пластин шоколадный агар необходимо отказаться от пластины клеточно-ассоциированных или атаке NTHi, этикетки и сухой в течение одного часа в воздухе, как в инкубаторе 5.2.
  6. Для уборки общего клеточно-ассоциированных бактерий, промыть апикальной поверхности EpiAirways три раза с 200 мкл D-ФСБ без кальция или магния, то наклон вставки и промыть все оставшиеся мм от базальной мембраны. Первой стирки можно заморозить для последующего анализа; отказаться от следующих стирок.
  7. Место мыть вставить в свежий 6-луночный планшет без М.М., и пипетка 250 мкл стерильной 1% сапонина решение с 7,1 на апикальной поверхности каждой ткани. Вернуться в инкубаторе в течение 10 минут.
  8. Удалить из инкубатора, и с помощью стерильной пипетки P1000, скраб ткани от мембраны использованием возвратно-поступательное движение, а затем круговыми движениями, чтобы удалить ткань от краев вставки. Использование большого диаметра стерильным наконечником пипетки P1000, места подвески в пустые трубки помечены подготовлен в 7,3. Добавьте 250 мкл D-ФСБ без кальция или магния на апикальной поверхности вставки.
  9. Изучить вставки диска с помощью перевернутого фазово-контрастным микроскопом, чтобы определить, есть ли оставшиеся ткани, которая будет собрана. Если необходимо, скраб снова с другим стерильным P1000 пипетки, затем добавить эту суспензию в пробирку с 7,8 использованием большого диаметра стерильным наконечником пипетки P1000. Довести общий объем трубки до 1 миллилитр использованием D-ФСБ без кальция или магния.
  10. Энергично вихрь клеточной суспензии на максимальной скорости в течение одной минуты. Используя стерильный шприц 1 мл оснащены 26 иглы, аспирация суспензии в шприц через иглу. Медленно проходит суспензии через иглу в 3 раза, следя за тем, чтобы не создавать пузыри. Vortex энергично снова в течение одной минуты.
  11. Использование большого диаметра пипетки, место 100 мкл суспензии в первую трубу разбавления подготовлен в 7.3. Vortex энергично в течение пяти секунд, а затем сделать серийный 1:10 разведений. Drop-пластина желаемого разведения на поверхность высушенного пластин шоколадный агар.
  12. Для уборки внутренним бактерий только, мыть каждой вставки в 3 раза с 200 мкл D-ФСБ без кальция или магния. Сохраняйте и заморозить первой стирки. Добавить гентамицин сульфата подогретого ММ до конечной концентрации 100 мкг / мл. Подготовка 1,5 мл среды на вставке быть собраны. Замените базальной ММ с гентамицином содержащих М.М., и добавьте 300 мкл гентамицин содержащих ММ на апикальной поверхности. Место пластины обратно в CO 2 инкубаторе в течение одного часа.
  13. Удалить гентамицин содержащих мм от апикальной поверхности и мыть апикальной поверхности и базальной мембраны вставить экстенсивно с подогретого D-ФСБ без кальция и магния. Выполните в 7.7-7.11.

8. Представитель результаты:

Сканирующей электронной микрофотографии (А.) неинфицированных тканей EpiAirway и (б) ткани после 5-дневной совместной культуре с NTHi показаны на рисунке 1. Долгосрочное сотрудничество культуры с NTHi не привести к значительному повреждению апикальной тканей, что подчеркивает полезность EpiAirway модели. График, иллюстрирующий количество интернализованных бактерии количественно с течением времени внутри тканей показано на рисунке 2. Оба результата достаточно воспроизводимым, делая EpiAirway тканей последовательной и биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей, в котором для изучения NTHi хозяин-патоген взаимодействий.

Рисунок 1
Рисунок 1. Сканирующей электронной микроскопии EpiAirway тканей. А. неинфицированных тканей контроля. Б. тканей после пяти дней со-культуры с NTHi. Нет значительного ущерба апикальной поверхности наблюдается в пораженных тканях.

Рисунок 2
Рисунок 2. Количество NTHi внутренним течением времени во время EpiAirway совместно культуры. Штамм R2866 инокулировали примерно 1,0 х 10 7 КОЕ / вставки (день 0), затем собирают на внутреннюю бактерий на каждой указанной точке времени. Столбики показывают п = 3 повторяет по крайней мере в двух экземплярах. Ошибка бары SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот метод позволяет исследовать долгосрочные хозяин-патоген взаимодействий в биологически значимых фоне первичных человеческих тканей дыхательной на воздух-жидкость. Здесь мы использовали NTHi как заражение организма, но взаимодействие любых бактерия, которая не вносит неприемлемые цитотоксичности с течением времени может быть определена количественно с помощью этого метода. EpiAirway модель также может быть использован для изучения вирусов, наркотиков или химических веществ, которые влияют на человека верхних дыхательных путей, 5, 6, 7, 8. Мы сохранили неинфицированных тканей для более чем 40 дней, и ткани инфицированных NTHi, по крайней мере 10 дней. Мы ожидаем, что инфицированные ткани могут сохраняться значительно дольше, если это необходимо.

Ограничения этого метода аналогична любой модели в пробирке, в том числе неспособность восстановить иммунную систему компетентных в этих тканях. Хотя ежедневно моет тканей выполняются для имитации нормального мукоцилиарного клиренса, создание естественный выход для муцин производится в этих тканях был бы более желательным 9. Кроме того, контакт с NTHi, как известно, вызывают муцина выражение в человеческих клетках эпителия дыхательных, усугубляя проблемы 10. С другой стороны, ежедневно моет EpiAirway могут быть сохранены и анализировали на белки или ферментативной деятельности, представляющей интерес, добавив, одним из важных аспектов метода и повышения ее полезности.

Один ключевой шаг в успешное выступление этого метода является механическое разрушение тканей до раскрывающемся покрытие NTHi (шаг 7,10). Потому что EpiAirways очень дифференцирована и состоит из нескольких типов клеток, тканей не так легко распадаются, как клеточный монослой, даже после того, сапонины лечения. Кроме того, NTHi, как известно, чувствительны к соединениям, которые помогают в дезагрегации тканей. Таким образом, мы обнаружили, что проходящие клеточной суспензии через 26 иглы значительно улучшает нашу способность генерировать последовательное и повторяемые количественное внутренним или клеточно-ассоциированных бактерий.

Как только эта технология освоена, она также может быть использован для исследования относительной способности мутантных штаммов бактерий, чтобы выжить по сравнению с их дикого типа родителей, позволяя следователю, чтобы охарактеризовать влияние конкретных генетических мутаций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Патрика Хэйден (Маттек) за полезные обсуждения, и Роберт Смит и Либби Перри Грузии медицинских наук университета за их навыки EM. Это исследование было профинансировано NIDCD грант DC010187 в DAD

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza Inc. 17-513Q
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza Inc. 17-515Q
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek Corp. AIR-100-ABF
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek Corp. AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD Millipore 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR international 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR international 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR international 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR international 82027-406
Self-sealing sterilization pouches VWR international 89140-802
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza Inc. 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
  2. Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
  3. Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
  4. Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
  5. Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
  6. Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
  7. Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
  8. Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
  9. Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
  10. Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats